全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 213 - 216
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 12; 修回日期 : 2006 - 11 - 21
基金项目 : 天津市科技攻关项目 (05YFGZNC01302)
与黄瓜抗炭疽病相关基因连锁的 AFL P标记的筛选
王惠哲 1 , 李淑菊 1 , 刘秀峰 2 , 李　平 1 , 霍振荣 1 , 管　炜 1
(1天津科润黄瓜研究所 , 天津 300192; 2南开大学化学学院 , 天津 300071)
摘 　要 : 以黄瓜抗炭疽病母本 66和感炭疽病父本 A18及其 F2代分离群体为试材 , 采用 BSA法和 AFLP
技术建立了对炭疽病的抗病组和感病组 , AFLP引物组合 E24M48在抗感组间表现多态性 , 且呈共显性。经
220个 F2单株分析 , 在高抗单株和高感单株中分别仅扩增出 251 bp和 245 bp的特异片段 , 而在中间类型个
体中同时扩增出了该两个特异片段。连锁值测定结果表明 , 该特异带与黄瓜炭疽病抗病相关基因紧密连锁 ,
距离为 21727 cM。测序结果显示 , 该两个片段的大小分别为 251 bp和 245 bp, 并且两个片段的差异在于两
个 “TCT”重复序列 (6个碱基 ) 的插入或缺失。
关键词 : 黄瓜 ; 炭疽病 ; 抗性相关基因 ; AFLP
中图分类号 : S 64212 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2007) 0120213204
AFL P M arkers of Cucum ber An thracnose Resistance2rela ted Gene
WANG Hui2zhe1 , L I Shu2ju1 , L IU Xiu2feng2 , L I Ping1 , HUO Zhen2rong1 , and GUAN W ei1
(1 Tianjin Kernel Cucum ber R esearch Institu te, T ianjin 300192, Ch ina; 2 College of Chem istry, N ankai U niversity, T ian jin
300071, Ch ina)
Abstract: W ith a F2 population derived from 66 ×A18 asmaterials, polymorphism between resistant and
suscep tible bulk of cucumber anthracnose were studied using BSA method and AFLP technology. A codom i2
nant AFLP marker, E24M482251 bp /245 bp, was screened. The resistant and suscep tible F2 p lants possessed
the 251 bp and the 245 bp fragment, respectively, and the m id2p lants owned the two fragments. The AFLP
marker was closely linked with the cucumber anthracnose resistance related gene, and the genetic distance be2
tween the marker and gene was 21727 cM. Fragements sequencing of the codom inant AFLP marker indicated
that their length were 251 bp and 245 bp, respectively. The difference of the two fragements lied in the insert2
deletion of two“TCT”repeat sequences.
Key words: Cucumber; Anthracnose; Resistance2related gene; AFLP
近年来 , 我国黄瓜炭疽病 (Colletotrichum lagenerium ) 有所发展 , 特别是保护地 , 为害越来越严
重。炭疽病已成为保护地黄瓜的重要病害 , 分布广泛 , 发生普遍。黄瓜炭疽病菌为半知菌亚门真菌 ,
可人工培养 , 因此可采用苗期抗病性鉴定技术对材料进行筛选 , 但该病的发生易受环境影响。RFLP、
RAPD、SSR和 AFLP等分子标记技术的问世 , 为分子育种提供了一条新的途径。AFLP技术更以其带
纹丰富、DNA用量少、灵敏度高、快速高效等优点而得到广泛应用 (陶文静 等 , 1999; 陈大洲 等 ,
2002; 韩和平 等 , 2004)。天津科润黄瓜研究所已获得与黄瓜白粉病抗病相关基因紧密连锁的分子标
记 , 并成功转换成 SCAR标记 (张桂华 等 , 2004)。但目前尚未见与黄瓜炭疽病抗性相关基因连锁的
分子标记研究。本研究在对种质资源苗期抗病性鉴定的基础上 , 以黄瓜抗炭疽病母本 66 (来源于津
春 4号母本 ) 和感炭疽病父本 A18 (为一商品瓜自然授粉后多代选择的自交系 ) 及其组合的 F2代分
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
离群体为试材 , 采用分离群体分组分析法 (BSA) 和 AFLP技术 , 筛选与黄瓜炭疽病抗性相关基因连
锁的 AFLP标记 , 为分子标记辅助抗炭疽病育种奠定基础。
1 　材料与方法
供试材料为黄瓜抗炭疽病母本 66和感炭疽病父本 A18及其 F2代分离群体 , 均由天津科润黄瓜研
究所提供。所用炭疽病菌由南开大学元素所提供。试验在天津科润黄瓜研究所生物技术室完成。
AFLP引物在上海生工生物工程公司合成 , TaqDNA聚合酶、dNTP等试剂均购自大连宝生物公司。F2
分离群体的构建及抗病性鉴定 : 田间种植两亲本及其 F2群体 , 正常管理。第 2真叶时 , 采用喷雾法
进行炭疽病苗期接种鉴定。分别于接种后 5、7、15 d调查统计发病情况。将 F2单株分为高抗、中间
类型和高感 3个级别。
DNA提取及 AFLP分析体系 : 采集亲本及 F2第 1片真叶 , 用 CTAB法单株提取 DNA。AFLP分析
体系参照 Vos等 (1995) 的方法。扩增产物在 5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 , 银染检测。分子标
记筛选和验证 : 采用在双亲间产生多态性的引物组合对抗病组和感病组单株进行 AFLP扩增 , 能在两
组间扩增出差异条带的引物组合即初步认为与黄瓜炭疽病抗性相关基因连锁。用该引物组合分别对组
外的其它 F2单株以及育种和生产上的炭疽病抗感高代自交系进行扩增 , 进一步确认所筛选到的标记。
目标片段的回收采用煮沸法 , 回收片段由北京三博远志生物公司进行测序。
2 　结果分析与讨论
211　黄瓜炭疽病的抗感性鉴定
黄瓜炭疽病的抗病性鉴定受环境影响较大 , 同时又不可避免地存在人为误差。为了将误差减小到
最小限度 , 构建了 220个 F2群体 , 并且分别在接种后 5、7和 15 d进行炭疽病发病情况调查。供测父
母本均 30株 , 鉴定结果母本 66高抗 30株 ; 父本
A18高感 30株 ; 220株 F2中高抗个体 66株 , 中间
类型个体 109株 (抗病性表现偏向于感病亲本 ) ,
高感个体 45株 , 经适合性测验基本符合 1∶2∶1的
分离比例。说明黄瓜对炭疽病的抗性是由单隐性基
因控制的 , 感病相对抗病为不完全显性。
Barnes和 Epp s (1952) 的研究结果说明抗性
是多基因控制的 , 而且还可能有修饰基因的作用。
Abul2Hayja等 (1978) 的研究认为 SC19B中存在
抗炭疽病生理小种 1号的隐性基因 cla。得到以上
不同的研究结果可能与所采用的材料的遗传背景
有关。
212　黄瓜抗炭疽病相关基因分子标记的筛选和
F2单株验证
采用 AFLP引物 ( E + 2) / (M + 3) 在抗感
亲本间表现多态性的引物 43对 , 对两亲本以及
F2抗感组和中间类型单株进行 PCR扩增 , 获得了
一个共显性标记 , E24M482251 bp /245 bp (图
1)。抗病亲本和抗病组单株只有 251 bp的特异片
图 1　获得的共显性标记 E24M 48
M: DNA ladder; P1 : 抗病亲本 ; P2 : 感病亲本 ; 1～5: 抗病组
单株 ; 6～10: 感病组单株 ; 11～15: 中间类型单株。
F ig. 1　Codom iman t marker E24M 48
M: DNA ladder; P1 : Resistant parent; P2 : Suscep tible parent;
1 - 5: Resistant p lants; 6 - 10: Suscep tible p lants;
11 - 15: Medium p lants.
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　1期 王惠哲等 : 与黄瓜抗炭疽病相关基因连锁的 AFLP标记的筛选 　
段 , 感病亲本和感病组单株只有 245 bp的特异片段 , 而中间类型单株则同时具有该两个特异片段。
所用引物 E24M48的碱基序列为 : E24: 5′2GAC TGC GTA CCA ATT CTC23′; M48: 5′2GAT GAG TCC
TGA GTA ACA C23′。
用引物组合 E24M48对组外其它 F2单株进行了验证 , 结果显示 , 在 220个 F2单株的验证中 , 66
个表现抗病的单株中有 1株发生了交换 , 产生了与感病单株相同的带型 ; 45个感病单株中有 5株发
生了交换 , 产生了与抗病单株相同的带型。由此计算 , 所筛选到的标记与目标基因 ———炭疽病抗性相
关基因紧密连锁 , 遗传距离为 21727 cM。图 2为引物组合 E24M48在部分 F2单株中的验证。
图 2　引物组合 E24M 48在部分 F2 单株中的验证
M: DNA ladder; P1 : 抗病亲本 ; P2 : 感病亲本 ; 1～9: 抗病单株 ;
10～19: 感病单株 ; 20～30: 中间类型单株。
F ig. 2　Va lida tion of AFL P pr im er E24M 48 in som e of F2 plan ts
M: DNA ladder; P1 : Resistant parent; P2 : Suscep tible parent; 1 - 9: Resistant p lants;
10 - 19: Suscep tible p lants; 20 - 30: Medium p lants.
213　目标片段的回收和测序
采用煮沸法将两个片段从银染胶上回收。图 3为目标条带回收、再扩增后 1%琼脂糖凝胶电泳检
测结果。可以看出 , 回收的片段带型清晰、整齐 , 片段大小在 200～300 bp之间。
图 3　回收的目标片段再扩增产物的琼脂糖电泳
M. DNA ladder; 1～5: 245 bp片段 ; 6～10: 251 bp片段。
F ig. 3　Am plif ica tion of target fragm en t der ived from silver2sta ined gel
M. DNA ladder; 1 - 5: Fragment of 245 bp; 6 - 10: Fragment of 251 bp.
测序结果显示 , 抗病带 , 大小为 251 bp, 感病带为 245 bp, 二者的差异在于两个 “TCT”重复序
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列 (6个碱基 ) 的插入和缺失 (图 4)。
图 4　与黄瓜抗炭疽病基因连锁的 AFL P标记片段的部分碱基序列
阴影部分为差异片段。
F ig. 4　Ba se sequence of the AFL P marker fragm en t of an thracnose2resistan t gene
The different parts are in the shadow.
采用 B last软件进行查询 , 未发现与该两个片段同源性高于 15%的序列 , 说明该两个片段为新发
现的黄瓜 DNA序列。与所测序列有关的内容已申报国家发明专利 (专利申请号 : 20061001335415)。
目前已将该标记转化为更为稳定的 SCAR标记 (上游引物序列 : 5′2CGTTTACTTCTCTCCCATTTC23′;
下游引物序列 : 5′2GGTTAGTGAGACGAAGGGA23′)。
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