全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 125 - 130
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 19; 修回日期 : 2006 - 10 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (20370975) ; 浙江省重大科技项目 (2005C12019202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jshcao@zju1edu1cn)
RNA i沉默 B cM F3基因对菜薹花粉发育的影响
刘乐承 1, 2 , 向　 1 , 曹家树 13
(1 浙江大学蔬菜研究所 , 杭州 310029; 2 长江大学园艺园林学院 , 湖北荆州 434025)
摘 　要 : 根据从白菜 (B rassica cam pestris ssp. chinensis var. comm unis) 核雄性不育两用系中分离到编码
果胶甲酯酶 ( PME) 的雄性不育相关基因 B cM F3 cDNA序列设计引物 , 从白菜花蕾 cDNA中扩增出一短一
长两个片段 , 分别反向和正向连接至双元载体 pB I12 l中 , 得到了 RNA i (RNA interference) 植物表达载体
pB I2B3R, 并导入农杆菌 LBA4404菌株中 ; 通过组织培养途径转化菜薹 (B. cam pestris ssp. chinensis var.
parach inensis) , 分子检测证明 B cM F3片段单拷贝整合到转基因菜薹的基因组中 ; 50%转基因菜薹植株的花
粉畸形 , 花粉离体萌发率为 3213% , 出现畸形花粉植株的花药 PME活性降低了 1315%。这一结果从转基
因植株后代的表型和酶活性上证明 , 采用 RNA i技术沉默 B cM F3基因 , 可能通过影响 PME活性而引起转基
因菜薹植株部分花粉的败育 , 从而证明 B cM F3基因在普通白菜和菜薹等植物的花粉发育中起着重要作用。
关键词 : 白菜 ; 菜薹 ; 花粉
中图分类号 : S 63415　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120125206
Effects of S ilenc ing B cM F 3 by RNA i on Pollen D evelopm en t of Flower ing
Ch inese Cabbage
L IU Le2cheng1, 2 , X IANG Xun1 , and CAO J ia2shu13
( 1 Institu te of V egetable Science, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, China; 2 College of Horticulture and Gardening, Yang tze
U niversity, J ingzhou, Hubei 434025, China)
Abstract: In an effort to study the molecular mechanism of genic male sterility in p lants, B cM F3 gene
that encodes a pectin methylesterase ( PME) was isolated from the fertile B line of Chinese cabbage2pak2choi
(B rassica cam pestris ssp. ch inensis var. comm un is, syn. B. rapa ssp. ch inensis var. comm un is) p reviously.
In the p resent paper, p rimers were designed based on the cDNA sequence of B cM F3, and a 458 bp fragment
and a 538 bp fragment were amp lified from the cDNA of flower buds of Chinese cabbage2pak2choi. These two
fragments were introduced into binary vector pB I121 in antisense orientation and sense orientation respectively,
and the generated RNA interference (RNA i) vector was then mobilized into A grobacterium tum efaciens strain
LBA4404. The A. tum efaciens harboring the B cM F3 fragment was transformed to flowering Chinese cabbage
(B. cam pestris ssp. ch inensis var. parach inensis) via tissue culture. The pollen grains from app roximately
50% of RNA i p lants exhibited abnormal shapes, and only 3213% of pollens from RNA i p lants germ inated nor2
mally. The PME activity of the anther from RNA i p lants with abnormal pollens decreased by 1315%. These
results showed that functional interrup tion of B cM F3 by RNA i resulted in pollen abortion in flowering Chinese
cabbage, which p robably caused by the decrease of PME activity. The study suggests that the p roduct of
B cM F3 gene p lays an important role during pollen development in Cruciferae crop s such as flowering Chinese
cabbage and Chinese cabbage2pak2choi.
Key words: Chinese cabbage2pak2choi; B rassica cam pestris; Flowering Chinese cabbage; Pollen
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植物雄性不育发生主要在花粉和花药 , 在花粉发育过程中表达的约 20 000个基因中 , 约 10%是
花粉特异 (W illing et al. , 1988)。20多年中 , 从 28个以上物种中分离到了 150个以上花粉特异表达
基因 ( Twell, 2002)。研究花粉中特异表达的基因在花粉发育过程中的功能 , 对于揭示植物花粉发育
和雄性不育的分子机理具有重要意义。已有报道 , 以多代测交的核雄性不育两用系白菜 [ B rassica
cam pestris ssp. ch inensis (L. ) Makino var. comm unis Tsen et Lee, syn. B. rapa ssp. ch inensis var. comm u2
n is ] 为材料 , 采用 cDNA2AFLP技术和 RACE技术相结合 , 从其可育株花蕾中克隆到了雄性不育的相
关基因 B cM F3 (王永勤 等 , 2004) , 它编码一种果胶甲酯酶 ( PME)。从甘蓝型油菜、矮牵牛、玉
米、苜蓿和烟草等作物中也先后克隆分离到了花粉和 (或 ) 花粉管特异的 PM E基因 , 其中有的已经
被证明在花粉的发育或花粉管伸长中起作用 (Mu et al. , 1994; W akeley et al. , 1998; Rodríguez2
L lorente et al. , 2004; Bosch et al. , 2005)。因此 , B cM F3很可能与花粉的发育有关。在植物中能够通
过 hpRNA 结构转化诱导序列特异性 RNA的降解 , 使靶基因沉默 ( Fire et al. , 1998)。我们从菜薹
[B. cam pestris ssp. ch inensis var. pa rach inensis (Bailey) Tsen et Lee ] 植株中扩增得到了 B cM F3基因的
同源片段 , 表明其同源基因的存在 , 因而沉默菜薹基因组中的这个基因 , 有可能产生功能丧失或降低
突变。本研究构建了 B cM F3基因的 RNA干涉 (RNA i, RNA interference) 植物表达载体 , 并通过组织
培养途径转化菜薹 , 分析转基因植株的花粉形态、萌发率及相关酶活性 , 以期为了解 B cM F3在花粉
发育过程中的生物学功能 , 阐明白菜核雄性不育的机理提供依据。
1　材料与方法
111　植物材料及表达载体的构建
材料为田间种植的白菜核隐性雄性不育两用系 ‘Bajh97201A /B’植株和 ‘油青 45菜薹 ’无菌苗
(余小林 等 , 2001)。采用 Trizol法提取白菜可育株花蕾的总 RNA , 并用 SMARTTM PCR cDNA Synthe2
sis Kit合成 cDNA。根据 B cM F3基因的 cDNA序列 (王永勤 等 , 2004) , 设计能扩增 458 bp和 538 bp
的序列引物 , 设计时依据植物双元载体 pB I121上的多克隆酶切位点 , 两对引物 ( 5′2GCT GGA TCC
ACA CAC TAT ACG TCA ACA ACG23′, 5′2GCT TCT AGA AGA CCT AGC GAC CTT AGC C23′; 5′2GCC
GGA TCC ATT AGG ACA CCA AGC TGT23′, 5′2TAA CCC GGG AGA CCT AGC GAC CTT AGC C23′) 分
别含有限制性内切酶位点 B am H I和 X ba I、B am H I和 Sm a I。以白菜可育株花蕾 cDNA为模板分别进
行 PCR扩增 , 两个扩增产物采用凝胶电泳分离回收后 , 分别与 pGEMµ 2T Easy Vector连接 ; 随后将
B cM F3片段从 T2Easy Vector质粒上酶切下来 , 再通过酶切位点 X ba I和 B am H I、B am H I和 Sm a I分
别反向和正向插入双元载体 pB I121质粒中 , 所构建 RNA i载体的阳性克隆命名为 pB I2B3R, 并采用
“三亲杂交”法将 pB I2B3R质粒导入农杆菌菌株 LBA4404 (王关林和方宏筠 , 2002)。
112　菜薹的遗传转化
切取 4～5 d苗龄无菌苗的带子叶柄的子叶作为外植体 , 将子叶柄插入预培养基中 2～3 mm预培
养 3 d后 , 在 RNA i载体 pB I2B3R的农杆菌菌液中浸泡 10～15 m in, 吸干多余的菌液 , 平放在共培养
基上培养 2 d后 , 转移插植于含卡那霉素的分化培养基上进行分化培养和筛选 , 分化出的不定芽每 20
d继代 1次。当不定芽长至 115～215 cm时转入生根培养基诱导生根。2～3周后移植于盛有中性多元
素化营养土的营养钵中 , 正常管理直至开花。预培养基和共培养基均为 1 /2倍浓度 NH4+的 MS + 2%
蔗糖 + 018%琼脂 + 4 mg·L - 1 BAP + 1 mg·L - 1 NAA + 715 mg·L - 1 AgNO3 ; 分化培养基为共培养基
+ 10 mg·L - 1 Kan + 300 mg·L - 1氨苄青霉素 (Amp ) ; 生根培养基为 MS + 012 mg·L - 1 NAA + 2%蔗
糖 + 018%琼脂 + 10 mg·L - 1 Kan。pH值均为 518。
113　转基因植株的分子检测及花粉的形态学和细胞学观察
参照曹家树等 (1995) 的方法提取菜薹 KanR苗及其阴性对照植株基因组 DNA。参照 GUS基因内
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部 371 bp的 u idA片段两端序列设计 PCR引物 , 引物的序列为 5′2ACG TCC TGT AGA AAC CCC AAC
C23′和 5′2TCC CGG CAA TAA CAT ACG GCG T23′。以抗性再生植株的基因组 DNA为模板进行 PCR扩
增。对 PCR检测呈阳性的再生植株进一步进行 Southern blotting杂交检测。将利用 PCR检测中的引物
从 pB I121中扩增出的 GUS片段 , 用 Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2试剂盒进行 32 P dCTP标
记作为探针。用 EcoR I消化的菜薹 KanR苗及其阴性对照植株 (非转化组培植株 ) 基因组 DNA , 采用
毛细管转移法转移至尼龙膜上 , 在 65℃下进行 DNA杂交 ( Sambrook & Bussell, 2001)。取刚开放的
花朵 , 将花粉涂在贴有双面胶的金属载物台上 , 喷金后扫描电镜观察花粉的形状、饱满程度及表面网
纹。于上午 9时左右取花粉点涂在预先煮沸并点滴在载玻片上的培养基中 , 置于黑暗和 25℃恒温条
件下保湿培养 , 6 h后在显微镜下统计萌发率 , 以花粉管长度超过花粉粒直径 1 /2为萌发花粉。培养
基为 15%蔗糖 + 014 mmol· L - 1 CaCl2 + 014 mmol· L - 1硼酸 + 1%琼脂粉 ( Carpenter et al. ,
1992)。在载玻片上滴加 1 滴 011% 的苯胺蓝 ( Aniline ) 溶液 ( 011% 水溶性 Aniline 在 011
mmol· L - 1 K2 HPO4 2KOH缓冲液中 , pH 11) , 取花药在苯胺蓝溶液中挤出花粉 , 盖上盖玻片 , 通过
荧光显微镜在紫外激发光下观察花粉活力。按照 J iang等 (2005) 的方法测定果胶甲酯酶活性。
2　结果与分析
211　植物表达载体的构建及鉴定
RNA i植物表达载体 pB I2B3R以双元载体 pB I121为基础而构建 , 它的表达框架为 CaMV 35S启动
子 - cDNA - NOS终止子 , 并含有 N PT Ⅱ基因和 GUS 基因。RNA i载体 pB I2B3R 中一短一长两个
B cM F3基因的 cDNA片段分别反向和正向插入 , 由于短片段从长片段一端开始互补于长片段 , 预期转
录后可能形成发夹 RNA ( hpRNA) 结构 (图 1)。
图 1　RNA i载体 pB I2B3R的结构示意图
A. 464 bp和 544 bp 的两个片段分别反向和正向连接 , 方框中的箭头表示片段的方向 , 阴影部分表示两个片段的互补区域 ;
B. 预期由结构 (A) 转录形成的带单链有环的双链 dsRNA。
F ig. 1　Schema tic gene con structure and pred icted RNA con structure of pB I2B3R
A. 464 bp and 544 bp fragment were linked in the antisense and sense orientations which were driven by the CaMV 35S p romoter,
and the arrows in the pane indicate the orientations, and hatched regions indicate comp lementary sequences;
B. The p redicted dsRNA with a single2stranded loop generated by A.
　　采用 Xba I + B am H I、B am H I + Sm a I和
X ba I + Sm a I对 pB I2B3R进行酶切 , 能分别切出
460 bp、540 bp和 1 010 bp大小的片段 (图 2)。
说明 RNA i载体 pB I2B3R已正确构建。
212　转基因植株的获得
以 4～5 d苗龄的菜薹苗带柄子叶为外植体 ,
经预培养和共培养后转入分化培养 , 约 20 d后 ,
由于抗生素的存在 , 极少数外植体切口处分化出
绿色不定芽 , 共得到 25个抗性芽 , 转化效率为
01698% (25 /3578)。不定芽继代培养至高 2 cm 图 2　RNA i表达载体 pB I2B3R的酶切验证电泳图F ig. 2　Electrophoresis of d igested RNA i expressionvector pB I2B3R
1. Xba I +B am H I; 2. B am H I + Sm a I; 3. Xba I + Sm a I.
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左右时 , 在生根培养基上诱导根的分化 , 生根后的抗性苗移植于营养钵中生长 (图版 , A～H ) , 移
栽 12株的成活率为 100%。
213　转基因植株的分子鉴定
采用基于 GUS基因序列的特异引物 , 对获得的 12株载体转化的抗性再生植株的基因组 DNA进
行 PCR扩增 , 从 8313% (10 /12) 的植株中均扩增到约 370 bp的单一条带 , 而对照非转化再生植株
中则没有扩增到任何条带 (图 3, A )。初步证明了外源基因的插入。
以 32 P dCTP标记的 GUS基因片段为探针 , 与 PCR阳性的菜薹转化再生 KanR植株、非转化再生植
株 (阴性对照 ) 和 pB I121质粒 (阳性对照 ) DNA进行 Southern blotting杂交 , 阳性对照和 80%的转
化植株中均检测到了单一条带 , 而阴性对照植株中则没有检测到任何条带 (图 3, B )。该结果说明 ,
外源基因整合进了转基因植株基因组中 , 而且均为单拷贝插入。
图 3　菜薹转基因植株的分子检测
A. 转化植株的 GUS片段 PCR检测 ; B. 转化植株的 GUS片段 Southern检测。M. Marker;
P. 检测 pB I121质粒 (阳性对照 ) ; N. 检测非转基因植株 (阴性对照 ) ; 1～8. 检测转基因植株。
F ig. 3　M olecular conf irma tion of GU S in tran sgen ic plan ts of flower ing Ch inese cabbage
A . PCR amp lication of GUS fragments; B. Southern blotting detection of GUS fragments in transgenic p lants. M. Marker; P. Detection of
pB I121 p lasm id (positive control) ; N. Detection of non2transgenic p lant ( negative control) ; 1 - 8. Detection of transgenic p lants.
214　转基因植株花粉的形态及其离体萌发率和活力
菜薹转化再生植株与对照的花器官形态没有明显差异 , 但是电镜扫描观察结果显示 , 在转化植株
中 , 50%植株的花粉全部为畸形 , 表现为圆面包状、网纹不清晰并被一层物质包裹 , 而其余植株、对
照植株的花粉粒形态均正常。表明沉默 B cM F3基因可以导致转基因菜薹植株的花粉畸形。
花粉离体萌发结果显示 , 对照植株的花粉萌发率为 5815% , 花粉畸形的转基因植株的花粉萌发
率为 3213% (图版 , I、J) , 而无畸形花粉的转基因植株的为 5619% , 与对照十分接近。进一步用紫
外激发荧光显微镜观察苯胺蓝溶液中的花粉粒 , 转基因植株的花粉之间在外形上差别不大 , 但与对照
的椭圆形相比略小而趋近于圆形 , 有些花粉发出较强荧光 , 有些则仅能发出微弱的荧光 , 还有一些花
粉粒局部能发出荧光而难以确定它们是否具有生活力 (图版 , K、L)。结果表明 , 生活力检测与花粉
萌发试验结果吻合 , 而且生活力检测时花粉外形与电镜观察的结果一致。
215　转基因植株果胶甲酯酶活性的变化
为了了解沉默 B cM F3基因是否影响果胶甲酯酶 ( PME) 活性 , 测定了转基因菜薹植株及其非转
基因对照植株花药的 PME活性。结果显示 , 与对照植株相比 , 无畸形花粉的转基因植株花药的 PME
活性基本没有差别 , 而有畸形花粉的转基因植株花药的 PME活性降低了 1315%。表明沉默 B cM F3基
因影响有畸形花粉的转基因植株花药中 PME活性。
3　讨论
本研究采用 RNA i技术沉默 B cM F3基因导致了花粉畸形和花粉萌发率的降低 , 即部分花粉的不
育 , 而这种不育可能是沉默 B cM F3基因使 PME活性降低所引起的 , 这一结果从转基因植株的表型和
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酶活性上证明 , B cM F3在白菜和菜薹等植物的花粉发育中起着重要作用。应该注意的是 , 本研究只
得到了部分不育的转基因植株 , 说明白菜花粉发育过程及其雄性不育的发生是复杂的 , 要完全揭示其
机理还需要深入细致研究。
前人的研究表明 , PME在植物体内起催化果胶脱甲酯的作用。成熟 PMEs结合进细胞壁后 , 可能
有不同的作用方式导致细胞壁硬化或细胞壁松弛的效果 (Bosch et al. , 2005)。根据扫描电镜观察到
的花粉略缩小的结果 , 推测 B cM F3的基因产物可能在白菜类作物中起松弛花粉细胞壁的作用 , 因而
沉默 B cM F3使花粉壁硬化从而限制花粉形态的正常发育。与前人的结果相比 , 本研究中 RNA i没有达
到文献所报道的效率 , 这可能与所构建载体的结构有关。Sm ith等 (2000) 的研究表明 , 在构建载体
时 , 正义序列和反义序列间的间隔序列决定着 RNA i的效率 , 采用正义内含子序列作为间隔序列 , 可
以为 DNA提供稳定性 , 而且 RNA转录本中预期自我互补的 hpRNA结构 , 却因为它在 mRNA加工前
被剪切掉而形成无环 ( loop) 的 hpRNA, 这种结构可以达到 96%以上的沉默效率 ; 而以反义内含子
或GUS基因序列作为间隔物 , 推测因它们不会被剪切掉而导致 hpRNA中环的存在 , 其沉默效率为 65%
～69%。本研究采用的间隔物是与反义片断不互补的正义片段中多出的编码序列 , 推测它也因为不会
被剪切掉而成为 hpRNA的环。这可能是本研究中 RNA i的效率不够高的原因。
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图版说明 : 农杆菌介导的通过组织培养途径的菜薹转化 ( A～H) 及转基因植株的花粉萌发与活力检测 ( I～L ) A. 无菌苗 ; B预培
养 ; C. 共培养 ; D. 分化培养 ; E. 抗性芽分化 ; F. 抗性芽继代与扩繁 ; G. 抗性芽生根 ; H. 抗性苗移植后开花 ; I. 非转基因植株 (对
照 ) 的花粉萌发 ; J. 转基因植株的花粉萌发 ; K. 非转基因植株 (对照 ) 花粉的活力检测 ; L. 转基因植株花粉的活力检测。
Explana tion of pla tes: A grobacterium 2m ed ia ted tran sforma tion of flower ing Ch inese cabbage v ia tissue cultrue ( A - H) , pollen germ i2
na tion and determ ina tion of pollen v igour of tran sgen ic plan ts ( I - L ) A. Sterile seedlings; B. Pre2culture; C. Co2culture; D. D ifferentia2
ting culture; E. D ifferentiation of resistant adventitious buds; F. Subculture and p ropagation of resistant adventitious buds; G. Root induction of
resistant adventitious buds; H. Growth and flowering of resistant p lant; I. The pollen germ ination of non2transgenic p lant ( control) ; J. The pollen
germ ination of transgenic p lants; K. Determ ination of pollen vigour of non2transgenic p lants ( control) ; L. Determ ination of pollen vigour of trans2
genic p lants.
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