全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 763 - 766
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 08; 修回日期 : 2007 - 02 - 28
基金项目 : 高等学校博士学科点专项基金项目 (20030307021) ; 国家 ‘863’项目 (2006AA10ZIC9)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@njau1edu1cn)
白菜抗霜霉病基因的 RAPD标记
冷月强 , 侯喜林 3 , 史公军
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095)
摘 　要 : 研究了与抗霜霉病基因紧密连锁的 RAPD分子标记 , 利用白菜抗病品种 014和感病品种 010
杂交的 F2群体 144个单株为材料 , 通过人工接种鉴定 , 采用高抗单株和高感单株分别构建抗、感病池 , 利
用 BSA法筛选了 560条 RAPD引物 , 其中引物 AY12在抗感病池中扩增出多态性片段 AY121238 , 通过 F2单
株验证后证明 AY121238与抗霜霉病基因紧密连锁 , 其遗传距离为 617 cM。
关键词 : 白菜 ; 霜霉病 ; RAPD标记 ; 遗传距离
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320763204
The RAPD M arkersL inked to D owny M ildew Resistan t Gene in Non2head ing
Ch inese Cabbage ( B rassica cam pestris ssp. ch inensis M ak ino)
LENG Yue2qiang, HOU Xi2lin3 , and SH I Gong2jun
(S tate Key L abora tory of C rop Genetics & Germ plasm Enhancem ent, N anjing A gricultural U niversity, N anjing 210095, China)
Abstract: The objective of this study was to identify RAPD ( Random Amp lified Polymorphic DNA )
markers for downy m ildew resistance in non2heading Chinese cabbage. RAPD2PCR ( Polymerase Chain Reac2
tion) analysis was conducted using BSA (Bulked SegregantAnalysis) of a segregating F2 population which has
144 individuals from a cross between 010 ( suscep tible) and 014 ( resistant). After perform ing RAPD2PCR a2
nalysis with 560 arbitrary 102mer p rimers and agarose2gel electrophoresis, only one RAPD marker AY121238
was identified to be linked to the resistant gene and was determ ined to be 617 cM from the resistant gene.
Key words: Non2heading Chinese cabbage; Downy m ildew; RAPD marker; Genetic distance
霜霉病 ( Peronospora pa rasitica ) 是白菜 (B rassica cam pestris ssp. ch inensis Makino) 的重要病害。
这种真菌性病害常引起白菜幼苗和成株叶片枯黄 , 导致产量降低 , 品质下降。一般以气温较低、湿度
较大的早春和晚秋发病较为严重 , 在气候潮湿冷凉地区和沿江、沿海地区易流行 (王连荣 , 2000;
何青 , 2001)。长江中下游地区 , 以秋播白菜受害较为严重 , 流行年份发病率达 80% ～90%。为了减
轻病害的发生 , 长期施用农药不仅污染环境 , 破坏生态平衡 , 也威胁到人们的身体健康。因此 , 抗霜
霉病一直是白菜的育种目标之一 , 而研究抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记 , 可提高选择的准确性和
效率 , 并能加速新品种选育进程。
国外学者对芸薹属蔬菜抗霜霉病遗传规律的研究主要集中在甘蓝、花椰菜和青花菜上。Natti等
(1967) 研究认为 , 甘蓝子叶期抗霜霉病性由单个显性基因控制 ; Moss等 (1988) 研究发现在花椰菜
上霜霉病是由 2～3个基因控制的 ; Carvalho和 Monteiro (1996) 在花椰菜上发现霜霉病是由两个主效
独立基因控制的 ; Hoser2Krauze等 (1995) 发现甘蓝 4～5片真叶期抗霜霉病性是由单个隐性基因控
制的 ; W ang等 (2001) 以来自抗病青花菜品种的 DH系为试材 , 研究发现 3～4叶期抗性由两个互补
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的显性基因控制 ; Coelho和 Montem (2003) 研究认为青花菜在成熟期抗霜霉病性是由单个基因显性
控制的。钮心恪 (1984) 对大白菜抗霜霉病性遗传进行了初步研究 , 认为大白菜苗期对霜霉病的抗
性属显性遗传 , 但没有提出用于抗性鉴定的霜霉病生理小种 , 当病原生理小种发生变化时 , 试材的抗
性可能会发生变化 ; 可见 , 目前对于大白菜霜霉病抗性遗传规律尚无定论。
关于与抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记研究 , Giovannelli等 (2002) 对青花菜在子叶期抗霜霉
病进行了研究 , 发表了第 1张与抗霜霉病基因连锁的连锁图谱 ; Farinhó等 ( 2004 ) 通过 AFLP、
RAPD及 ISSR等技术 , 寻找到了青花菜两个与抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记 OPK172980和
AT1CTA2133 /134, 其遗传距离分别为 311 cM和 316 cM。但白菜抗霜霉病的分子标记研究还未见报
道。
作者利用 M ichelmore等 (1991) 提出的 BSA方法筛选与白菜抗霜霉病紧密连锁的 RAPD分子标
记 , 为标记辅助选择提供理论基础。
1　材料与方法
试材为南京农业大学园艺学院白菜课题组提供的白菜抗病品种 014 (对其进行了多次的田间和人
工接种鉴定 , 其表现型均达到高抗和免疫 ) 感病品种 010 (在田间和人工接种鉴定时表现为高感甚至
死亡 ) 及其 F2群体。
病原菌由田间感病品种病叶上采集得到。RAPD随机引物购于上海生工公司 , dNTP、 Taq DNA
聚合酶均购于 Takara公司。
抗病鉴定及病害分级标准参照程永安和柯桂兰 (1995) 的方法。
DNA提取及检测采用本实验室改良的 CTAB法 (史公军和侯喜林 , 2004)。取新鲜幼嫩叶片 , 在
液氮中研磨成粉 , 移入 2 mL容积离心管中 , 加入 〔质量 ( g) ∶体积 (mL) = 1∶3, 65℃预热 〕CTAB
提取液 [ 2% CTAB、011 mol/L Tris2HCl (pH 810) , 20 mmol/L EDTA22Na (pH 810) , 015%β - 巯基
乙醇 ] , 快速混匀 , 65℃水浴 70 m in, 间隔 15 m in左右取出摇匀 , 加入等体积的氯仿 ∶异戊醇 (24∶1)
抽提 2次。加入等体积异丙醇 , 冰上静置 10 m in, 离心 , 弃上清液 , 加入 500μL 70%乙醇洗净 , 真
空干燥 10 m in后 , 溶于 100μL TE, 再加入 10 mg/mL RNase 1μL, 37℃保温 1 h。4℃冰箱保存备用。
从 F2代中选取 10株病害级别为 0和 1的单株构建抗病池 , 8株病害级别为 7和 9的单株构建感
病池。
RAPD分析参照史公军和侯喜林 (2004) 的方法。 PCR反应体系为 : 在 25μL反应体系中 , 119
μL dNTP (215 mmol/ L) , 2μL Mg2 + (10 mmol/ L ) , 012μL Taq E ( 5 U /μL ) , 1μL DNA ( 25 ng/
μL) , 1μL 50%甘油 , 1μL Primer ( 10μmol/ L ) , 215μL 10 ×Buffer, 13μL H2 O。 PCR扩增程序
为 : 94℃变性 2 m in, 37℃退火 30 s, 72℃延伸 50 s, 2个循环 ; 94℃变性 45 s, 37℃退火 30 s, 72℃
延伸 50 s, 72℃延伸 5 m in, 18个循环 ; 94℃变性 45 s, 37℃退火 30 s, 72℃延伸 50 s, 72℃保温 5
m in, 25个循环。扩增产物加 5μL 溴酚蓝上样 , 于 114%的琼脂糖凝胶中电泳检测。特异片段由
Takara公司测序确定其大小。
2　结果分析与讨论
211　D NA提取及多态性引物的筛选
提取得到的 DNA经凝胶电泳检测 , 带型整齐一致 , 无降解现象 , 大多数的 DNA浓度都介于 20
～100μg/mL, 表明其能满足 RAPD反应的需要。
利用抗、感病池对 560条 RAPD随机引物进行筛选 , 结果发现 , 有 497条引物能在抗、感病池中
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　2期 冷月强等 : 白菜抗霜霉病基因的 RAPD标记 　
扩增出清晰的谱带 , 引物有效率达到 88175% , 但是只有 4条引物在抗、感病池间表现出多态性 , 其
中只有 1条 (AY12) 引物在抗病池中扩增出 1 238 bp的清晰谱带 , 而不出现在感病池中 , 经过多次
重复后能稳定出现。
图 1是引物 AY12在抗、感病池中扩增出 1 238 bp的清晰谱带图。
图 2为引物 AY12在部分抗、感病池单株中的扩增效果。
图 1　引物 AY12在抗、感病池中扩增结果
M: Marker; R: 抗病池 ; S: 感病池。
F ig. 1　PCR am plif ica tion w ith pr im er AY12 in resistan t and susceptible bulks
M: Marker; R: Resistant bulk; S: Suscep tible bulk.
图 2　引物 AY12在部分抗、感病池单株中扩增结果
M: Marker; R: 抗病单株 ; S: 感病单株。
F ig. 2　PCR am plif ica tion w ith pr im er AY12 in ind iv idua ls of resistan t and susceptible bulks
M: Marker; R: Resistant individual; S: Suscep tible individual.
212　白菜抗霜霉病基因与 RAPD标记的连锁分析
为了确定特异片段与抗病基因之间的遗传距离 , 用引物 AY12对 F2代分离群体 144个单株进行扩
增 (图 3) , 以此来分析 AY121238的分布。
结果发现 , 112株有特异带 , 32株无特异带 ; 有 9株发生了重组 , 其中 4株感病植株有特异带 ,
5株抗病植株无特异带。经过 MAPMAKER 310软件分析得出 , AY121238与抗霜霉病基因紧密连锁 , 其
遗传距离为 617 cM。
本研究结果为以后的白菜抗霜霉病遗传育种提供了理论基础 , 但是由于 RAPD标记的不稳定性 ,
还有待于研究将其转化为 SCAR标记。另外 , 有关白菜抗霜霉病分子标记辅助选择 , 在其他的标记手
段方面还有待于进一步研究。
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图 3　引物 AY12在亲本、抗感病池及 F2 单株中扩增结果
M: Marker; P1 : 抗病亲本 ; P2 : 感病亲本 ; R: 抗病池 ; S: 感病池 ;
R1 ～R10 ; 抗病单株 ; S1 ～S8 : 感病单株 ; 3 为发生交换的 F2 单株。
F ig. 3　PCR am plif ica tion w ith pr im er AY12 in paren ts, resistan t and susceptible bulks and F2 popula tion s
M: Marker; P1 : Resistant parent; P2 : Suscep tible parent; R: Resistant bulk; S: Suscep tible bulk;
R1 - R10 : Resistant individual; S1 - S8 : Suscep tible individual; 3 : Recombinant F2 individuals.
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