全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 101～104
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 09; 修回日期 : 2004 - 05 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30170648)3 通讯作者 A thor for correspondence ( E2mail: shlzhang@ zju1edu1cn)
‘丰香 ’草莓叶片高效再生体系的建立
秦永华 1 　张上隆 13 　徐　凯 1, 2 　吴延军 1 　秦巧平 1
(1 浙江大学园艺系 , 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 , 杭州 310029; 2 安徽农业大学园艺系 , 合
肥 230036)
摘 　要 : 以草莓主栽品种丰香 ( F ragaria ×ananassa Duch‘Toyonoka’) 叶片为外植体 , 研究了影响组
织培养的多个因素 , 建立了高效再生体系。结果表明 : MS + TDZ 115 mg·L - 1 + IBA 014 mg·L - 1培养基最
适于不定芽分化。不同滤光膜 (绿膜、红膜、蓝膜、黄膜 ) 对草莓不定芽的分化具显著效应 , 绿膜和红膜
对芽的分化有明显促进作用 , 不定芽再生率达 95%以上 , 平均每个外植体再生芽数在 25个以上 ; 而蓝膜
和黄膜则不利于芽的分化。不同滤光膜光谱差异主要集中在 300～700 nm, 红、绿膜在该波段光强较弱 ,
而黄、蓝膜和荧光灯较强。暗处理 4周比 1、2、3周更有利于提高叶片的不定芽再生率 , 此后转到光下培
养 , 获得的不定芽再生率可达 100%。
关键词 : 草莓 ; 滤光膜 ; 不定芽再生 ; 暗处理
中图分类号 : S 66814　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120101204
A H ighly Eff ic ien t System Establishm en t of Shoot Regenera tion from L eaf
Explan ts of Strawberry
Q in Yonghua1 , Zhang Shanglong13 , Xu Kai1, 2 , W u Yanjun1 , and Q in Q iaop ing1
( 1D epartm en t of Horticulture, Zhejiang U niversity, The M in istry of A gricultural L aboratory of Horticu ltura l P lant Grow th,
D evelopm ent and B iotechnology, Hangzhou 310029, Ch ina; 2D epartm ent of Horticulture, A nhui A gricultural U niversity, Hefei
230036, China)
Abstract: An efficient and reliable method for shoot regeneration from leaf disks of strawberry ( Fragaria
ananassa Duch‘Toyonoka’) was established. The op timum medium for shoot regeneration was MS supp le2
mented with thidiazuron ( TDZ) 115 mg·L - 1 and Indole232butyric acid ( IBA ) 014 mg·L - 1. D ifferent
color film s had great effect on the shoot regeneration of strawberry. The p resence of red and green film s in2
duced the maximum percentage of shoot regeneration ( > 95% ) and the highest number of buds per exp lant
( > 25). However, the blue and yellow film s inhibited the shoot regeneration of strawberry. The difference of
film s spectrum was focused on 300 - 700 nm. The light intensity of red and green film s was weaker than
yellow, blue and white ones. Dark treatment could effectively p romote shoot regeneration rate. In contrast,
maximum percentage of shoot regeneration (100% ) and the highest number of buds per exp lant (9105) were
observed with dark treatment of four weeks.
Key words: Strawberry; Color p lastic film s; System of regeneration; Dark treatment
1　目的、材料与方法
本研究以草莓 ‘丰香 ’ ( F ragaria ×ananassa Duch‘Toyonoka’) 叶片为试材 , 在筛选最适培养基
的基础上 , 研究了不同滤光膜和暗处理对不定芽分化的影响 , 目的是在最短的时间里建立起高效、稳
定的草莓离体再生体系 , 为今后深入开展遗传转化及无性系变异的筛选提供理论技术依据。
取 20～30 d叶龄的组培苗 , 弃去叶缘和叶尖 , 切成 012 cm ×012 cm小块接种于不同分化培养基
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
中筛选最适分化培养基 , 在此基础上研究不同滤光膜和暗处理对不定芽分化的影响。每个处理重复 5
次 , 每皿接 15个外植体。
再生培养基以 MS为基本培养基 , 蔗糖 30 g·L - 1和琼脂 710 g·L - 1 , 附加不同组合的植物生长
调节剂 , pH 518, 121℃灭菌 20 m in, 然后分装到直径 9 cm的无菌培养皿中 , 每皿 20 mL。接种后将
培养皿置于不同条件下培养 , 每两周继代 1次。培养室条件为 : 温度 (25 ±2) ℃, 光照强度 2000 lx,
光照时间 15 h /d。将接种在培养皿中的外植体置于黄、蓝、红、绿 4种滤光膜 (上海伟康有色薄膜
厂 ) 下培养 , 以荧光灯下培养为对照。用便携式分光光谱辐射仪 L I21800 (L I2COR, USA ) 测定不同
滤光膜透射光光谱辐射能 , 测定波段为 300～1100 nm, 扫描波长间隔为 2 nm, 输出的透射光光谱辐
射能为量化后的值。将外植体正面接触培养基接种在最适分化培养基上暗处培养 , 每隔一周取出 5皿
于光下培养 , 以荧光灯下培养为对照。培养 45 d, 统计每个处理再生不定芽的外植体数、每个外植体
再生的芽数和生根株数 , 计算不定芽再生率、每个外植体平均再生芽数和生根率。
2　结果与分析
211　不同植物生长调节剂组合对不定芽分化的影响
MS培养基中附加不同浓度的 TDZ、 IBA 和
2042D, 结果表明 , 植物生长调节剂的种类与组合
对叶片再生不定芽影响很大 (表 1)。TDZ单独使
用可以诱导出不定芽 , 随其浓度的增加 , 不定芽
再生率逐渐提高 , 但不定芽玻璃化现象也随之加
剧。TDZ以 115 mg·L - 1为宜。TDZ 115 mg·L - 1
与 IBA配合使用 , 可显著提高不定芽的再生率 ,
当 IBA的浓度为 014 mg·L - 1时不定芽再生率最
高。2042D不利于芽的分化 , 浓度提高 , 不定芽
再生率逐渐降低 , 并且褐化加剧。
212　不同颜色滤光膜的物理特性及对不定芽形成
的影响
以含有 TDZ 115 mg·L - 1和 IBA 014 mg·L - 1的 表 1　不同植物生长调节剂组合对 ‘丰香’不定芽分化的影响Table 1　Effects of d ifferen t growth regula tors on shootregenera tion of‘Toyonoka’植物生长调节剂组合Growth regulator(mg·L - 1 )TDZ IBA 2042D 不定芽再生率Shoot regenerationrate ( % ) 平均每外植体再生芽数 No1 ofbuds per exp lant015 25145 1129110 36184 1171115 45145 2110210 46161 2138215 47145 2168115 012 60134 3120115 014 76167 5178115 016 74107 4168115 018 67127 4149115 110 63164 4100115 014 012 27145 1186115 014 014 17154 1130115 014 016 11132 1117115 014 018 6178 1100115 014 110 0 0
MS培养基作为基本培养基 , 研究不同滤光膜和暗处理对草莓叶片不定芽分化的影响。通过分析不同
颜色滤光膜波长及对应的光强可以看出 (表 2) , 波长 700 nm以上 , 光强差异不大 , 波长 300～700
nm之间 , 红膜和绿膜光强较弱且基本接近 , 而荧光灯 (对照 )、蓝膜和黄膜下光强较高。300～400
nm波长为紫外线辐射区 , 红膜和绿膜下紫外线辐射较弱 , 黄膜、蓝膜和荧光下则较强。
表 2　不同色膜内透射光光谱成分比较
Table 2　Spectrum of d ifferen t color pla stic f ilm s (W·m - 2 )
膜色
Treatment
紫外光 U ltraviolet
(300～400 nm)
蓝紫光 B lue
(400～510 nm)
绿光 Green
(510～610 nm)
红橙光 Red
(610～720 nm)
近红光 Near infrared
(720～1100 nm)
总辐射 Total radiation
(300～1100 nm)
对照 Control 01282 21993 31915 11473 01267 91298
红 Red 01089 (31167) 01051 (1170) 01062 (1158) 01850 (1158) 01225 (84127) 11624 (17147)
绿 Green 01083 (29154) 01133 (4144) 01575 (14169) 01149 (14169) 01231 (86152) 11487 (15199)
蓝 B lue 01170 (60150) 11005 (33158) 31195 (81161) 11229 (81162) 01225 (84127) 61117 (65179)
黄 Yellow 01180 (64106) 11479 (49142) 01176 (4150) 01059 (4150) 01213 (79178) 21426 (26109)
注 :括号中数值为不同膜下各波段光谱辐射能占相应对照辐射能的百分数 ( % )。
Note: Values in parenthesis are percent of radiant energy of different light wave bands in overall radiant energy.
培养在不同滤光膜下的外植体 , 3 d后形态开始发生变化 , 边缘卷曲 ; 1周后外植体膨大为原来
的 115倍以上。两周后不同处理的外植体的切口开始形成愈伤组织 , 颜色略有差异 , 在荧光、蓝膜、
201
　1期 秦永华等 : 丰香草莓叶片高效再生体系的建立 　
黄膜下的愈伤组织淡黄色 , 略带红色 ; 绿膜、红膜下的为淡黄色。培养 3周后 , 红膜下的外植体首先
出现不定芽 , 随后是绿膜、荧光 (对照 )、蓝膜 , 最后是黄膜。从表 3中可看出 , 培养 45 d后 , 不同
滤光膜下不定芽再生率以红膜和绿膜为最好 , 其次为荧光、蓝膜 , 而黄膜最差。每外植体平均再生芽
数以绿膜最高 , 红膜次之 , 黄膜最差。培养 50 d后 , 蓝膜和黄膜下的愈伤组织开始褐化死亡 (图版 ,
1～5)。由此可见 , 不同滤光膜对丰香草莓不定芽再生的影响很大 , 绿膜和红膜有利于不定芽的分
化 , 而黄膜最差。
表 3　不同滤光膜对 ‘丰香’草莓不定芽形成的影响
Table 3　Effect of color pla stic f ilm s on shoot regenera tion
of‘Toyonoka’
膜色处理
Treatment
再生频率
Regeneration rate ( % )
平均每外植体再生芽数
No. of buds per exp lant
对照 Control 71167 5189
绿 Green 98128 25175
红 Red 100 25111
蓝 B lue 60109 5131
黄 Yellow 20169 1150 表 4　暗处理对 ‘丰香’草莓不定芽形成的影响Table 4　Effect of dark trea tm en t on shoot regenera tionof‘Toyonoka’暗处理时间Dark (week) 再生频率Regeneration rate ( % ) 平均每外植体再生芽数No1 of buds per exp lant1 29131 11762 37129 31643 61167 61574 100 91055 89183 6154对照 Control 69192 5140
213　暗处理对不定芽形成的影响
外植体经暗处理后再置于光下培养。随着暗处理时间的增加 , 不定芽的再生率和再生芽数逐渐提
高 , 达 9105, 远高于其它处理 (表 4, 图版 , 6～10)。但暗处理 5周后 , 不定芽再生率和平均每外植
体再生芽数开始降低。由此可见 , 诱导不定芽再生的最佳暗培养时间以 4周为宜。
本试验结果表明 , 同一类型外植体 , 不同的激素类型对丰香不定芽再生的效果完全不同。TDZ是
一种具有极高细胞分裂活性的物质 , 它与 IBA配合使用能有效地诱导不定芽的再生 , 并能大量增殖
丛生芽。Thomas等〔5〕认为 TDZ可诱导细胞分裂素的生物合成 , 并可抑制内源生长素的降解。另外 ,
2042D不利于芽的分化 , 随着浓度的增高 , 叶片的分化能力逐渐降低 , 而生成大量疏松愈伤组织。
W ernicke〔6〕认为 , 2042D促进细胞分裂增殖的作用仅限于一定的浓度范围内 , 超过某一临界值 , 反而
对细胞有抑制作用。
光对植物的生长发育、形态构造、光合作用以及物质代谢等都具有一定的调控作用。不同滤光膜
对诱导草莓不定芽的分化具显著的差异 , 这可能是由于其作用光谱和光受体不同 , 从而影响草莓在不
定芽分化过程中的许多生理生化过程。紫外线是影响植物生长活动的重要因子之一 , 大量研究指出 ,
无论是温室还是田间 , 在紫外线辐射 (280～400nm ) 下 , 许多敏感植物的生长和生物量累积都有明
显的降低〔7〕, 说明紫外线辐射对植物生长发育有明显的抑制作用。Teramura和 Murali〔8〕研究发现植物
生长在室内比在田间对紫外 (UV ) 辐射增加敏感 , 他们认为这可能是由于自然界瞬息万变的环境条
件锻炼了植物的抗逆能力 , 包括抗紫外辐射的能力。本试验表明 , 红膜和绿膜对草莓不定芽的分化具
有明显的促进作用 , 这可能是该处理下紫外辐射较弱 , 而其它滤光膜下相对较强。荧光灯下紫外辐射
较强 , 而不定芽分化好于蓝膜和黄膜 , 我们认为荧光实际上是各种颜色光的集合 , 其效应有别与其
他 , A ro〔9〕和 Strid等〔10〕认为在白光条件下 , 可见光辐射强 , 与紫外辐射的比值高 , 对紫外辐射损伤
有一定的修复作用。除荧光外 , 各处理大体上随着光强的减弱 , 草莓不定芽再生率逐步提高 , 可能弱
光有利于不定芽的分化。
参考文献 :
1　Nehra N S, Stashnoff C. D irect shoot regeneration from strawberry leaf disks. J. Amer. Soc. Hort. Sci. , 1989, 114 (6) : 1014～1018
2　张志宏 , 吴禄平 , 代红艳 , 王国英 , 赵天永 , 毕晓颖 , 杜国栋. 草莓主栽品种再生和转化的研究. 园艺学报 , 2001, 28 ( 3 ) :
189～193
Zhang Z H, W u L P, Dai H Y, W ang G Y, Zhao T Y, B i X Y, Du G D. Regeneration and transformation in vitro of the strawberry varie2
301
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
ties. Acta Horticulturae Sinica, 2001, 28 (3) : 189～193 ( in Chinese)
3　Jemmali A, Elloum iN, Kevers C. Vegetative and generative behavior of strawberry ( Fragaria ananassa Duch. ) p lants raised from in vitro re2
generation of axillary or stipular buds. Acta Botanica Gallica, 2002, 149 (4) : 395～404
4　Passey A J, Barrett K J, James D J. Adventitious shoot regeneration from seven commercial strawberry cultivars ( Fragaria ananassa Duch. )
using a range of exp lant types. Plant Cell Reports, 2003, 21 (5) : 397～401
5　Thomas J C, Katterman F R. Cytokinin activity induced by thidiazuron. Plant Physiol. , 1986, 81: 681～683
6　W ernicke W , R ichard B. Somatic embryogenesis from sorghum bicolor leaves. Nature, 1980, 287: 138～139
7　Dai Q S, Peng, CoronelV P. Intraspecific responses of 188 rice cultivars to enhanced UV2B radiation. Environmental and ExperimentalBota2
ny, 1994, 34: 433～442
8　Teramura H, Murali N S. Intraspecific differences in growth and yield of soybean exposed to ultraviolet2B radiation under greenhouse and field
conditions. Environ. Exp. Bot. , 1986, 26 (1) : 89～93
9　A ro Eva2Mari. Photoinhibition and D1 p rotein degradation in peas acclimated to different growth irradiance. Plant Physiol. , 1993, 103:
815～823
10　Strid A, Porra R J. A lterations in p igment content in leaves of Pisum sativum after exposure to supp lementary UV2B. Plant Cell Physiol. ,
1992, 33 (7) : 1015～1023
图版说明 : 不同处理对 ‘丰香’不定芽分化的影响　1. 红膜 ; 2. 绿膜 ; 3. 蓝膜 ; 4. 荧光 ; 5. 黄膜 ; 6. 暗处理 1周 ; 7. 暗处理
2周 ; 8. 暗处理 3周 ; 9. 暗处理 4周 ; 10. 暗处理 5周。
Explana tion of pla tes: The effect of d ifferen t trea tm en ts on shoot regenera tion of ‘Toyonoka’　1. Red film s; 2. Green film s; 3.
B lue film s; 4. Fluorescent light; 5. Yellow film s; 6. One week; 7. Two weeks; 8. Three weeks; 9. Four weeks; 10. Five weeks.
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