全 文 ：园 艺 学 报 , 一
扭 月 叹 门
金冠苹果成熟胚离体诱导四倍体的研究
李林光 ,
,
,
, 何 平 , ,
沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳
欧春青 李慧峰 ,
, 张志宏 ”
山东省果树研究所 , 山东泰安 以 〕
摘 要 以 自然授粉的 ‘ 金冠 ’ 苹果种子为材料 , 研究了秋水仙素处理成熟胚离体诱导四倍体技术和
嵌合体分离方法 。 结果表明 将完整胚在 秋水仙素 二甲基亚矾的混合溶液中暗处理 , 然后
接种在 一
· 一 ’ · 一 ’ 蔗糖
· 一 ‘ 琼脂
· 一 ’的再生培养基中 , 变异
率高达 。 与二倍体相比 , 四倍体试管苗生长缓慢 , 节间变短 , 叶片增大 , 叶形指数趋小化 , 气孔密
度降低 , 保卫细胞增大 。 经压片法鉴定茎尖染色体数和流式细胞仪分析 含量 , 表明多数变异植株为同
质四倍体 。 利用叶片离体再生器官技术 , 从诱导获得的嵌合体植株中分离出同质突变体 。
关键词 苹果 秋水仙素 离体诱导 多倍体 四倍体 嵌合体分离 多倍体育种
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 习
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目前栽培苹果品种以二倍体为主 , 也有少数多倍体 。 多倍体果树一般具有生长健壮 , 枝粗 , 叶
厚 , 果大 , 少籽或无籽 , 产量高 , 适应性强等优点 , 因此多倍体育种一直是果树育种的一条重要途
径 。
获得多倍体的方法有多种 , 其中人工化学诱导多倍体具有周期短 , 见效快 , 省工省力等突出优点
而成为许多育种者的首选 沈德绪 , 。 至今已在梨
、 杏 、 桃 、 栗 、 树葛 、 醋栗 、 苹果 、 香蕉 、
收稿 日期 一 一 仇 修回 日期 一 一
基金项目 国家科技支撑项 目 山东省农业良种工程项 目 山东省农业科学院高技术自主创新基金项 目
通讯作者 叩 一
园 艺 学 报 卷
葡萄
、
草毒
、
越橘
、
柑橘
、
菠萝
、
枣
、
称猴桃
、 核桃等果树上成功地诱导出多倍体植株 , 大大丰富了
果树种质资源 石荫坪和王强生 , 。
苹果的多倍体在 自然界中早已存在 , 但自然突变产生四倍体的频率很低 , 而且一般是嵌合状态 。
诱导获得同质四倍体对于通过四倍体与二倍体杂交培育苹果三倍体品种具有更为重要的意义 。
国内外有关苹果多倍体离体诱导的研究报道不多 。 王长泉等 用秋水仙素溶液处理 ‘ 嘎
拉 ’ 苹果的试管苗离体叶片 , 诱导获得了四倍体植株 。 刘庆忠等 以 ‘ 皇家嘎拉 ’ 苹果为试
材 , 通过在不定芽再生培养基中附加秋水仙素的方法诱导获得了四倍体植株 。 等 通过秋
水仙素诱导 ‘ 秀水 ’
、 ‘ 富士 ’
、 ‘ 国光 ’ 等苹果成熟胚 , 获得四倍体植株 。 但是前人均未对诱导出的
苹果嵌合体进行分离研究 。
本研究以 ‘ 金冠 ’ 苹果成熟胚为试材 , 将离体培养和秋水仙素诱导技术相结合 , 通过形态学观
察 , 染色体计数 , 流式细胞仪分析等方法对再生植株进行倍性鉴定 , 并通过叶片离体再生技术对嵌合
体进行分离 , 旨在探索苹果四倍体诱导方法及嵌合体分离技术 。
材料与方法
材料及处理
年 月 , 取 自然授粉的 ‘ 金冠 ’ 苹果成熟饱满种子为试材 。
将种子放在 三角瓶中 , 依次用 乙醇浸泡 , 浸泡 一 巧 , 无菌水
清洗 次 。 在无菌条件下剥去种皮 , 将完整胚在经抽滤灭菌的含 秋水仙素 二 甲基亚矾的
混合溶液中暗处理 或在 秋水仙素 十 二 甲基亚矾的混合溶液中处理 , 处理温度 ℃ ,
用无菌水处理作对照 。
处理结束后倒掉秋水仙素溶液 , 用无菌水将胚冲洗 次 。
植株再生
将秋水仙素处理后的苹果胚分别接种到以下再生培养基中 ① 十
· 一 ’
· 一 ’ · 一 ’ ②
· 一 ’ · 一 ‘ ③ 或
· 一 ’ , 在温度为 士 ℃的条件下培养 。
后将再生植株转移到 十
· 一 · 一 ’培养基上 。
培养基中均含有蔗糖
· 一 ‘ , 琼脂
· 一 ‘ 。
再生植株倍性鉴定和变异率分析
染色体数的观察 仁午 左右从再生植株上剪取 长的顶梢 , 用饱合对二氯苯水溶液在
℃下处理 一 , 在卡诺溶液中固定 一 后用 乙醇保存 。 将样品放在
· 一 ’ 中解
离 , 用蒸馏水洗净 , 取 大小的茎尖分生组织进行压片和染色 , 每个材料检测分散好的分
裂细胞 个 。
流式细胞分析 在美国 一 公司生产的 流式细胞仪上检测细胞核 相
对含量 。 以试管苗幼嫩茎叶为试材 , 具体操作参见 等 的方法 。 以二倍体 ‘ 金冠 ’ 试
管苗为对照 。 所有检测样品细胞核 含量是以对照为标准的相对值 。 每个样品重复两次 , 每次检
测至少收集 个细胞核 。 流式细胞分析工作在河北省农林科学院昌黎果树研究所进行 。
变异率分析 变异植株指成熟胚经处理后再生的染色体数发生变化的植株 , 包括同质四倍体和倍
性嵌合体 。 变异率 变异植株数 再生植株数 。
再生植株的形态鉴定
选取试管苗基部的第 一 片叶 , 测量叶长
、 叶宽 、 叶形指数 , 每个株系测量 片叶 , 求平均
值 。 每叶片随机选取 个位点 , 每个位点取 厅 大小的叶片 , 按照廖乾初和蓝芬兰 的
期 李林光等 金冠苹果成熟胚离体诱导四倍体的研究
方法进行预处理 , 然后用 日立 碑 扫描电镜观察叶片气孔密度和保卫细胞大小 。
嵌合体分离
从每个嵌合体植株取 片新叶 , 每个叶片剪出 一 处伤口 , 接种到
· 一 ’
· 一 ’ 蔗糖
· 一 ‘ 琼脂
· 一 ‘培养基上 。
结果与分析
苹果四倍体的离体诱导
秋水仙素对 ‘ 金冠 ’ 成熟胚的诱导效果因处理时间 、 处理浓度和再生培养基的不 同而异 表
, 其中成熟胚在 的秋水仙素溶液中浸泡 后接种在
· 一 ’ ·
一 ’培养基上的处理变异率最高 , 达 。 以 的秋水仙素溶液处理成熟胚 , 也可再生 出变
异植株 , 但频率较低 。
变异株主要来源于胚芽梢 , 也有少量是由子叶再生得到的 。
对照用无菌水处理的胚 , 虽再生植株很多 , 但没有变异植株 。
表 秋水仙素浓度 、 处理时间和再生培养基对 ‘ 金冠 ’ 成熟胚诱导多倍体的影响
曲 价 加 枷 , 曲
‘ ’
秋水仙素浓度 处理时间
恤 培养基
处理胚数
〕
再生植株数
朋
变异植株数 变异率 变异植株来源
孚
胚芽梢 子叶
,︸内、︶勺‘,一件,,①②③对照
再生植株倍性鉴定
再生植株染色体数观察 茎尖染色体数鉴定结果表明 对照植株染色体数是 图版 ,
, 变异植株染色体数为 图版 , 。 苹果染色体组中染色体数为 二 , 因此变异植株是
四倍体 。
变异植株细胞核 相对含量分析 用二倍体的 ‘ 金冠 ’ 试管苗进行流式细胞仪的校准 ,
确定其 期峰值的位置 , 依此对待检样品进行倍性分析 , 所有样品依据其 期峰值的相对位置来
判断其倍性 。
图 中每个通道的细胞核数反映了相对荧光强度 , 单个的荧光峰代表了每个株系的细胞核
相对含量 , 其中 门是二倍体 期峰值的位置 , 门是三倍体 期峰值的位置 , 门是四倍体
期峰值的位置 。
流式细胞分析结果表明 个变异植株在 区有一个单峰 , 个变异株在 、 区均有峰值 图
。 说明本研究获得的 个变异植株中 , 个为同质四倍体 , 个为 一 嵌合体 。
园 艺 学 报 卷
图 细胞核相对 含
眨
苹果四倍体植株的形态 与二倍体试管苗 图版 , 、 相比 , 诱变获得的苹果四倍体试管
苗 图版 ,
、 植株生长缓慢 , 节间缩短 , 叶色浓绿 , 叶片大而圆 , 表现出多倍体显著特征 。 诱
变获得的苹果四倍体试管苗的叶长和叶宽均比对照二倍体植株大 , 且叶形指数显著小于二倍体植株
表 。
表 苹果二倍体与四倍体叶形指数和叶片气孔比较
血 加
倍性 叶长
比
叶宽
此
叶形指数 气孔密度 气孔保卫细胞
士
士
土
士
土
士
士
士
长 卜
士
士
宽 协
士
士
注 表中同列不同字母表示 水平上差异显著 。
邵
叶片气孔观察表明 与二倍体相比 , 诱变获
得的苹果 四倍体气孔保卫细胞增大 , 密度减小
图版 , 、 。
利用叶片离体再生植株进行苹果嵌合体的分离
对 株嵌合体植株进行叶片离体再生 , 共获
得 个再生植株 。
经染色体数目和流式细胞仪鉴定 , 个再生
植株是同质四倍体 , 其余 个再生植株均为二倍
体 表 。
表 苹果嵌合体叶片再生植株的倍性分离情况
城 山
嵌合体植株编号 再生植株数 罗
四倍体
一
一
并
二倍体
讨论
本研究是通过胚芽梢和子叶再生获得四倍体植株 , 与 等 通过去胚芽梢获得四倍体植
株的途径不同 。 在变异株的倍性鉴定上 , 本研究通过流式细胞 相对含量检测的方法准确地将变
异植株中的同质四倍体与嵌合体区分出来 。 形态观察是鉴定多倍体最简易快捷的方法 , 可用于对变异
植株的初步筛选 , 能大大减少工作量 。 多倍体植株的巨大性特征早已被许多研究多倍体的学者所证实
马国斌 等 , 谷晓峰和罗正荣 , , 染色体倍性与植株叶片气孔密度及保卫细胞大小存在
期 李林光等 金冠苹果成熟胚离体诱导四倍体的研究
相关性 。 , , 。 本研究得到的多倍体植株在试管苗阶段就表现叶片增大 , 叶色加
深 , 叶形指数趋小化 , 节间变短 , 叶片变圆 , 叶片气孔密度变大 , 植株变矮等多倍体特征 , 这对于诱
变植株的早期选择是非常有利的 。
嵌合体的产生是多倍体诱导过程中常见的问题 , 嵌合体的干扰也是困扰多倍体育种工作的一个大
难题 。 生产中多用短截控制发枝和剪口芽的位置使嵌合体长出新生枝条 , 利用无性繁殖得到同质突变
体 。 王娜等 利用组织连续切割分离的方法 , 将秋水仙素离体诱导的冬枣和酸枣嵌合体进行
继代分离 。 本研究利用流式细胞仪将嵌合体从变异植株中区分出来 , 利用叶片再生技术 , 成功地将四
倍体分离出来 , 提高嵌合体的分离效率 。
图版说明 四倍体染色体数 二倍体染色体数
倍体再生植株 四倍体叶片 二倍体叶片 。
却
四倍体叶片气孔密度 二倍体叶片气孔密度 四倍体再生植株 二
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谷晓峰 , 罗正荣 秋水仙素处理 ‘ 罗田甜柿 ’ 获得 倍体再生植株 园艺学报 , 一
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廖乾初 , 蓝芬兰 扫描电镜原理及应用技术 北京 冶金工业出版社
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刘庆忠 , 赵红军 , 刘 鹏 , , 秋水仙素处理离体叶片获得皇家嘎拉苹果四倍体植株 果
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马国斌 , 王 鸣 , 郑学勤 甜瓜组织培养再生植株中的四倍体变异 园艺学报 , 一
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沈德绪 果树育种学 第 版 北京 中国农业出版社 一
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王长泉 , 张文胜 , 李雅志 , 崔得才 苹果叶片离体培养中秋水仙素加倍效应的研究 果树科学 , 一
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