全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1137～1140
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 12 - 08; 修回日期 : 2006 - 05 - 17
基金项目 : ‘十五’国家 ‘863’项目 (2004AA241200) ; 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: gehong@mail1caas1net1cn)
酚类物质与蝴蝶兰褐变关系初探
印　芳 1, 2 　葛　红 13 　彭克勤 2 　赵伶俐 1, 3 　周玉杰 1 　李秋香 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 湖南农业大学植物激素重点实验室 , 湖南长沙 410128; 3 西北农
林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100 )
摘 　要 : 利用高效液相色谱法对 3个褐化程度不同的蝴蝶兰品种 A1 (大白花红心 )、B3 (迷你型白花
黄心 ) 和 R4 (深红花红心 ) 进行了 9种酚酸定性定量分析 , 并研究了以叶片为外植体的初代培养过程中
总酚含量的动态变化。结果表明 : 绿原酸、邻苯二酚、儿茶酚、咖啡酸及没食子酸、对羟基苯甲酸、香豆
酸可能与蝴蝶兰褐变相关 , 苯甲酸对蝴蝶兰褐变影响很小 ; 在褐变过程中 , 总酚含量越高 , 褐变程度越严
重。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 褐变 ; 酚酸 ; 总酚
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521137204
The Influence of Phenols on T issue Brown ing of Pha laenopsis
Yin Fang1, 2 , Ge Hong13 , Peng Keqin2 , Zhao L ingli1, 3 , Zhou Yujie1 , and L i Q iuxiang1
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2 Key L abora tory of phy2
tohorm ones of Hunan A gricu ltura l U niversity, Changsha, Hunan 410128, China; 3 College of Horticu lture, N orthw est A & F U ni2
versity, Yang ling, Shaanxi 712100, China)
Abstract: Three varieties of Phalaenopsis spp. including A1, B3 and R4 were used as materials, H igh
Performance L iquid Chromatography (HPLC) was used to analyze phenolic acids of Pha laenopsis spp. quali2
tatively and quantitatively. Results showed that chlorogenic acid, catechol, catechuic acid, caffeic acid and
gallic acid, phydroxybenzoic acid, coumaric acid were correlated with browning, and the influence of benzoic
acid on browning was neglectable; The dynam ic changes of total phenolic acids contents were studied. Results
showed that total phenols were positively correlated with browning.
Key words: Pha laenopsis; B rowning; Phenolic acid; Total phenols
1　目的、材料与方法
褐变一直是植物组织培养与快速繁殖过程中亟待解决的问题之一 , 也是蝴蝶兰工厂化繁殖的难题
之一〔1, 2〕。酚类物质是植物体内一类重要的次生代谢物 , 是参与褐变反应的必要酶促底物 , 了解其在
蝴蝶兰组培过程中性质、种类及含量的变化 , 对于从源头上减少蝴蝶兰褐变有着重要意义。
作者对 3个褐化程度不同的蝴蝶兰 ( Pha laenopsis spp. ) 品种进行了酚酸定性定量分析 , 并研究
了在叶片分化过程中总酚含量的动态变化。同时对这 3个品种进行相应的暗培养处理 , 对其酚酸进行
定性定量分析 , 以期找出与蝴蝶兰褐变相关的主要酚酸及褐变与总酚含量之间的关系 , 为防止蝴蝶兰
褐变提供理论依据。
所选材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所蝴蝶兰品种 A1 (大白花红心 )、B3 (迷你型白花黄
心 ) 和 R4 (深红花红心 ) , 其在组织培养中的褐变程度为 A1 >B3 > R4。将 3个品种组培苗于培养基
1 /2MS + IBA 014 mg/L , pH 518, 温度 25℃, 光照 2 000 lx条件下培养 , 同时将 3个品种组培苗暗培
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
养 15 d (培养基、pH值、温度同上 )。选第 2片叶进行酚酸定性定量分析。仪器为 W aters244型高效
液相色谱仪。柱 : μ2Bonkapak Pheny1 ( 014 cm ×30 cm ) ; 流动相 : 35% CH3 OH - 65% H2 O (用
H3 PO4 调 pH至 415) ; 流速 : 110 mL /m in; 检测器 : UV 254 nm ×011 AUFS。标准溶液的配置 : 精密
称取 9种酚酸标样各 0125 g, 用流动相溶解定容 , 浓度为 1 g/L , 摇匀备用。样品制备 : 称取 2 g样品
用甲醇研磨 , 转入三角瓶用甲醇定容至 50 mL。超声波中振荡 30 m in。放置过夜后过滤 , 残渣用 50%
甲醇 50 mL加热回流 1 h, 过滤 , 滤液浓缩至 25 mL定容。将 W aters公司 Sep2pak C18小柱用 5 mL甲
醇冲洗活化 , 再用 5 mL水冲洗。吸取 5 mL样品提取液通过小柱 , 弃去最初洗出液 1 mL, 再收集 2
mL洗出液用于测定。
将 3个品种第 2片叶进行愈伤组织诱导培养 : 外植体大小为 018 cm ×018 cm, 培养基 MS + 62BA
3 mg/L, pH 518, 温度 25℃, 光照 2 000 lx。在接种后第 0、2、4、6、9、14天测定总酚含量。准确
称取 1 g样品用 5 mL含 2% HCl的甲醇 (分析纯 ) 研磨 , 在室温、黑暗条件下提取 24 h; 4℃12 000
×g离心 10 m in; 取上清液 200μL置于 510 mL试管中 , 加入 110 mL福林 -肖卡试剂 ( Sigma公司产
品 ) 和 018 mL 715%的碳酸钠溶液 , 缓慢搅拌反应 30 m in后 , 用日本 UV21601紫外 - 可见分光光度
计在 765 nm 处比色测定吸光度 OD 值。分别取浓度为 50、100、150、200、250、300、350、400、
450、500 mg/L的没食子酸 ( Sigma公司 ) 为标准物 , 步骤同上 , 建立标准曲线。总酚含量表示为没
食子酸 mg/g FM。试验重复 3次 , 数据用 DPS软件进行统计分析。
2　结果与分析
211　不同褐化程度蝴蝶兰品种总酚含量分析
从表 1可以看出 , 3个品种的总酚含量在接种后的前 4 d都呈不同程度的下降趋势 , 第 4天后急
剧上升 , 到第 9天达最高 , 然后又开始下降 ; 在整个培养过程中 , 褐化程度严重的 A1和 B3品种的
总酚含量始终高于褐化程度轻的 R4品种 , 这表明褐变程度越严重 , 总酚含量也越高 , 与前人的研究
结果一致〔2, 4, 5〕。总酚含量在接种 9 d后减少 , 可能是酚类物质被大量氧化引起的 , 这一结果也说明在
蝴蝶兰组织培养中对外植体进行减少总酚含量的预处理是行之有效的方法。另外从表 1也可以看出品
种的总酚含量变化幅度不同 , 这也许是由于品种之间酚类合成酶和氧化酶活性不同所致 , 有待进一步
研究。
表 1　蝴蝶兰 3个品种不同培养时期总酚含量
Table 1　Con ten ts of three var ieties of tota l phenols in d ifferen t cultura l days
品种
Variety
褐变程度
B rowning degree
总酚含量 Contents of total phonels (mg/g FM)
0 d 2 d 4 d 6 d 9 d 14 d
A1 重 H igh 211526aA 201289aA 201115aA 331183abA 331929aA 241772bB
B3 重 H igh 191458bA 181726abA 161682bB 351185aA 351322aA 311666aA
R4 轻 Slight 181942bA 181412bA 141190cB 291839bA 331159aA 161034cC
　　注 : 相同列不同大写字母为差异极显著 (α = 0101) , 不同小写字母为差异显著 (α = 0105)。
Note: The same cap ital or small letter indicated no significance atα = 0101 or 0105 level.
212　不同褐化程度蝴蝶兰品种酚类物质定性定量分析
21211　光照培养条件下 3个品种酚酸的含量 　从图 1可以看出 , 3个品种均没有检测出苯甲酸 , 褐
变最轻的品种 R4未检测出香豆酸 , 褐变相对严重的 A1和 B3未发现对羟基苯甲酸 ; 褐变程度严重的
品种 , 其咖啡酸、邻苯二酚、儿茶酸及绿原酸的含量也高 , 即在褐变最严重的品种 A1中含量最高 ,
B3次之 , 在褐变最轻的品种 R4中含量最低 ; 没食子酸含量在褐变最严重的品种 A1中含量最低 , B3
次之 , R4中最高 ; 阿魏酸的含量与褐变程度没有明显的相关性。
21212　暗培养条件下 3个品种酚酸的含量 　有研究结果表明 , 很多植物经过暗培养预处理可减轻组
织培养外植体褐变〔4, 6, 7〕, 实践中蝴蝶兰经过暗培养后褐变也明显减轻。从图 2可以看出 , 3个品种在
经过暗培养后均没有检测出绿原酸、邻苯二酚、香豆酸、阿魏酸和苯甲酸。
8311
　5期 印 　芳等 : 酚类物质与蝴蝶兰褐变关系初探 　
图 1　A1、B3和 R4品种酚酸种类及含量
F ig. 1　Con ten ts and types of phenolic ac ids of A1, B3 and R4
图 2　暗培养处理后 A1、B3和 R4品种酚酸种类及含量
F ig. 2　Con ten ts and k inds of phenolic ac ids of A1, B3 and R4 after dark culture
比较分析图 1和图 2可以看出 , 3个品种在正常培养和暗培养条件下都没有检测出苯甲酸 , 褐变
严重的品种 A1和 B3在正常培养时检测出香豆酸 , 而在褐变轻的品种 R4中未检出 ; 在暗培养处理中
3个品种均未检测出香豆酸 ; 在光照培养条件下 3个品种绿原酸、邻苯二酚、咖啡酸含量很高 , 而在
暗培养中未检测出或含量极低。
从以上的分析可以认为 : 苯甲酸对蝴蝶兰褐变影响可能很小或没有 ; 香豆酸对蝴蝶兰褐变可能有
重要的影响 ; 绿原酸、邻苯二酚、咖啡酸在 3个品种光照培养条件下含量很高 , 而在暗培养中未检测
出 , 可能这 3种酚酸与蝴蝶兰褐变有相关性。
参考文献 :
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收稿日期 : 2006 - 04 - 26; 修回日期 : 2006 - 08 - 013 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: kxtang@ hotmail1com)
非洲菊 ESTs2SSR标记的频率和分布特点
王继华 1, 2 　瞿素萍 1 　唐开学 13 　李成云 2 　陈海如 2 　 (1 云南省农业科学院农业部花卉产品质检中
心 , 云南昆明 650205; 2 云南农业大学云南省植物病理重点实验室 , 云南昆明 650201)
Ana lysis of the Frequency and D istr ibution of M icrosa telllites in ESTs of G er2
bera hybrida ( A steraceae)
W ang J ihua1, 2 , Qu Sup ing1 , Tang Kaixue13 , L i Chengyun2 , and Chen Hairu2 ( 1 Yunnan A gricu lture A cadem y,
Supervision and Testing Cen tre for Flow er of A gricu lture M in istry, Kunm ing, Yunnan 650205, China; 2 Yunnan A gricu ltura l U ni2
versity, Key Laboratory for Phytopa thology of Yunnan Province, Kunm ing, Yunnan 650201, China)
关键词 : 非洲菊 ; 表达序列标签 ; 微卫星序列 ; 频率 ; 分布
中图分类号 : S 68211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521140201
采用 Tandem Repeats Finder 410软件对来源于 Plant genome Network的非洲菊 EST序列的微卫星 ( SSR) 进行系统
分析。在 17 339条 , 总长 815 Mb的 ESTs序列中 , 共有 6 294个以 1～6个核苷酸为基序的 SSR序列 (长度大于 15
bp, 匹配值大于 80% )。其核苷酸总数占整个基因组核苷酸数的 1164% , 平均 114 kPR21b就分布有一个大于 15 bp的
SSR。其中六核苷酸重复序列频率最高 , 为 1个 /413 kPR21b, 其次为单核苷酸 (1个 /610 kPR21b)、三核苷酸 (1个 /
918 kPR21b)、五核苷酸 (1个 /1017 kPR21b)、二核苷酸 (1 /1114 kPR21b) 和四核苷酸 (1个 /1618 kPR21b)。在各种
SSR s重复单元中 , 富含 A /T核苷酸的重复单元占据优势地位 , 如单核苷酸 (多聚 A /T) , 二核苷酸 (AG、AC和
AT) , 三核苷酸 ( AAG、AAT、ACC、ATG) , 四核苷酸 (AAAC、AAAT、ACCG、AAAG 和 ACAT) , 五核苷酸
(AAAAC、AAAT、AACATT和 AAACC) , 六核苷酸 (AAAAAC、AAAAAT、AAATAT、AAACAC和 AAAAAG) , 而富含
G/C的重复单元在基因编码区中含量较低。冗余与非冗余的 SSR分布频率与密度相似 , 仅存在较小的距差 , 说明可从
现有的 ESTs数据中方便地筛选出有效的微卫星标记。进一步分析表明 , 冠毛中 SSR的频率最高 , 为 1 /882 bp, 其余
为花 (1 /1 108 bp)、花茎 (1 /1 220 bp)、雄蕊 (1 /1 278 bp)、初期花序 (1 /1 483 bp)、晚期花瓣 (1 /1 641 bp)、叶
(1 /1 724 bp) 和早期花瓣 (1 /1 803 bp)。在非洲菊不同组织器官或发育阶段中 , 六核苷酸与三核苷酸在早期花瓣的
相对含量最高 , 分别为 3912%和 1910% ; 单核苷酸、二核苷酸、四核苷酸、五核苷酸相对含量最高的分别为花序、
冠毛、花茎和花 , 分别占 3517%、2014%、1018%和 1613%。 (图 1)。
图 1　不同组织器官或发育阶段 EST2SSRs的比例
1: 花 ; 2: 早期花瓣 ; 3: 晚期花瓣 ; 4: 叶 ; 5: 雄蕊 ; 6: 花茎 ; 7: 初期花序 ; 8: 冠毛。
F ig. 1　Percen t frequency of EST2SSRs am ong 8 gerbera tissues/developm en t stages
1: Flower; 2: Early petal; 3: Late petal; 4: Leaf; 5: Stamen; 6: Scape; 7: Young inflorescence; 8: Pappus bristles.
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