全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 681 - 686
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 11 - 12; 修回日期 : 2008 - 04 - 08
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA1001082427) ; 陕西省 13115工程项目 (2007ZDKG205)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lugangzh@1631com; Tel: 029287082131)
大白菜雄性育性转化相关β - 酯酶同工酶双向电泳
分析
张少丽 , 张鲁刚 3 , 张明科
(西北农林科技大学园艺学院 , 农业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室 , 陕西杨凌 712100)
摘 　要 : 以大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 (A ) 及其保持系 7311 (B ) 的小花蕾 (长度大约 115
mm) 为材料 , 活性凝胶电泳分析发现 : β -酯酶同工酶与育性转化关系密切 , 正常不育系比保持系缺少迁
移率为 01683、01718和 01742的 3条酶带 ; 随着育性的转化 , 酶谱接近保持系带型 ; 当育性回复到正常的
不育状态时 , 其同工酶酶谱也随之回复到正常的不育系带型。在低温处理后的不育系 TsCMS7311 (AT ) 育
性转化期间 , 回收与雄性育性转化相关的β -酯酶带区 , 双向凝胶电泳分析 , 结果表明 , 保持系 B和转化
后的不育系 AT的双向电泳图谱相似 , 第 1向 IEF电泳中各获得了 2条特异谱带 , 等电点在 717附近 ; 第 2
向 SDS电泳中各得到了 6种β -酯酶多肽 , 分子量在 55～62 kD之间。
关键词 : 大白菜 ; 育性转化 ; β -酯酶同工酶 ; 双向电泳
中图分类号 : S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520681206
Ana lysis ofβ2EST Isoenzym es Rela ted to Ster ility Changeover in Tem pera2
ture2sen sitive CM S of Ch inese Cabbage ( B rassica cam pestris L1 ssp1 pekin2
ensis) w ith Two2d im en siona l GEL Electrophoresis
ZHANG Shao2li, ZHANG Lu2gang3 , and ZHANG M ing2ke
(College of Horticulture, N orthw est A & F U niversity, Key Labora tory of Horticulture Plan t Germ plasm and Genetic Im provem ent,
M in istry of A gricu lture, Yangling, Shaanxi 712100, Ch ina)
Abstract: This paper studied the change ofβ2EST isoenzymes of small buds ( 115 mm or so) in the
thermo2sensitive CMS of Chinese cabbage (B rassica cam pestris L. ssp. pekinensis) TsCMS7311 (A ) and
maintainer line 7311 (B) during the fertility changeover. By one2dimensional GEL electrophoresis analyzing,
we found that there were threeβ2EST isoenzymes related to the sterility changeover closely, their Rf were
01683, 01718 and 01742 respectively. During sterile stamen changed into fertile in male sterile line (AT ) af2
ter low temperature treatment, theβ2EST zymogram s changed into maintainer linepis (B ) too; W hile fertile
stamen in male sterile line (AT ) came back into sterile, theβ2EST zymogram s came back into the natural
male sterile linepis (A ) again. Enriched theseβ2EST isoenzymes with electroelution, then separated and puri2
fied theseβ2EST isoenzymes with two2dimensional GEL electrophoresis, we gained six polypep tides, whose p I
values were about 717 and molecular mass were between 55 kD and 62 kD.
Key words: Chinese cabbage; sterile changeover; β2EST isoenzymes; two2dimensional GEL electropho2
resis
生物功能的主要执行者是蛋白质 , 蛋白质组能反映出生物系统所处的状态 , 如细胞周期的特定时
刻、分化的不同阶段 , 生长和营养状况 , 温度、应激和病理状态等都有其特异蛋白质组 , 因此蛋白质
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组学的研究可望提供精确、详细的有关细胞或组织状况的分子描述 (王大东和王嘉玺 , 2000)。
早在 1994年就有学者研究发现 , 酯酶同工酶与植物的育性表达密切相关 (李任华 等 , 1994; 刘
贵华 等 , 1994) , 通过对水稻 (李任华 等 , 1994)、油菜 (刘贵华 等 , 1994; 唐章林 等 , 1995;
于澄宇 等 , 2003)、白菜 (王淑华 等 , 1998; 张鲁刚和柯桂兰 , 1999; 张少丽 等 , 2005)、榨菜
(胡美华 等 , 2000) 等作物雄性不育的研究 , 得出同样的结论 , 但所有研究均停留在对酯酶同工酶
酶谱的比较水平 , 尚未出现从植物体中将酯酶分离纯化的报道。
作者在酯酶同工酶酶谱比较分析的基础上 , 采用单向 —双向电泳相结合的技术分离纯化了与大白
菜雄性育性表达关系密切的β -酯酶同工酶 , 为酯酶同工酶基因的克隆和功能研究奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
大白菜温度敏感不育系 A ( TsCMS7311) 及其保持系 B (7311) 由西北农林科技大学园艺学院白
菜研究室选育并提供。
该不育系是将甘蓝型油菜胞质雄性不育材料 77A的不育细胞质通过多代连续回交 , 转育到大白
菜品系 7311而育成的新型胞质雄性不育系。
不育系 A ( TsCMS7311) 属于低温可育类型 , 现蕾期低温 ( 6～12 ℃) 处理 3～9 d育性发生转
化 , 即由不育状态变成可育状态 ; 而经低温处理后再置于 20 ℃以上的生长环境下生长 , 其育性又可
回复到不育状态。
112　材料处理及取样方法
将不育系 A及其保持系 B的种子在培养皿中催芽 12 h, 将萌发种子放入 4 ℃冰箱中春化 30 d后 ,
播种于营养钵 , 在温室长光照下生长直到现蕾。
将 A系苗分为 2份 , 一份选出长势一致的置于 7 ℃左右、光照为 3 000 lx的光照培养箱中处理 9
d ( Zhang & Hao, 2001) , 编号为 AT , 处理后放回温室 (温度 20 ℃以上 , 自然光照 ) 继续生长 ; 另
一份 A系与 B系苗始终置于温室中生长。
AT系放回温室生长后 , 每天相同时间取 115 mm的小花蕾 , 以 A、B系中相同大小花蕾为对照 ,
用 pH 810的 Tris2HCl提取β2EST, 同时标记 AT系相同大小花蕾的单株 , 花期观察育性表现。
113　β2EST同工酶分析
采用单向活性凝胶分析系统比较 A系、B系、AT系小花蕾β2EST同工酶酶谱 , 分离胶浓度 7% ,
浓缩胶浓度 4% , 浓缩胶电泳电压 100 V, 分离胶电泳电压 260 V。
114　特异β2EST同工酶分析
由于 B系和 AT系小花蕾中β2EST酶谱迁移率为 01683、01718和 01742的特异酶带与迁移率为
01778的共同酶带间隔太近 , 无法逐条进行回收 , 因此将这几个条带作为一个区进行回收。
首先用单向活性凝胶制备系统 (不制备点样孔 , 直接于浓缩胶上上样 ) 分离 , 电泳完毕后切取
凝胶两边宽各 110 cm左右的胶条进行染色 , 染色后将着色胶条放回原处以指示目的条带的位置和范
围 , 然后根据染色胶条特异β2EST酶带指示的位置切取目的条带区段。A系相应带区的回收方法 : 采
用与 B系、AT系完全相同的电泳系统及参数 , 以迁移率为 01778的共同酶带为底线 , 向上切取与 B
系、AT系回收区带相同宽度的凝胶 (宽约 215 cm )。
将回收的酶带置于装有电极缓冲液的透析袋中 , 采用水平电泳槽电洗脱方法收集粗酶液 , 再经除
盐、真空冷冻干燥后得到粗酶干粉。
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　5期 张少丽等 : 大白菜雄性育性转化相关β -酯酶同工酶双向电泳分析 　
　　采用自制双向凝胶电泳系统对上述得到的粗酶干粉进行再分离纯化 , 具体操作参照郭志雄等
(2006) 的方法 , 略有改动。第 1向 IEF凝胶电泳完毕 , 经固定、染色后切取目的条带 , 置于第 2向
SDS凝胶上进行再分离。
IEF电泳完毕 , 按样品槽的宽度切出一竖条 , 其它凝胶进行固定、染色 , 然后根据着色胶上目的
谱带的位置在未染色胶条上切取含目的条带的凝胶 , 放入装有 200μL ddH2 O的离心管中 4 ℃冰箱过
夜 , 用精密 pH试纸测定等电点。分子量测定是用蛋白 Marker进行指示估测。
2　结果与分析
211　β2EST同工酶单向活性凝胶分析
不育系 (A系 ) 经低温处理后 (AT系 ) 转入温室 , 每天相同时间取样进行β2EST同工酶分析。
结果发现 , 处理后 1～2 d, 图谱仍同于不育系 (A系 ) 的带型 , 第 3～4天呈现出保持系的带型 , 第
5天开始至蕾期结束 , 图谱又重新呈现出不育系 (A系 ) 的带型。
图 1为育性转变时期的图谱。
由图 1, a和 b可见 , B系和低温处理后 3 d的 AT系β2EST同工酶均比 A系多出 3条带 , 其迁移
率分别为 01683、01718和 01742, 而且 B系与低温处理后 3 d的 AT系具有相似的β2EST同工酶酶谱。
花期育性观察表明 , 同期标记的 AT系花蕾所开的花为可育花 , 说明 A系经低温处理后发生了育性转
化 , 不仅其同工酶特征与保持系相似 , 育性也与保持系一致。
图 1, c表明 , 低温处理后 5 d的 AT系特异β2EST同工酶酶带逐渐消失 , 向正常 A系的酶谱状态
回复。AT系花期育性观察表明 , 同期标记的花蕾所开的花为不育花 , 说明 AT系发生了育性回复 (即
雄蕊又变成正常不育态 ) , 其同工酶酶谱也随之回复到正常不育系带型。上述现象表明β2EST同工酶
谱带的变化与大白菜雄性育性的育性转换关系密切。
图 1　育性转变期β2EST同工酶电泳图谱
a: A系及两个 B系单株 ; b: A系及两个低温处理后 3 d的 AT系单株 ;
c: A系及两个低温处理后 5 d的 AT系单株。
F ig. 1　β2EST zym ogram s dur ing the per iod of fertility changeover
a: A line and two p lants of B line; b: A line and two p lants of AT line dealt with lower temperature by 3 days;
c: A line and two p lants of AT line dealt with lower temperature by 5 days.
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212　特异β2EST同工酶多肽的分离纯化
对得到的β2EST同工酶粗酶干粉继续进行双向电泳分离。
图 2为第 1向 IEF胶电泳分离图谱。由图 2可以看出 , B系和育性发生转化的 AT系都有两条位置
相同的蛋白带 , 染色很深 , 分别编号 1、2和 3、4, 而 A系中在对应 1、3号蛋白带位置处无带 , 对
应 2、4号蛋白带位置处只有一条很弱的带 , 说明 1、3号和 2、4号蛋白与育性转换有关 , 其等电点
在 717左右。虽然在 A系、B系和 AT系的回收区间都包含迁移率为 01778的β2EST酶带 , 但图 2中 3
个系都未出现共有的、染色深浅比较一致的带 , 由此可以推断迁移率为 01778的β2EST同工酶蛋白可
能质量很少 , 或者包含在 2、4号蛋白带中。
从图 2中还可以看到 , 在 IEF的酸性端相同位置 , A系和 AT系各有两条带 , 编号分别为 5、6和
7、8, 这两条带在保持系中不存在 , 可能与雄性不育有关。
图 2　 B系、A系、AT系回收的β2EST
同工酶粗酶干粉的 IEF电泳图谱
F ig. 2　 IEF electropherogram ofβ2EST rude powder
recla im ed from B line, A line and AT line
图 3是第 2向 SDS电泳图谱 , IEF胶中 1、3号蛋白都分离出 5条相似的条带 , 其分子量分别为
5517、5711、5916、6015和 62 kD , 2、4号蛋白中仅分离出 1条带 , 其分子量为 5711 kD。可见在特
异β2EST酶带区段范围内包括 6种多肽。
图 3　第 2向 SD S聚丙烯酰胺凝胶图谱
1、2、3、4分别指图 2中 1、2、3、4号带。
F ig. 3　The SD S GEL electropherogram
1, 2, 3 and 4 are the bands of 1, 2, 3 and 4 in Fig. 2.
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　5期 张少丽等 : 大白菜雄性育性转化相关β -酯酶同工酶双向电泳分析 　
3　讨论
311　自制 IEF凝胶系统分离目的β2EST同工酶的优越性
蛋白质组学的研究是以双向凝胶电泳技术为核心的。目前此项技术多采用进口干胶条和专门的昂
贵设备进行第 1向电泳 , 耗时耗资 , 大大限制了蛋白质组学的研究。
本试验所采用的自制双向凝胶电泳系统很好的解决了上述问题 , 体现出自身独特的优势 : 选用不
同的梳子 , 一次等电聚焦电泳能够分析多个样品 , 省时高效 ; 第 1向电泳完毕进行染色 , 可直接比较
样品间的差异 , 使结果更直观 ; IEF电泳完毕经染色回收差异带进行第 2向电泳 , 增强针对性 , 减少
了电泳背景 , 使图谱一目了然 ; 在进行第 2向 SDS凝胶电泳时 , 可根据试验所需 , 调整第 1向胶条的
用量 , 更有利于测序或进行蛋白质其它性质研究。
312　第 2向 SD S电泳的凝胶浓度和长度对β2EST同工酶分离的影响
β2EST同工酶分子量和等电点都十分接近 , 尽量使用长板胶 , 并延长电泳时间能够改善分离的效
果。
313　β2EST同工酶粗酶粉的 IEF分离效果
按照β2EST同工酶的回收区段 , 产物应该包含 4种β2EST同工酶 , 并且预期 B系和 AT系双向电
泳图谱相近 , 均有别于 A系。但在图 2中 , 除了 1、2和 3、4号蛋白符合事先预期结果之外 , 在 IEF
的酸性末端 , A系和 AT系都出现了 2条保持系中所没有的等电点相似的蛋白 (5、6、7和 8号蛋白 ) ,
可能与不育系的不育基因表达有关 (具体功能有待于进一步研究 )。可见采用 IEF凝胶可以发现常规
同工酶电泳不能检测到的差异。
314　β2EST同工酶的双向电泳分析
目前对酯酶同工酶的分析多停留在单向活性凝胶图谱的分析水平 , 且普遍认为酯酶同工酶与植物
育性的表达密切相关 , 本研究再次证实了这一结论。针对酯酶同工酶的深入研究如纯化、氨基酸组
成、结构特征等均未见报道 , 本研究在对β2EST同工酶单向活性凝胶图谱的分析的基础上又进行了
双向电泳分析 , 旨在对β2EST同工酶进行分离纯化 , 为后续的β2EST氨基酸序列分析及基因克隆奠
定基础。
综上所述 , 本试验所采用的分离纯化方法对于分离大白菜特异β2EST同工酶是有效的 , 对其它
作物同工酶的分析具有一定参考价值。
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