全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 371 - 376
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 09 - 30; 修回日期 : 2007 - 03 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30500303) ; 重庆市自然科学基金重点项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: Zhliao@ swu1edu1cn)
番茄 dxs基因的克隆及在大肠杆菌中的颜色互补
潘夕春 1 , 陈　敏 1 , 刘　颜 2 , 廖志华 13
(1 西南大学生命科学学院 , 三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 重庆市甘薯研究中心 , 重庆 400715; 2 重庆师范大
学化学学院 , 重庆 400047)
摘 　要 : 用 RT - PCR (反转录 -聚合酶链式反应 ) 的方法从番茄中克隆到 5 - 磷酸脱氧木酮糖合成酶
(Deoxyoxylulose252phosphate synthase, DXS) 基因编码区 (记为 ledxs) , 并构建了 ledxs原核表达载体 pTr2
cLeDXS。将携带番茄红素生物合成途径上香叶基香叶基焦磷酸合成酶 ( geranylgeranyl pyrophosphate syn2
thase, crtE) , 八氢番茄红素合成酶 (phytoene synthase, crtB ) , 八氢番茄红素脱饱和酶 ( phytoene desatu2
rase, crt I) 3个关键酶基因的原核表达载体 pAC2LYC转入大肠杆菌 XL12B lue。将 pTrcLeDXS转入该重组工
程菌 , 获得番茄红素工程菌。将该菌用于构建颜色互补平板 , 并进行发酵培养以检测番茄红素表达量。颜
色互补平板上的菌斑呈现鲜艳的红色。经过 21 h的培养番茄红素的产量达到 605125μg·L - 1。结果显示 :
ledxs能明显推动类胡萝卜素途径向番茄红素合成的方向流动。
关键词 : 番茄 ; 5 -磷酸脱氧木酮糖合成酶 ; 克隆 ; 番茄红素 ; 颜色互补 ; 发酵
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220371206
C lon ing of D eoxyoxylulose252phospha te Syn tha se Gene from Toma to and Its
Color Com plem en ta tion in E. coli
PAN Xi2chun1 , CHEN M in1 , L IU Yan2 , and L IAO Zhi2hua13
〔1 Key Labora tory of Eco2environm ents in Three Gorges Reservoir Region (M inistry of Educa tion) , Chongqing Sw eetpotato Research
Center, School of L ife Sciences, Southw est U niversity, Chongqing 400715, Ch ina; 2 College of Chem istry, Chongqing N orm al U ni2
versity, Chongqing 400047, Ch ina〕
Abstract: To investigate the function of tomato dxs gene and confirm it can facilitate the accumulation of
the downsteam metabolites, the coding sequence of dxs gene ( ledxs) was cloned from tomato by reverse2tran2
scrip tion polymerase chain reaction (RT2PCR ) , and constructed into the p rokaryotic exp ression vector pTr2
cLeDXS. The lycopene biosynthetic pathway in E. coli strain XL12B lue was reconstructed by transform ing with
pAC2LYC carrying the three key enzymes, crtE, crtB and crt I, in the lycopene pathway. This engineered
XL12B lue was transformed with pTrcLeDXS. Then the engineerd bacteria was used to construct the color com2
p lementation p late and detect the content of lycopene after been fermented. The engineered XL12B lue harbo2
ring pAC2LYC and pTrcLeDXS became red because of the p roduction of lycopene. And after 21 h cultivation,
the lycopene p roductivity reached 605125μg·L - 1. The results demonstrate that ledxs can facilitate the carot2
enoid pathway flow to lycopene biosynthesis, and p rove the function of ledxs by color comp lementation. The ly2
copene p roductivity of the engineered bacteria could meet the requirement of industrial p roduction and can be
used for fermentation to p roduce lycopene.
Key words: Tomato; DXS; Cloning; Lycopene; Color comp lementation; Fermentation
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
类萜物质是植物天然产物中最大的一类化合物 , 包括类胡萝卜素、青蒿素、紫杉醇、银杏内
酯和抗癌萜类吲哚生物碱 (L iao et al. , 2006)。DXP途径是一条类萜物质前体合成途径 , 存在于植
物 ( Schwarz, 1994) 和细菌 (Rohmer et al. , 1993) 中 , 提供萜类物质生物合成的基本骨架异戊烯
基焦磷酸 ( Isopentenyl diphosphate, IPP ) 和二甲基烯丙基焦磷酸 ( D imethylallyl diphosphate,
DMAPP)。
5 -磷酸脱氧木酮糖合成酶 (Deoxyoxylulose252phosphate synthase, DXS) 是该途径中第一个限速
酶 , 是萜类物质代谢工程的重要靶点 ( Estévez et al. , 2001)。
研究表明 , 在番茄果实成熟过程中 , DXS的表达量与类胡萝卜素的积累具有很高的一致性 , 当
DXS表达量很高时 , 类胡萝卜素的积聚也达到高峰 (Lois et al. , 2000)。
在大肠杆菌中重建青蒿素生物合成途径时 , 过量表达 DXS促进了青蒿素等萜类物质的积累
(Martin et al. , 2003) , 表明在大肠杆菌中过量表达 DXS可以推动代谢流往萜类合成的下游 , 有利于
目的产物的积累。
本研究基于以上背景 , 先在大肠杆菌中重建了番茄红素的生物合成途径 , 使该菌能在本底水平上
生产番茄红素 ; 再将来源于番茄的 dxs基因编码序列导入该菌 , 推动萜类代谢向番茄红素合成的方向
流动 , 使该菌能大量积聚番茄红素。与对照相比 , 重组后的菌体显示出番茄红素本身鲜艳的红色 , 首
次采用颜色互补的方法验证了番茄 dxs基因的功能。
1　材料与方法
111　番茄总 RNA的抽提
取生长约 15 d的番茄幼苗 (品种为 ‘合作 903’) 不同部位共 100 mg, 在液氮中迅速研磨成细
粉 , 植物组织 RNA抽提试剂盒抽提总 RNA; 10 g·L - 1琼脂糖甲醛变性凝胶电泳 ( Goldview染色 , 30
m in) 检测 RNA质量 ; 紫外分光光度法检测 RNA含量。
112　第一链 cD NA的合成
按照以下体系将提取的总 RNA反转录成第一链 cDNA: 1μg番茄总 RNA , 5 U的 AMV反转录
酶 , 1μL 10 mol·L - 1的通用引物 AP, 40 U的 RNase抑制剂 , 2μL 5倍反应缓冲液 , 最后加 DEPC
处理过的灭菌双蒸水补齐至总体系为 10μL。42℃反应 50 m in, 然后 94℃变性 2 m in使反转录酶失
活。
113　带酶切位点的 ledxs克隆
根据已经报道的番茄 dxs基因 cDNA全长 , 设计一对含酶切位点的番茄 dxs基因特异性引物 f2
DXS: 5 ′2CC GGTACCATGGCTTTGTGTGCTTATGC 23 ′; r 2DXS: 5 ′2CC GGATCC TTATGTCATGACCTCT
AGAGCC23′(下划线部分依次为酶切位点 B am H I、Kpn I)。
PCR反应条件 : 94℃预变性 5 m in, 94℃变性 45 s, 59℃退火 45 s, 72℃延伸 215 m in, 34个循
环 , 最后 72℃延伸 8 m in。
采用 8 g·L - 1琼脂糖凝胶进行电泳检测 , 目的条带用 PCR产物纯化试剂盒回收 , 按照 pMD182T
载体试剂盒方案将回收产物连接 T -载体 , 转化 DH5α感受态细胞后在 LB +Amp 100 mg·L - 1平板上
进行蓝白斑筛选。
挑取阳性菌斑进行 PCR检测后扩大培养 , 送测序验证。
114　pTrcL eD XS质粒的构建
将经过测序验证的阳性菌斑扩大培养。用质粒纯化试剂盒抽提质粒 , B am H I、 Kpn I双酶切 ,
回收小片段 (即切去两端保护碱基的 ledxs)。B am H I、Kpn I双酶切 pTrcA tIP I质粒 , PCR产物纯化
试剂盒回收大片段 (即载体骨架 )。按照 DNA L igation H igh试剂盒方案连接载体骨架和 ledxs。连接
273
　2期 潘夕春等 : 番茄 dxs基因的克隆及在大肠杆菌中的颜色互补 　
产物转化 DH5α感受态细胞 , 涂布在 LB + Amp 100 mg·L - 1平板上。在转化平板上挑取单菌落 ,
扩大培养后用质粒纯化试剂盒抽提质粒 , 进行 ledxs的 PCR 验证和质粒酶切检测后获得 pTr2
cLeDXS。
115　构建番茄红素工程菌和获得颜色互补平板
pAC2LYC质粒由 Cunningham的研究组惠赠。将 pAC2LYC质粒和 pTrcLeDXS质粒依次转入 XL12
BLUE中 , 在 LB +Amp 100 mg·L - 1 + Cm 50 mg·L - 1平板上筛选 , 获得携带双质粒的产番茄红素工
程菌。
对获得的工程菌进行 PCR验证。引物为 ledxs引物 f2DXS和 r2DXS, 氯霉素引物 F2Cm: 5′2GATT2
GGGTTCCTACTTCGATGA23′, R2Cm: 5′2TACCGAAAGCATAAATACTTAA23′, PCR 条件同上。同时对
pTrcLeDXS、pAC2LYC、普通 XL12B lue进行 PCR验证 , 作为对照。
Pst I单酶切 pTrcA tIP I质粒 , 切去 pTrcA tlp I质粒携带的 atp i编码序列 ; 酶切产物回收大片段后自
连 , 转化 DH5α感受态细胞 , 在 LB +Amp 100 mg·L - 1平板上筛选获得阳性菌斑。挑取阳性菌斑扩大
培养后抽提质粒 , 获得空对照质粒并命名为 pTrc。按照上述转化方法 , 分别将 pTrc + pAC2LYC、pTr2
cLeDXS导入 XL12BLUE菌株 , 获得对照菌株。
在平板上挑取 XL12B lue、XL12B lue + pTrcLeDXS、XL12B lue + pAC2LYC、XL12B lue + pTrc + pAC2
LYC、XL12B lue + pTrcLeDXS + pAC2LYC的单克隆菌斑 , 在双抗 LB平板 (Amp 100 mg·L - 1 , Cm 50
mg· L - 1 ) 上划线 , 28℃, 倒置暗培养 72 h, 获得颜色互补平板。
116　工程菌的发酵培养及番茄红素合成曲线的测定
由于大肠杆菌的培养最适温度往往与产物表达的最适温度并不一致 (M isawa et al. , 1998) , 参照
邹祥和廖志华 (2005) 的方法 , 将发酵方案调整为温度两步分段控制的培养策略。发酵前 9 h温度为
33℃, 以利于大肠杆菌的生长 ; 然后将温度降至 28℃, 以利于番茄红素的表达和积累。
将 7 L全自动发酵罐用于发酵培养工程菌 , 装液量为 5L LB培养基 (Amp 100 mg·L - 1 , Cm 50
mg·L - 1 ) ; 接入 250 mL经过 5 h振荡培养的产番茄红素工程菌菌液作为菌液种子 , 通气量为 4 L·
m in - 1 ; 发酵培养时间为 25 h, 先 33℃培养 9 h, 然后将温度调至 28℃继续培养至第 25小时 ; 从第 5
小时开始 , 每 4 h取 20 mL菌液测定一次番茄红素含量 (张连富 等 , 2001)。
2　结果与分析
211　ledxs的克隆结果及序列分析
番茄 dxs基因 cDNA 全长为 2 568 bp, 通过
NCB I获得该基因长度为 2 157 bp的开放性阅读框
(ORF) , 终止密码子为 TAA。
根据该序列信息并参照原核表达载体 pTr2
cA tIP I的酶切位点设计一对带酶切位点 (B am H
I、Kpn I) 粘性末端的引物 , 两条引物末端各加
两个保护碱基 C, 因此克隆得到的 ledxs实际长度
应为 2 176 bp。
从图 1可以看出 , PCR产物与预计的片段大
小一致 , 没有非特异性扩增条带。将目的条带回
收后连接 T - 载体 , 测序验证 , 根据引物序列从
测序结果中找到长度为 2 176 bp的目标序列 , 将该
图 1　带酶切位点的番茄 dxs基因编码区 ledxs的克隆
M. 核酸分子量标准λ2H indⅢ; ledxs. 2 176 bp的
番茄 dxs基因编码区。
F ig. 1　C lon ing of the cod ing sequence of ledxs gene
w ith restr ictive sites
M. DNA makerλ2H indⅢ; ledxs. The ORF of tomato
dxs gene of 2 176 bp length.
373
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
序列在 NCB I中与番茄 dxs基因 ORF进行 B last比对 , 显示克隆得到的目的片段与番茄 dxs基因 ORF
序列完全一致。
克隆得到 ledxs序列和其编码的氨基酸序列 (图 2) , 该序列包含 2 157 bp的 dxs基因 ORF, 编码
含有 719个氨基酸残基的蛋白。进行该蛋白的序列特征分析 , 显示其预测分子量为 7716 kD, 等电点
预测为 6132。
图 2　ledxs的 cD NA序列及其编码的氨基酸序列
终止密码子用 3 表示。
F ig. 2　The cD NA sequence and the deduced am ino ac id sequence of ledxs
The stop codon was marked with 3 .
212　构建的 pTrcL eD XS质粒
将从 T - 载体上切下的 ledxs与从 pTrcA tIP I上切下的原核表达载体骨架相连 , 获得 ledxs原核表
达载体 pTrcLeDXS。该重组载体在携带的原核表达强启动子 Trc驱动下 , 可用于在大肠杆菌中高效
表达 ledxs。
213　番茄红素工程菌和颜色互补平板
pAC2LYC导入大肠杆菌菌株 XL12B lue后 , 可以在本底水平上表达番茄红素。当把 pTrcLeDXS导
473
　2期 潘夕春等 : 番茄 dxs基因的克隆及在大肠杆菌中的颜色互补 　
入上述重组菌后 , 由于突破了上游途径的代谢瓶
颈 , 推动代谢流向番茄红素合成的方向流动 , 使
该菌能大量积聚番茄红素。
PCR检测该菌 ledxs及氯霉素抗性基因均为阳
性 (图 3) , 表明 pTrcLeDXS和 pAC2LYC均已转
入该菌中。
在构建的颜色互补平板 (图 4) 上 , 作为对
照 的 XL12B lue 空 菌、 XL12B lue + pTrcLeDXS、
XL12B lue + pAC2LYC 都不能生长 ; XL12B lue +
pTrc + pAC2LYC未携带 ledxs, 不能过量表达番茄
红素 , 所以菌落仍呈现 XL12B lue本身的淡黄色 ;
只有 XL12B lue + pTrcLeDXS + pAC2LYC由于能大
量表达番茄红素 , 经过 72 h的培养后 , 菌落呈现
番茄红素特有的红色。
图 3　番茄红素工程菌的 PCR检测
T1. 普通 XL12Blue, T2. pTrcLeDXS质粒 , T3. pAC2LYC质粒 ,
T4. 番茄红素工程菌 ; M1. λ2H indⅢ, M2. DL 2000。
F ig. 3　PCR ana lysis of the eng ineered bacter ia of lycopene
T1. Untransformed XL12B lue; T2. pTrcLeDXS;
T3. pAC2LYC; T4. The engineered bacteria of lycopene;
M1. λ2H indⅢ; M2. DL 2000.
图 4　颜色互补平板
F ig. 4　Color com plem en ta tion pla te
214　工程菌番茄红素的产量
经过 21 h的培养 , 番茄红素产量达到最高
605125μg·L - 1 (图 5) , 之后才随着菌体的死
亡而逐渐下降。该菌的番茄红素产量能够达到
大规模发酵生产的需求 , 可以用于工业发酵生
产。
3　讨论
迄今为止未见到利用颜色互补的方法在大肠
杆菌中验证番茄 dxs基因功能的报道。
在拟南芥中的研究曾表明 , 过量表达了 dxs
基因的转基因单株 , 其萜类物质包括叶绿素、维
图 5　采用温度两步分段控制策略的发酵曲线
F ig. 5　The ferm en ta tion curve carr ied out by using
the two2stage tem pera ture con trol stra tegy
573
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
生素 E、类胡萝卜素、脱落酸和赤霉素的表达量都得到了提高 ; 而在 dxs基因表达受到抑制的单株
中 , 这些萜类物质的含量都降低 ( Estévez et al. , 2001)。这一研究结果表明 DXS确实是萜类物质合
成的一个关键酶 , 其表达量的高低与下游萜类物质表达量呈正相关。
而在长春花中过量表达 dxs基因 , 转基因植株中萜类吲哚生物碱的含量也获得了提高 ( Peacock
et al. , 2005) , 这一结果印证了在拟南芥中的研究结果。
上述在植物中 dxs基因功能的研究与我们在大肠杆菌中对 ledxs的功能验证结果一致 , 都证明了
dxs基因是萜类包括番茄红素生物合成的关键酶和限速步骤 , 是番茄红素代谢工程研究的必选靶点基
因。
番茄红素是目前最畅销的天然抗氧化剂之一 , 其抗氧化能力分别是维生素 E的 100多倍 , β - 胡
萝卜素的 3倍 ( Gerster, 1997)。
目前番茄红素主要依靠从番茄果实中提取 , 产量较低 , 远远不能满足市场需求。
本试验得到的番茄红素工程菌在小型全自动发酵罐中进行发酵 , 番茄红素产量达到 605125μg·
L - 1 , 达到了工业生产的要求 , 可替代番茄果实 , 做为产番茄红素的新型生物反应器。
本试验采用的温度两步分段控制策略兼顾了菌体的生长和番茄红素的积累 , 已经在 7 L发酵罐中
证明了这种发酵工艺的可行性 , 可实现周期短、产量高、成本低的大规模工业发酵生产 , 获得大量番
茄红素。
References
Estévez J M, Cantero A, Reindl A, Reichler S, León P. 2001. 12deoxy2D2xylulose252phosphate synthase, a lim iting enzyme for p lastidic isop re2
noid biosynthesis in p lants. Journal of B iological Chem istry, 276: 22901 - 22909.
Gerster H. 1997. The potential role of lycopene for human health. Journal of American College Nutrition, 16: 109 - 126.
L iao Z H, Chen M, Gong Y F, M iao Z Q, Sun X F, Tang K X. 2006. Isop renoid biosynthesis in p lants: pathways, genes, regulation and meta2
bolic engineering. Journal of B iological Sciences, 6: 209 - 219.
Lois L M, Rodriguez2Concepcion M, Gallego F, CamposN, Boronat A. 2000. Carotenoid biosynthesis during tomato fruit development: regulatory
role of 12deoxy2D2xylulose 52phosphate synthase. The Plant Journal, 22: 503 - 513.
Martin V J J, Pitera D J, W ithers S T, Newman J D, Keasling J D. 2003. Engineering a mevalonate pathway in Escherich ia coli for p roduction of
terpenoids. Nature B iotechnology, 21: 796 - 802.
M isawa N, H iroshi Shimada. 1998. Metabolic engineering of p roduction of carotenoids in non2carotenogenic bacteria and yeast. Journal of B iotech2
nology, 59: 169 - 181.
Peacock R W S, Peebles C A M, Gibson S. 2005. Metabolic engineering of the terpenoid indole alkaloid pathways in Catharanthus roseus hairy
roots: Overexp ression of the terpenoid branch genes for geraniol 102hydroxylase and 12deoxy2D2xylulose 52phosphate synthase. Abstracts of Pa2
pers of the American Chem ical Society, 229: 222 - 280.
RohmerM, KnaniM, Simonin P, SutterB, Sahm H. 1993. Isop renoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the early step s leading to iso2
pentenyl diphosphate. B iochem ical Journal, 295: 517 - 524.
SchwarzM K. 1994. Terpen2B iosynthese in Ginkgo biloba: eine überraschende Geschichte [ Ph. D. D issertation ]. N r 10951, ETH, Zürich,
Switzerland.
Zhang L ian2fu, D ing Xiao2lin. 2001. Establishment of a new lycopene determ ination method. Food and Fermentation Industries, 27 (3) : 51 -
55. ( in Chinese)
张连富 , 丁霄霖. 2001. 番茄红素简便测定方法的建立. 食品与发酵工业 , 27 (3) : 51 - 55.
Zou Xiang, L iao Zhi2hua. 2005. Effect of temperature on lycopene p roduction by recombinant E. coli and control strategy. M icrobiology, 32
(5) : 19 - 23. ( in Chinese)
邹　祥 , 廖志华. 2005. 温度对重组大肠杆菌产番茄红素的影响及控制策略. 微生物学通报 , 32 (5) : 19 - 23.
673