全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1587 - 1594
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 24; 修回日期 : 2008 - 10 - 14
基金项目 : 福建省财政专项———福建省农业科学院科技创新团队建设基金项目 ( STIF2Y06)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: pdm666@1261com; fjvrc@1631com)
反义乙烯受体 F a E tr2基因对草莓的转化
朱海生 1, 2, 3 , 潘东明 13 , 温庆放 2, 33 , 林义章 1
(1 福建农林大学园艺学院 , 福州 350002; 2 福建省农业科学院蔬菜研究中心 , 福州 350013; 3 福建省农业科学院作物
研究所 , 福州 350013)
摘 　要 : 通过根癌农杆菌 EHA105介导转化草莓叶片 , 在卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生
根培养 , 获得了 26株转乙烯受体 FaE tr2反义基因植株。PCR和 Southern blot检测证明 , 该基因已经整合草
莓染色体中。Northern分析表明 , 转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。对果实乙烯释放量测定表明 ,
转基因草莓乙烯释放量降低。
关键词 : 草莓 ; 乙烯受体 ; 转化
中图分类号 : S 66814　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121587208
Tran sforma tion of An tisen se Ethylene Receptor F aE tr2 Gene in Strawberry
ZHU Hai2sheng1, 2, 3 , PAN Dong2m ing13 , W EN Q ing2fang2, 33 , and L IN Yi2zhang1
( 1 College of Horticulture, Fujian A griculture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 2V egetable R esearch Center, Fujian
A cadem y of A gricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 3 C rops Research Institu te, Fu jian A cadem y of A gricultural Sciences,
Fuzhou 350013, China)
Abstract: Imp roving keep ing quality of strawberry fruit is a difficult p roblem. App lying antisense gene
strategy to control ethylene recep tor is a new feasible method. The antigene FaE tr2 was introduced into leaves
of stawberry ( F raga ria ananassa Duch. ) with A grobacterium tum efaciens, and 26 transgenic p lants were se2
lected under kanamycin. It was p roved that anti2FaEtr2 was integrated with chromosome of transgenic p lant,
according to the results of PCR and Southern blot. Northern blot analysis indicated that FaE tr2 mRNA abun2
dance was decresased in antisense strawberry p lants. The ethylene p roduction in transgenic strawberry signifi2
cantly decreased. The results suggest that there is some intricate relation between FaE tr2 and the ripening of
strawberry fruits. The anti2transgenic strawberry p rovide p recious materials for the further research.
Key words: strawberry; ethylene recep tors; genetic transformation
草莓 ( F ragaria ananassa Duch. ) 果实不耐贮运一直是其运输及销售过程中的一个难题。在影响
果实成熟的众多因素中 , 乙烯在调控果实成熟基因的协同表达中起着非常重要的作用。乙烯受体是乙
烯感知和信号转导的初始成分 , 乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的 (韩
继成 , 2004)。通过反义 RNA技术调节乙烯受体基因的表达水平调控果实的成熟衰老进程 , 是目前延
缓果实后熟软化的重要途径。W hitelaw等 (2002) 采用反义手段抑制番茄 L eETR1的表达后 , 植株的
节间变短 , 花的衰老延迟。Hackett等 (2000) 反义抑制了 N r突变体中的 N R基因表达后 , 果实恢复
了成熟能力 , 这在证明乙烯受体是负调控的同时 , 也表明 NR可能并不是果实正常成熟所必需的。杨
虎清等 (2003) 和王中凤等 (2006) 将反义 L eETR1转到番茄中 , 乙烯释放高峰的出现比对照果实推
迟 10 d, 番茄红素的合成受到显著抑制 , 果实不能形成正常的红色 , 推测 L eETR1和番茄的成熟有着
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
密切的关系。Traninotti等 ( 2005 ) 克隆出 3个草莓乙烯受体基因 , FaE tr1和 FaE rs1属于类型 Ⅰ,
FaE tr2属于类型 Ⅱ。这些基因的表达量和乙烯释放量之间有很好的相关性。特别是和跃变型果实一
样 , 草莓乙烯受体的增加同样是伴随着乙烯的增加。Cancel和 Larsen (2002) 认为在成熟草莓中表达
量最多是类型 Ⅱ受体 , 它有一个组氨酸激酶区 , 这个区被认为和 CTR1蛋白有一个微弱的联系 , 即使
成熟的草莓产生少量的乙烯 , 就有可能有效启动与成熟相关的一些生理反应。
作者在已建立的高效稳定的草莓离体再生体系 (朱海生 等 , 2007a, 2007b, 2008) , 遗传转化
体系和 FaE tr2基因反义表达载体的基础上 , 采用反义 RNA技术 , 转化 FaEtr2反义基因 , 获得反义转
基因材料 , 并对转基因草莓果实的乙烯释放进行了观察。
1　材料与方法
111　转化材料及培养条件
选用 ‘鬼露甘 ’草莓试管苗叶片作为转化受体 ; 根癌农杆菌 EHA105为供试菌株 , 含有反义植
物表达载体 pB I121Etr2。
预培养和共培养培养基 MS1: MS + 62BA 210 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1 ; 筛选培养基 MS2: MS
+ 62BA 210 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1 + Timentin 300 mg·L - 1 + Kan 20 mg·L - 1 ; 伸长培养基 MS3:
MS + 62BA 015 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1 Kan 20 mg·L - 1 + Timentin 100 mg·L - 1 ; 生根培养基
MS4: MS +NAA 012 mg·L - 1 + Kan 20 mg·L - 1 + Timentin 100 mg·L - 1。以上所用培养基均附加蔗糖
3% , 琼脂 6 g·L - 1 , pH 518。
培养条件为光照强度 30～40μmol·m - 2 ·s- 1 , 光周期 16 h光照 , 8 h黑暗 , 温度 (25 ±2) ℃。
112　农杆菌对草莓叶盘的转化
将较小的无菌叶片用刀切去四周边缘 , 较大的无菌叶片切去四周边缘后中间再横切一刀 , 以叶背
接触 MS1培养基进行预培养 2～4 d。将预培养过的外植体放入 OD600nm值为 014的菌液中 , 轻摇浸泡
10 m in后 , 用无菌滤纸吸干菌液。在共培养培养基 MS1上 , 28 ℃暗培养条件下共培养 3 d, 然后用无
菌水冲洗材料 , 并用含 200 mg·L - 1头孢霉素的无菌水轻摇浸泡 20 m in, 吸干液体。共培养后的外植
体转入筛选培养基 MS2上培养 , 每 10 d继代一次 , 去除褐变死亡或呈明显水渍状的外植体 , 并逐步
降低培养基中羧吩青霉素浓度 , 约 4～5周后即可分化出抗性不定芽。
113　草莓 RNA和 D NA的提取及 D NA酶切
DNA提取采用王关林和方宏筠 ( 2002) CTAB法和试剂盒提取 , RNA提取采用 Trizol法。DNA
的酶解检测 : 取适量植物总 DNA , 在 20μL反应体系中加入 H ind Ⅲ 1μL, EcoRⅠ1μL, 10 ×Buffer
2μL, 加双蒸水至 20μL。加样后置于 37 ℃恒温水浴锅中过夜 , 反应结束后用 1%琼脂糖凝胶电泳检
测。
114　转基因植株的 PCR检测
取转基因草莓 DNA、阴性对照未转化草莓 DNA和阳性对照质粒作为反应模板 , 分别对转基因草
莓植株中转化的目的 DNA片段和 npt Ⅱ基因进行 PCR鉴定。
(1) 由于转基因植株和阴性对照未转化植株中都有目的基因 , 因此在检测转基因草莓植株中转
化的目的 DNA片段时 , 设计引物将 35S启动子部分序列包括进来 , 作为 5′端引物 , FaE tr2的一对引
物为 : 5′端 : TTCGCAAGACCCTTCCTC, 3′端 : GCGAGCTCATAGGCTTGTGACTCGGA, 扩增出来的片
段包括 FaE tr2为 411 bp。
(2) 转基因植株中 npt Ⅱ基因鉴定的 PCR 引物根据已报道的标记基因 npt Ⅱ设计。载体
pB I121Etr2的基因 npt Ⅱ的一对引物设计为 : 5′端 : CTGGGCACAACAGACAATC, 3′端 : TACCGTA2
AAGCACGAGGAA , 扩增出 668 bp片段。
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PCR扩增条件为 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 30 s, 52 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 1 m in, 共 35个
循环。扩增完毕 , 经 1%琼脂糖凝胶电泳检查。扩增体系 : 反应采用 25μL体系 : 25 ng模板 DNA ,
014μmol·L - 1引物 , 0115 mmol·L - 1 dNTP, 1 U TaqDNA 聚合酶 , 115 mmol·L - 1 MgCl2 , 215μL
10 ×PCR缓冲液 , 加入灭菌的超纯水至 25μL。
115　转基因植株印迹杂交检测
经 PCR检测呈阳性的植株进一步进行 Southern印迹杂交。本试验对转基因植株中 npt Ⅱ基因进行
Southern印迹检测 , 通过检测标记基因来鉴定转基因植株。同时通过对包括 35S启动子部分序列的
PCR产物进行 Southern印迹杂交试验进一步确认。取 Southern印迹杂交检测为阳性的植株 , 进一步作
Northern印迹杂交检测 , 设非转化植株为阴性对照 , 以 FaE tr2基因片段为探针 , 取总量相同的叶片总
RNA做 Northern印迹杂交分析。采用 Roche公司生产地高辛试剂盒 , 按说明书进行。
116　乙烯的测定
将未转化植株和转 FaE tr2基因植株的草莓果实放在大小适合的橡胶塞罐头瓶盖中 , 每瓶中 5个 ,
称重 , 密封 3 h, 取 l mL顶隙气体 , 注入气相色谱仪测定乙烯浓度 , 重复 3次。色谱条件 : 氢火焰离
子化检测器 , N2为载气 , H2为燃气 , 空气为助燃气 , 柱温 90 ℃, 进样口温度 140 ℃, 外标法定量。
2　结果与分析
211　转基因植株的获得及定植
在侵染后的筛选过程中 , 接种于筛选培养基 MS2上的外植体 , 部分子叶块上产生绿色芽点 ; 将
这些绿色芽点转移至新鲜的筛选培养基上 (图 1, A ) , 部分可以正常伸长 ; 将可正常伸长的抗性芽
在伸长培养基 MS3上培养至 2～4 cm, 在 MS4培养基上生根 (图 1, B )。
图 1　草莓叶片再生及抗性植株筛选
A: 抗性芽 ; B: 抗性苗生根 ; C: 抗性苗 ; D: 抗性苗定植 ; E: 开花的转基因草莓 ;
F、G: 未转基因草莓 ; H: 结果的转基因草莓。
F ig. 1　Regenera tion of strawberry leaves and an tib iotic resistan t plan tlet selection
A: Resistant shoots; B: The rooting of resistant seedling; C: Resistant seedling; D: The transp lantation of the resistant seedling;
E: Efflorescence of transgenic strawberry; F and G: Untransformed strawberry; H: Maturation of transgenic strawberry.
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　　4周后 , 将生根的小苗从瓶中移出 , 用蒸馏水清洗掉培养基并移植到装有高压灭菌的泥沙 (1∶1)
混合物的小盘中。盘上盖上聚合薄膜以维持高湿度。盘植小苗放在培养室内 ( 23 ℃ ±2 ℃, 16 h光
周期 ) , 用 1 /4MS盐剂浇灌 3周 , 此后小苗移到夜 /昼温度为 18 /20 ℃的玻璃房内炼苗 , 1周后即可定
植 (图 1, C、D)。
212　草莓 D NA和 RNA的提取及 D NA酶切
本试验采用的 CTAB法和试剂盒提取草莓 DNA及酶切效果均好 (图 2, A、B )。试剂盒提取简便
快速 , 但量少 , 浓度低 , 可以用作 PCR检测 ; CTAB 法提取量多 , 浓度高 , 但时间较长 , 可用作
Southern杂交。采用 Trizol法提取草莓果实中的总 RNA, 效果较好 , 大多样品的 OD260 /OD280的比
值介于 117～210之间 , 琼脂糖凝胶电泳结果 (图 2, C) 表明 RNA样品比较完整 , 无降解。
图 2　草莓 D NA ( A)、H ind Ⅲ和 EcoRⅠ酶切 ( B) 及 RNA ( C) 电泳图
M: λ2EcoT14Ⅰdigest; 1～4: 草莓 DNA。
F ig. 2　Electrophresis of strawberry genom ic D NA ( A) , enzym es ana lysis ( B) and strawberry RNA ( C)
M: λ2EcoT14Ⅰdigest; 1 - 4: Strawberry genom ic DNA.
213　转基因植株的 PCR检测
由于转基因植株和阴性对照未转化植株中都有目的基因 , 因此不能用转化的反义基因引物进行
PCR鉴定。由于未转化的植株中没有 35S启动子 , 所以设计引物时将 35S启动子部分序列包括进来 ,
作为 5′端引物 , 这样未转化的植株就不能扩增出目的片段 , 只有转化的植物才能扩增出相应片段 ,
可以对植株进行 PCR鉴定。
在对转反义 FaEtr2基因的抗性苗进行鉴定时 , 随机选取的 11株抗性苗均可扩增出 411 bp的包含
有 FaE tr2基因的目的片段 , 与阳性对照质粒 pB I121Etr2扩增出的条带大小一致 , 而阴性对照未转化
的植株未扩增出任何条带 , 初步说明目的基因已经成功整合到草莓基因组中 (图 3, A)。
标记基因 npt Ⅱ和目的基因都位于 T2DNA的左、右边界之间 , 从理论上讲 , 如果转化的植株中
目的反义 DNA序列存在 , 标记基因 npt Ⅱ序列也应该存在。因此对抗性苗又进行标记基因 npt Ⅱ的
PCR验证 , 也为下一步以标记基因 npt Ⅱ为鉴定对象的 Southern blot检测提供依据。
在对转反义 FaE tr2基因的标记基因 npt Ⅱ进行检测时 , 设计一对引物 , 欲扩增出大小 668 bp的
片段。如图 3, B , 阳性对照质粒 pB I121Etr2在约 688 bp处有一特异扩增带 , 11株抗性苗中同样全部
扩增出了同阳性对照大小相同的目的条带 , 而阴性对照未转化植株未扩增出任何条带 , 进一步证明目
的基因已经整合到草莓基因组中。
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　11期 朱海生等 : 反义乙烯受体 FaEtr2基因对草莓的转化 　
图 3　转基因植株反义 F aE tr2片段的 PCR检测 ( A) 和 nptⅡ的 PCR检测 ( B)
M: DNA marker DL 2000; 1: 质粒 pB I121Etr2; 2: 未转化植株 ; 3～13转基因植株。
F ig. 3　The PCR ana lysis of F aE tr2 ( A) and nptⅡ ( B) in tran sgen ic strawberry
M: DNA marker DL 2000; 1: PCR p roduct of pB I121Etr2; 2: Untransformed
strawberry; 3 - 13: Transgenic strawberry.
214　转基因植株的 Southern杂交检测
为进一步确证目的基因是否转入 , 对 PCR检测为阳性的植株进行 Southern印迹杂交试验。由于
在转化和未转化的草莓中都存在相应目标基因序列 , 结果难以确认。故对本试验转基因植株中 npt Ⅱ
基因进行 Southern印迹检测 , 通过检测标记基因来鉴定转基因植株。同时通过对包括 35S启动子部分
序列的 PCR产物进行 Southern印迹杂交试验进一步确认。
在对转反义 FaE tr2基因植株中 npt Ⅱ基因进行 Southern印迹杂交时 , 以质粒 pB I121Etr2中 npt Ⅱ
PCR回收产物为探针 , 质粒 pB I121Etr2作为阳性对照 , 未转化植株为阴性对照 , 转基因植株和阴性
对照植株基因组 DNA用 H ind Ⅲ和 EcoRⅠ双酶切基因组 DNA。
杂交结果如图 4所示 , 3株被检测的转化植株都有杂交带出现 , 阴性对照无杂交带。
图 4　转基因草莓中的 nptⅡ基因 Southern杂交
1: 质粒 pB I121Etr2; 2～4: 转化株 ; 5: 未转化株。
F ig. 4　Southern blotting ana lysis of tran sgen ic strawberry
1: pB I121Etr2; 2 - 4: DNA of transformed p lants; 5: DNA of untransformed p lant.
在对 PCR产物进行杂交时 , 以 FaE tr2基因片段为探针 , 质粒 pB I121Etr PCR产物作为阳性对照 ,
未转化植株 DNA PCR产物为阴性对照 , Southern印迹杂交结果见图 5。转基因植株和阳性对照都得到
一条大小一致的条带 , 阴性对照无杂交条带 , 确证了反义 FaE tr2基因已经整合到草莓基因组中。
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图 5　转基因草莓的 PCR2Southern杂交
1: 质粒 pB I121Etr2; 2: 未转化株 ; 3～5: 转化株。
F ig. 5　PCR2Southern Blotting ana lysis of tran sgen ic strawberry
1: PCR p roduct of pB I121Etr2; 2: PCR p roduct of untransformed strawberry;
3 - 5: PCR p roduct of transgenic strawberry.
215　转基因植株的 Northern印迹杂交检测
为了检测转入反义 FaE tr2基因后草莓 FaE tr2基因的表达水平 , 取 Southern印迹杂交检测为阳性
的植株 , 进一步作 Northern印迹杂交检测 , 以未转基因的草莓为对照 , FaEtr2基因片段为探针。对叶
片总 RNA做 Northern印迹杂交分析如图 6, 两株转基因植株的杂交信号明显比对照弱 , FaE tr2基因
的表达因转入反义 FaE tr2基因片段而受到抑制。
图 6　转基因草莓 Northern印迹杂交检测
1、2: 转化植株 ; 3、4: 未转化植株。
F ig. 6　Northern blotting ana lysis of tran sgen ic strawberry
1, 2: Transformed p lants; 3, 4: Untransformed p lants.
216　转基因草莓开花、果实成熟及果实乙烯释放量
将转 FaE tr2基因植株和对照植株同时生根 , 定植 , 在相同生长条件下可正常开花结果 (图 1)。将
未转化植株和转 FaEtr2基因植株果实放在密闭容器密封 3 h, 测定乙烯释放含量 , 转 FaEtr2基因植株乙
烯释放量比对照植株乙烯释放量要低一些 , 其中转 FaEtr2基因植株乙烯释放量为 0148μL·kg- 1 ·h - 1 ,
低于对照的 0161μL·kg- 1 ·h - 1 , 是对照植株的 78169% , 结果显示转入的反义乙烯受体基因可能对
乙烯合成系统产生了影响 , 从而使乙烯释放量降低。
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　11期 朱海生等 : 反义乙烯受体 FaEtr2基因对草莓的转化 　
3　讨论
植物激素乙烯是控制果实成熟的激素 , 在果实成熟衰老过程中起重要的作用 (魏绍冲 等 ,
2004)。乙烯作为成熟激素调控跃变型果实成熟的理论已被人们认可。非跃变型果实由于其果实成熟
的生理代谢与跃变型果实有着明显的差异 , 尤其是乙烯生成的特性及对外源乙烯的反应方式存在着明
显差异 , 控制其基因调控进而延迟非跃变型果实成熟衰老的分子生物学还在研究中。而且 , 已获得的
数据表明这些非跃变型果实没有特别的调控模式。到目前为止 , 没有发现类似于乙烯在跃变型果实成
熟中起着重要作用一样的调控物质。草莓等非跃变型果实也能合成乙烯 , 在某些情况下乙烯可能参与
非跃变型果实的成熟 , 乙烯参与非跃变型果实的机制研究甚多 , 但至今没有结果明确表明乙烯和非跃
变型果实成熟的关系 (James et al. , 2004; Traninotti et al. , 2005)。
乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体 , 乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导
过程完成的 (韩继成 , 2004)。FaE tr2是属于类型 Ⅱ的草莓乙烯受体 , 具体功能目前还不明确 , 本试
验采用反义 RNA技术 , 对 FaE tr2实施 “基因封闭 ”, 获得反义转基因材料。本试验发现反义转基因
植株果实中乙烯释放量都比对照低 , 提示反义转基因植株乙烯合成系统活性可能降低。乙烯受体的减
少影响乙烯生物合成系统 , 从而降低乙烯的释放。乙烯信号转导研究最先是在模式植物拟南芥上取得
重大突破 , 建立了植物乙烯反应的线性信号转导模型 , 然而拟南芥没有果实 , 这对研究乙烯受体对果
实成熟的作用是一个重大障碍。后来人们对番茄等植物的乙烯受体作了不少研究 , 发现乙烯受体基因
在各种果实中可能存在不同的表达和调节模式。本试验观测到的结果与前人的研究有一定差异。可能
是不同的乙烯受体对不同植物不同组织的信号转导作用不同 , 它们在不同的组织中可能以不同的方式
实现对乙烯反应的调控 (王中凤和应铁进 , 2004) , 也可能草莓与拟南芥等乙烯受体的调控模型有所
不同 , 这有待继续研究。
本研究成功地将草莓乙烯受体 FaE tr2反义基因导入到草莓基因组 , 对 FaE tr2基因实施 “基因封
闭 ”, 抑制了 FaE tr2的表达量。转基因草莓中乙烯释放量降低 , 推测 FaE tr2基因在草莓成熟中可能
起一定作用。
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本书由关军锋 , 〔德 〕索尔编著 , 科学出版社 2005年 7月出版 , 可作为大专院校和科研单位的果树学、植物生理
学、植物营养学等相关专业人员的参考书。定价 : 52元 (含邮费 )。
《果品品质研究》
《果品品质研究 》由关军锋主编 , 是根据我国果品生产发展方向和在果品品质研究日益受到重视的前提下编写
的。全书共分五篇 , 第一篇系统介绍果品品质的概念、风味物质及绿色果品的生产 ; 第二篇着重阐述了采前果实品质
的发育机理及影响因素 , 如生态、水分、激素的调控及果实品质的遗传和改良 ; 第三篇总结了减少采后果实品质损失
的策略及途径 , 介绍了重要氧化酶的理化性质 ; 第四篇分析了主要果实生理病害的发生机理和控制途径 ; 第五篇介绍
了果实品质的数学评价方法和常见果品品质的测定技术。定价 : 30元 (含邮费 )。
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报 》编辑部 , 邮编 100081。
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