全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 655 - 658
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 30; 修回日期 : 2007 - 03 - 05
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2003AA207120)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@njau1edu1cn)
白菜 Pol胞质雄性不育系和保持系蕾期基因表达差
异的 SRAP分析
邓晓辉 , 张蜀宁 , 侯喜林 3
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095)
摘 　要 : 将 SRAP技术用于基因差异表达研究 , 用 30对 SRAP引物组合对白菜 Pol胞质雄性不育系和
保持系的 cDNA进行扩增 , 得到两条特异片段 BcCMS1、BcCMS2。对特异片段克隆测序分析后发现 , BcC2
MS1与大白菜细胞生成相关染色体的 19个氨基酸有 63%的相似性 , BcCMS2与芥蓝抑制开花的基因 FLC3
部分碱基有 88%的相似性。这两个序列在 GenBank中的登录号分别为 DQ914921、DQ914922。此结果显示
在胞质雄性不育中细胞质基因改变了部分核基因的表达。
关键词 : 白菜 ; 胞质雄性不育 ; SRAP; 基因表达
中图分类号 : S 63413; Q 943　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320655204
D ifferen tia l Expression Ana lysis of Bud of Pol CM S and ItsM a in ta in ter L ine
of B rassica rapa ssp. ch inensis Through SRAP
DENG Xiao2hui, ZHANG Shu2ning, and HOU Xi2lin3
(S tate Key L abora tory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N anjing A gricultural U niversity, N anjing 210095, Ch ina)
Abstract: cDNA of Pol cytop lasm ic male sterility (CMS) and its maintainer line were amp lified with 30
pairs of SRAP ( sequence related amp lified polymorphism) p rimers combination, and two fragmentsBcCMS1 and
BcCMS2 were obtained. Information from cloning and sequencing of these two bands indicated that BcCMS1 was
of 63% of homology with 19 am ino acids of chromosome related to cytogenetic of B rassica rapa, BcCMS2 was of
88% of homology with the FLC3 gene for inhibiting flower gene of B rassica oleracea. The accession numbers for
these two sequences in GenBank were DQ914921 and DQ914922, respectively. The results obtained suggested
that the exp ression of the nuclear gene in cytogenetic male sterility was affected by the cytop lasm ic gene. The
SRAP technique was firstly successfully adop ted in the research of gene differential exp ression.
Key words: B rassica rapa ssp. ch inensis; CMS; SRAP; Gene exp ression
细胞质雄性不育是核质基因互作的结果 , 蕾期是雄性不育发生的关键时期 , 因此研究白菜 Pol胞
质雄性不育系和其保持系蕾期基因差异表达很有意义。
相关序列扩增多态性 ( sequence related amp lified polymorphism, SRAP) 是基于 PCR的一种新型分
子生物技术 , 由美国加州大学蔬菜作物系 L i和 Quiros (2001) 提出 , 又叫基于序列扩增多态性 ( se2
quence based amp lified polymorphism , SBAP) ( Ferriol et al. , 2003)。 SRAP在国外应用较多 (L i &
Quiros, 2001; Ferriol & Nuez, 2003) , 国内目前应用较少 (李严和张春庆 , 2005)。此技术的反应模
板多用基因组 DNA, 也可以是 cDNA (L i & Quiros, 2001; L i et al. , 2003)。利用基于 PCR的 SRAP
来分析检测分子表达的多态性简便、高效、快捷 (柳李旺 等 , 2004)。本研究用 SRAP技术找出白菜
Pol胞质雄性不育系及其保持系蕾期基因差异表达的特异片段 , 对表达特异片段进行克隆测序和生物
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
信息学分析 , 以求进一步探明胞质雄性不育的机理。
1　材料与方法
白菜 (B rassica rapa ssp. ch inensis) 胞质雄性不育系 04P20及其保持系 04P21 (已回交 11代 ) 由
南京农业大学园艺学院白菜课题组提供。取 10株盛花期的花蕾混合均匀提取 RNA。转化受体菌
E1coli JM109、克隆载体 pMD192T购自 TaKaRa公司。SRAP引物参考柳李旺等 ( 2004) 的引物 , 从
中选出 6条正向引物和 5条反向引物组成 30对引物组合。正向引物是 ME1、ME2、ME3、ME4、
ME5、ME6; 反向引物为 EM1、 EM2、 EM3、 EM4、 EM5。引物由上海博亚公司合成。 dNTPs、 Taq
DNA聚合酶、TaKaRa RT2PCR试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自 TaKaRa公司 ; X2gal、 IPTG购自
Promega公司 ; B ioFlux总 RNA提取试剂盒购自 B ioer Technology有限公司 ; 50 bp DNA ladder购自天
为时代公司 , 其它试剂均为国产分析纯。
RNA提取采用 B ioFlux总 RNA提取试剂盒并按其使用说明操作 , 用 112% 琼脂糖凝胶电泳进行
检测。按照 TaKaRa RT2PCR试剂盒的方法对总 RNA进行反转录。用 30对 SRAP引物对不育系和保持
系花蕾的 cDNA进行扩增。10μL PCR反应体系 : dNTP 012 mmol·L - 1、Mg2 + 115 mmol·L - 1、 Taq
DNA 聚合酶 1 U 、 cDNA 2 pmol·μL - 1、引物 013μmol·L - 1、1 ×缓冲液。程序 : 94℃ 5 m in; 94℃
1 m in, 35℃ 1 m in, 72℃ 115 m in, 5个循环 ; 94℃ 1 m in, 50℃ 1 m in, 72℃ 115 m in, 37个循环 ;
72℃ 7 m in。扩增产物在 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离 , 银染检测。切下凝胶中 cDNA差异
条带及差异泳道上的相应空白区域 , 用灭菌双蒸水充分冲洗后 , 分别加入 60μL灭菌双蒸水 , 沸水浴
10 m in提取凝胶中的 cDNA。用该 cDNA水溶液作模板进行第 2次 PCR扩增 , PCR的引物组合和条件
与原 PCR相同。
将差异条带连接到 pMD192T克隆载体上 , 用热激法转化至大肠杆菌 E1coli JM109中 , 利用含 100
mg·L - 1氨苄青霉素的 LB固体培养基筛选转化子并酶切鉴定插入片段 , 委托上海英骏公司测序 , 利
用 NCB I网站上的 B last软件在 GenBank中进行序列相似性分析。
2　结果与分析
211　总 RNA提取和 PCR扩增分析
提取的总 RNA经琼脂糖凝胶电泳显示质量良好 , 符合合成 cDNA的要求。
用 30对引物组合对不育系和保持系花蕾的 cDNA进行 SRAP扩增 , 对扩增图谱 (图 1) 分析发
现 : 30对引物共扩增出 612条带 , 其中引物组合 EM5 /ME3 (5′2TGAGTCCAAACCGGAAT23′/5′2GTTA2
ATTCGTACGCAGTC23′) 在保持系中稳定扩增出 1条特异片段 , 长约 280 bp, 将这条特异片段标记为
BcCMS1; 引物组合 EM2 /ME2 ( 5′2GACTGCGTACGAATTTGC23′/5′2GCTCCGGTTTGGACTCA23′) 在不
育系中 4次重复均扩增出一条特异条带 , 条带长约 220 bp, 标记为 BcCMS2 (图 2)。
212　差异片段的克隆及序列分析
将 BcCMS1和 BcCMS2回收转化大肠杆菌 , 相同条件下 PCR扩增电泳检测结果表明已成功克隆。
测序结果显示 : BcCMS1和 BcCMS2序列长度分别为 270和 216 bp (图 3、4)。在 GenBank中用 B lastx
进行同源性比对 , 发现 BcCMS1与大白菜细胞生成相关染色体 ( GenBank登录号为 AC15533511) 的
19个氨基酸有 63%的相似性。BcCMS1为保持系较不育系多出的特异带 , 可初步推测不育系花蕾缺
失的这条 mRNA条带与小孢子发育相关。将 BcCMS2用 B lastn在 GenBank中比对后发现该序列与芥蓝
抑制开花的基因 FLC3 ( GenBank登录号为 AM23151811) 部分碱基有 88%的相似性。BcCMS2为不育
系特有而保持系缺失的 cDNA特异条带 , 该结果显示此条带也可能与雄性不育相关。BcCMS1、BcC2
MS2的核酸序列在 GenBank中的登录号分别为 DQ914921、DQ914922。
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　2期 邓晓辉等 : 白菜 Pol胞质雄性不育系和保持系蕾期基因表达差异的 SRAP分析 　
图 1　不育系和保持系 cD NA SRAP扩增图谱
M: 50 bp DNA ladder; A: 不育系 ; B: 保持系。
F ig. 1　The SRAP am plif ied prof iles of cD NA of A line and B line
M: 50 bp DNA ladder; A: CMS line; B: Maintainer line.
图 2　不育系和保持系的基因表达特异片段
M: 50 bp DNA ladder; A: 不育系 ; B: 保持系 ; a的引物组合为 EM5 /ME3; b的引物组合为 EM2 /ME2。
F ig. 2　The spec ia l fragm en ts of gene d ifferen t expression of A line and B line
M: 50 bp DNA Ladder; A: CMS line; B: Maintainer line. The p rimers combination of a is EM5 /ME3.
The p rimers combination of b is EM2 /ME2.
图 3　BcCM S1的核酸序列
加粗部分为引物序列。
F ig. 3　The nucleotide sequence of the BcCM S1
The parts of black were the sequence of the p rimers.
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图 4　BcCM S2的核酸序列
加粗部分为引物序列。
F ig. 4　The nucleotide sequence of the BcCM S2
The parts of black were the sequence of the p rimers.
3　讨论
BcCMS1为不育系所缺失 , 与大白菜控制细胞生成相关染色体相似性较高。不育系在花蕾中未表
达其与控制细胞生成的相关基因 , 可能最终导致不育系孢原细胞不能正常分化造成雄性不育。BcC2
MS2为不育系所特有 , 且与芥蓝抑制开花基因高度相似。不育系在蕾期表达与抑制开花相关的基因 ,
此基因可能阻碍不育系孢原细胞正常分化造成雄性不育。这两个差异表达片段是核基因的表达产物 ,
一个只在不育系蕾中表达 , 另一个只在保持系花蕾中表达 , 说明细胞质雄性不育系和保持系核基因表
达存在差异 , 而本试验的不育系和保持系核相同而细胞质不同 , 因此这可能是细胞质基因影响核基因
表达的结果。该结果进一步显示细胞质雄性不育系和保持系不仅在细胞质的线粒体和叶绿体基因组上
存在差异 , 而且在核基因的表达上也存在差异 , 也进一步证明了细胞质雄性不育是核质互作的结果。
本研究结果与娄平等 (2003) 在甘蓝显性核不育和凌杏元等 ( 2000) 在水稻细胞质雄性不育的研究
结果相似。关于特异 cDNA片段与雄性不育的关系现在已有不少研究 , 本试验中所获得的只是差异片
段 , 还需对其全长、表达特性和功能作进一步的分析和鉴定。
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