全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(9)：1357—1362
Acta Horticulturae Sinica
黄瓜 ．3脂肪酸去饱和酶基因 cDNA的克隆及表达
刘春香 ，何启伟 ，赵光强 ，阚世红 ，张春兰
( 潍坊学院生物工程学院，山东潍坊 261061； 山东省农业科学院蔬菜研究所，济南250100)
摘 要：利用 eDNA末端快速扩增技术，从黄瓜叶片组织中获得脂肪酸去饱和酶基因 ( —FAD)，其
序列长度为 1 807 bp，编码 445个氨基酸，推导的氨基酸序列与已经报道的 (I)一3脂肪酸去饱和酶基因序列
同源性较高，与桃果实的同源性最高 (77％)。利用 RT—PCR半定量分析显示，该基因在绿色组织如茎、
叶、卷须里表达量较高，在根、花 、果实及种子里也有少量表达。
关键词：黄瓜；基因；克隆；表达；风味；抗性
中图分类号：S 642．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)09—1357-06
M olecular Cloning and Expression Analysis of Fatty Acid Desaturase Gene in
Cucumber
LIU Chun．xiang ，HE Qi．wei ，ZHA0 Guang．qiang ，KAN Shi．hong ，and ZHANG Chun—lan
(’Bioengineering Institute of Weifang University，Weifang，Shandong 261061，China； Vegetable Institute ofShandong Academy
ofAgricultural Science，Jinan 250100，China)
Abstract：The fatty acid desaturase gene(Cs—FAD)，which full—length is l 807 bp and encode 445
amino acids，was cloned from cucumber leaves by technique of rapid PCR amplification cDNA—ends．High
similarity was observed between the sequence of Cs—FAD and FAD of peach(identity，77％ )．The result of
RT-PCR simi—quantitative analysis showed that Cs—FAD expresses more highly in green tissues，such as leaves，
stems，hooks and SO on．And it could also be found expression in roots，flowers，fruits and seeds，in a low
leve1．
Key words：cucumber；gene；clone；expression；flavor；resistance
研究发现，‘|】一3脂肪酸去饱和酶 (‘1)一3 faty acid desaturase，FAD)是控制亚油酸向亚麻酸转换的
关键酶。在黄瓜组织内，亚油酸和亚麻酸都是风味物质合成的前体物质 (Matsui et a1．，2006)，亚麻
酸的氧化裂解终产物为黄瓜的特征风味物质——反，顺 一2，6～壬二烯醛，其含量的提高有利于提高
黄瓜风味 (Fross et a1．，1962；Kemp et a1．，1974)。
FAD基因还具有多种生理功能，将该基因转入烟草 (Khodakovskaya et a1．，2006)及拟南芥
(Kodama et a1．，2000)中，能够增强其抗寒和抗病能力。该基因与茉莉酸甲酯调节的受伤诱导的防
御反应关系密切 (Kachroo et a1．，2003)，并且与信号转导有关 (Nishiuchi et a1．，1997)；当拟南芥中
FAD基因被沉默以后，膜脂中的类脂和脂肪酸成分会发生显著变化，三烯脂肪酸显著降低，耐高温
能力显著提高 (Murakami et a1．，2000)。克隆黄瓜 FAD基因 (Cs—FAD)，有助于利用分子手段提高
黄瓜的风味，并为黄瓜抗寒、耐热及抗病性的研究提供参考。
收稿日期：2008—04—22；修回日期：2008—05—23
基金项目：潍坊学院院级项目 (2004k16)
E-mail：chunxiangliu74@ 163．corn
致谢：感谢山东大学生命科学院赵双宜教授对本研究的指导
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l358 园 艺 学 报 35卷
1 材料与方法
1．1 材料
黄瓜 ‘LS21’种子由山东省农业科学院蔬菜研究所惠赠。SMART RACE试剂盒购 自Clontech公
司，反转录酶、pMD18一T载体、限制性内切酶等购自TaRaKa公司。菌种 DHJct由本室保存。DNA
Marker、质粒小提试剂盒及琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒等购自天根生物制品公司。PCR引物由上海
Sangon生物技术服务有限公司合成。
从 GenBank的Est库中搜索到一条与拟南芥、油菜等 FAD7基因高度同源的黄瓜序列，登录号
gb：CK086108．1，根据该序列信息，利用Primer premier 5．0软件设计引物，引物序列见表1。通用引
物 UPM、NPM由试剂盒提供。
表1 克隆 “卜3脂肪酸去饱和酶基因 (FAD)所需的引物
Table 1 Primer needed when cloning to-3 fatty acid desaturase gene
1．2 FAD基因中间片段的扩增
取黄瓜两片真叶展开时的叶片，采用 Trizol试剂盒提取总RNA，根据 RACE试剂盒的说明书，分
别进行3 和5 第 1链cDNA的合成。采用 P1、P2引物，以5 cDNA为模板，扩增Est序列，获得683
bp的中间片段，将 PCR产物克隆到 pMD18一T载体上，阳性菌送Sangon公司测序。
1．3 FAD 基因3 末端的扩增
初次扩增采用 3 RA．P1和试剂盒内的 UPM引物，以3 cDNA为模板，利用热启动 DNA聚合酶，
20 L反应体系，按照以下程序进行PCR反应：95℃预变性 2 rain；95℃变性30 S；67℃退火40 S；
72℃延伸 2 min；20个循环；改变退火条件为 66℃退火30 S，再进行20次循环，最后72％延伸 10
min。将扩增产物在 1．2％的琼脂糖凝胶中电泳，切下 目的条带，冰冻 20 min，融化后 12 000 r·
min 离心5 min，取 1 L的胶液做模板，3 RA．P2、NPM为引物，做巢式 PCR，反应条件为：95℃
预变性 2 min；95℃变性30 S；67 oC退火30 S；72 qC延伸2 min；5次循环，95℃变性30 S；65℃退
火30 S；72℃延伸2 rain；25个循环，最后72℃延伸10 rain。通过2次PCR，获得可靠的3 RACE扩
增产物，将目的基因片段克隆到pMD18-T载体上，阳性菌落送 Sangon公司测序。
1．4 FAD 基因5 末端的扩增和全长基因的拼接
采用与3 末端相似的方法进行5 末端扩增，初次扩增引物对分别为5 RA．Pl和UPM，5 RA．P2和
UPM，反应体系20 。反应条件为95 c预变性 2 rain；95℃变性20 S；70℃延伸3 min；10次循环，
95 Cc变性20 S；68 oC退火30 S；72 cIC延伸2 min；循环30次，最后72 cC延伸 10 min。扩增产物进行
2次PCR，引物5 RA—P3和NPM，反应条件为：95 c预变性2 min；95 cC变性30 S；65℃退火30 s；
72℃延伸 1 min，30次循环，最后 72 qC延伸 10 rain。将扩增的目的基因进行克隆，阳性菌落送
Sangon公司测序。
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9 期 刘春香等 ： 黄瓜 ∞ ． 3 脂肪 酸去饱和酶基 因 cD N A 的克隆及表达 1359
1 ． 5 黄瓜 F A D 基 因的表达分析
用 T rizol试剂盒提取 黄瓜 根 、 茎 、 叶 、 花 、 果实 、 种子和 卷须 的总 R N A ， 取 l Ixg总 R N A 作为反
转录的模板 ， 反 转录体积 10 斗L ， 分别取 2 “L 做模板 ， 扩增 内参 actin 和 F A D 基 因 ， 以 P 1 、 P 2 为引
物 ， 按照 中间 片段 的扩增条件 ， 28 个循环 ， 根据 电泳条带亮度判断基 因的表达量 。
2 结果 与分析
2． 1 中间片段的获得
提取 的黄瓜 叶片的总 R N A 用 于 R T — P C R 反 应 ， 图 1 为利用 P l、 P 2 引物获 得 的 F A D 基 因 中间 片
段 ， 经 克隆测序与报道 的 E S T 序列 一 致 ， 长度为 683 bp。
2． 2 F AD 基 因 3 ’末端 扩增 和 5 ’末端 的扩增
对 3 ’R A C E 过程 中 eD N A 扩增 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 ， 结 果表明 ， 初次扩增 的 目的条带
模糊 ， 数量较多 ， 其中分子量在 1． 3 kb左右的片段与预测 的 F A D 基 因 3 ’ cD N A 分子 量大小相似 。 切
取该带 ， 更换 引物 ， 对 3 ’ cD N A 扩增产物进行巢式 P C R ， 结果表明 ， 第 2 次扩增 的 目的产物条带 (图
2)， 分子量 为 1 kb左右 ， 与通过 引物计算的 F A D 基 因 3 ’ cD N A 分子量大小 相似 。 初步认 为所获得 的
扩增 产物为 目的基 因 。 克隆该 片段 ， 将鉴 定好 的菌落测序 ， 结果发 现 了 polyA ， 且 与 目的基 因相 符 ，
与烟草 F A D 基 因 3 ’端 同源性 为 90％ ， 说明 已经 获得 了黄瓜 FA D 基 因的 3 ’序列 。
M
图 1 F A D 基 因 中间片段 电泳 图谱
M ： D N A 分 子 量标 准 D [2000 ； 1 ： 扩增 产物 ，
F ig． 1 E ieetrophoresis ofF A D gene fragm ent
M ： M arker 9 12000 ； 1 ： P C R product．
通 过基 因 特 异 引 物 5 ’ R A ． P I 、 5 ’ R A ． P 2 分 别
和 U P M 做 P C R ， 两 种 引物共获得 4 条不 清晰 的条
带 ， 由于 不能确定哪 条是 目的 片段 ， 故将 4 条带
分别切割下 来进 行 二 次 P C R ， 电泳结 果 如 图 3 所
示 ， a 和 d 的扩增产物条带清晰 ， b无 产物 ， e 产
物不 清晰 。 选 择 d 的产物 回收 ， 连 接 、 转 化 ， 酶
切和 P C R 鉴定都正 确后 ， 进行测 序 。 测 序结 果发
现 了 5 ’非 编 码 区 和 起 始 密码 子 ， 其 编 码 区 与 桃
F A D 基 因的同源性 为 67 ％ ， 说 明 已 经 获得 了黄瓜
F A D 基 因的 5 ’序列 。
图 3 5 ’R A C E 二 次 P C R
M ： D N A 分子 量标准 D L2000 ； a 、 b、 c 、 d分别 为 一 次
P C R 扩增的 4 条带作模 板的二 次 P C R 产物 。
F ig． 3 S econd P C R of5
’R A C E
M ： M arker D [2000 ： a ． b． e ． and d pointto tem plates
com ing from the four bands ofthe flin tP C R ．
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1360 园 艺 学 报 35卷
2．3 序列分析
将测序结果去除载体和接头引物序列，参考双序列比较的结果将三段 DNA拼接起来，结果如
图4，所获得的 Cs—FAD基因全长 cDNA序列共 1 807 bp。
1 ( ＼ 、( T T( “ A (；(．A C A AT A 、( C ，、“ 、A A C A ( A A T T t；(；(i T T r T TAT ( ( T T(；TA A ( r(J A
57 A I1 t A A (；A ( A l l I L’I( (i( 1( I t I j A l(’I C A f A r l’(； r 1 C 1(；A T I l L (’I J I I 1 A i J
II3 r i 、(；(j( i i r f’(÷ l l T (； r l A L L’ 、 I C r I’丁 f L’’r I i I I C i 【’ r A T C ．r 1 A A (；C I(i I l r(
l69 A L ( L r I A A A A A C 1 l’(i A ‘ ( (’ j A (’T r(i r T f I T I C I (’A T (’T (；“ (；T C i C T A
2l3 jATG‘，L’( A( ‘i T‘ (·(；T(TTA l’(T(- 、AT‘；T( ( 丁(’丁TA A A L(A(’T C C TA【；( AT(TAT c c T(、T(J
卜l A R W V 1 S I一 (’ (； V K l J P R T Y l】 Il
273 (、L ．、 r TA ( ( A AT(；《 ( TT T( C T T( TA A ^ A ( T T T TAT(，(_’T TTC T(1A ( A rTA (；(；( A ( L A TTG
f R N ( F A K I F M V S F 1 R ( I】 I，
333 【I‘ ( L’C I r^ A A ( C }C 、-I(； 1 r T l C (j I C }I _I’r r【i( G C C l l_rC A A C 1lA A A ( (j(；A A(；A( r
I ^ S K ＼ I{ V l R S S ll G I， S I’ K ( K S
393 f( tI‘-C A l l’(；A A I(；J( A (，T ＼ TC l’(，T“ (，【’A( l t；C rTC T(i 1( A r(j A (；(j A TA A rG A (；A (i(
W A L N V S T p V A V A V D E D N E R
453 ( A (，A(i A t；i l A A I( A (；(-{l A A 1(；(； ( I’l(；A(；(；A r‘；A ( ( (；TA ( I I i C( A C C(；(；(’I( C TC C _J
R V N V N (i V l! 1) J <； S l D P A A I)
5l3 L L ‘ (’L’(；I【 【L (；(-T I‘ (t r(；A rA_l I【’‘l I(；L r(T(’C A 1 f L L’A A A (；C A l r(i T 1(1(；(j【_rA (；(；( A r
I， }1 F R I A r) T }t A A l P K }{ L’ W V R D
573 (’L I 11( (，A (i A I C A A i( A (i rTA I’(t l’l(；【( A (T (j A f(；l‘ “ l( (j l(；(}rA 【r T( (i ’I I(i( C 1( C r
}】 。 R S M S Y V V R 1) V V V V I ( l A A
633 【÷r r( f( C 1 l A C i、l C A A L A A l J(；( 【 1 I(；Tll T (TC C J1 C l T I A C I G (i r r T‘ C I C A A (jG A A C A
v 、 ．、 Y { N N n V v w P L Y W F A Q G T
693 AT( T T T T( 6 ( (‘T TT T T T(；T T( TT t “ T L AT(iAT T( TG (_C’(’A T(j(；(’A “ T TT L T L’"i-A A T(；A C
M I W A L F V L G H D C G H G S F S N D
753 L L A A A_l l l ti A A l A ‘；1 (j T 1 L； l r‘i(；L ( A I’A l’L’(’r r(’A r r【’L、 l (、A A T L’L：I’A a TT L’A TA l’(’A I
P N l N S V V 6 H i L H S S I L V P Y H
813 L；(；A 【‘ ( A t A A I I A (-C A L A (；A A C l L A rC A C C A (；A A L A r(；‘ T L’A l(；r(’(；A A A A T(；A 1-(j A A
( W R I S H R T }1 ¨ O N H 【i H V F N D E
873 I L l(；( L’A l L’ I l r( I L I(i A 【 A A A A l}J ATA (；( A ( l T 【(；( ATA A A ( C AA L‘A A (1 A A C A (’l A
S W H P I S E K I Y R S L D K A T R T L
933 A t (，TT C(；C TC’r()(C (_；TTC C C C AT{I；C T．T( C ATATC C T ( rC TA CTT T(；(；A (，TA(-AA ()T (’L’丁
R F A I P F P M L A Y P V Y L W S R S P
993 ‘ ti 、 、A t；AA (i(；“ ( TC T (A T I、T T ( AC C TA A (A ‘ T (iA rTT(；TT T(j TA C C( A(；T (；Aa L。 ，；(：；AAT
G K K G S H F D P N S D L F V P S E R N
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D l I l S T A C W T A M L A L L G C L S
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V V M G P L 0 I 1 K L Y G I P Y M M F V
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M W L I) A V T Y L l{ I{ l{ G l{ D D K L P W
1 233 l A l C ‘i 1 (；‘T A (；A ( (t A A’r( ( A (；T l’A L’L’rAA ( A (÷(；A t；(；A T丁A A L‘G A( C C l r(；AT C <；1(；ATTA C
Y R G E E W S Y L R G (； L T T L D R D Y
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1 353 L A A A I L L A L A L’l、A l C A (’rTA A I A(；A A (；( A A C C (j A (jG C A A (jA A ‘i(’( GA i A l l C (j【i(j AA (i
O l p H Y I1 I I E A 1’ E A T K P I F G K
1 413 TAT T 、rA‘i(；( A A C C A ‘ iA ( 、A ． T 1-T( ( C’L’TC TC C CAT TTCA ( TTATTA《 ( A G T T( TTG TA
Y Y R E P E K S W P ￡ P F H I I (； V l V
l 473 A (，A A (；( L l A A (i A 、A ( 《 A T L A L T l( ( l(j A ‘ ( ( A I、f(’r( ( A ( ATAT L’( TA I A l TA T(’A A A (A
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l 533 ( 、L’cL’L( AL’L丁(；TC lⅡ I’L’AAAG(‘AACA(A rjAA(，rj r(”I J℃ rI’(i1 L VVtCAA(”IAI FA(7A
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1 598
1 668
1 738
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L A l( LAAA l rL’i J r‘t(“ 气AIA( L 1t‘；L’(；A( (’(‘A L’I L’“A《iT’r|1AAAAlAI( A i L’A(；(‘ ’ AA A(；AA‘；L’C(；
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A1、 ＼At；T l、(；(；CA r r( 【f rI I( (r I‘ AA( T 、C(i H ’。IAA1AAAC TAC1A( r(；AA(’L’ACAAl( (TAT AATI T(；
t1{ } {／；，{ { { ^ ，{ 4 A，， t 4
图4 CS—FAD基因序列及推测的氨基酸序列
阴影部分为脂肪酸去饱和酶的保守区域；加框为起始密码子和终止密码子。
Fig． 4 Nucleotide and deduced amjno add sequence of cucumber D gene
shadi“g part denote high reserved re西0n 0f faty acjd desaturas ；Initiati0n c0d0n and stop codon are sh0wed in bold
最大 0RF为 l 338 bp，该基因共编码435个氨基酸，其编码序列存在脂肪酸去饱和酶基因的保守
序列 (图4中阴影区)。我们所克隆的黄瓜脂肪酸去饱和酶基因与桃、苹果的 D亲缘关系较近，从
氨基酸序列同源性比较图谱 (图5)可以看出，其同源性分别为 77％ (347／447)和 73％ (33O／
446)。根据 DNAslar软件包分析，预测其编码的蛋白质分子量为50．848 kD，等电点为 pI 7．29，疏水
性氨基酸残基为37．08％ (165个)。
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9 期 刘春香等 ： 黄瓜 ∞ 一 3 脂肪 酸去饱 和酶基 因 cD NA 的克隆及表达 1361
F r^
F t^
● ● -
● ● ●
L Q 】n【L
34 4
332
4 4 5
4 38
4 4 8
图 5 黄瓜 F A D 与几 种植物 tt卜3 脂肪酸 去饱和 酶蛋 白氨基酸序 列 的 同源性 比较
A ： 拟 南芥 ； B ： 欧洲 白桦 ； C ： 黄瓜 ； M ： 苹果 ； P ： 桃 。
F ig． 5 H om ology com parison ofam ino acid sequ ences align m entofcucum ber F A D
w ith ‘l卜3 fatty acid desaturase ofother plants
、： A ro bidopsis ； B ： B etula pendula ； C ： C ucum is sa tivus ： M ： M alus dom estica ： P ： P rH n w persica
系统进 化树分析表 明该基 因 与苹果 和 桃 的亲
缘关 系较近 (图 6)。
2． 4 基 因表达分 析
目的基 因 在 各器 官 的表 达 可 以 采 用 R T ． P C R
法进行相对 定量 分析 。 本研 究采用 此 方法 ， 对 黄
瓜各种 器 官 的 R N A 进 行 了 R T — P C R 。 从 电 泳 图
(图 7 ) 可 以看 出 ， 在 内参 actin 扩 增 产物 比较 一
致 的前提下 ， C s— F A D 基 因在叶片 、 卷须及茎等绿
色组 织 里 表达量 较 高 ， 在花 、 果 实 、 未熟 种 子 及
根 中也有表达 ， 但表达量 较低 。
拟 南芥 A rabidopsis
欧洲 自桦 B etula pendula
黄瓜 C ucu m is sativus
苹果 M alus dom estica
桃 P runus persica
74 ％
95
87
90
78
88
166
158
190
178
188
232
228
290
278
288
301
296
390
378
3 88
] ；，卜
图 6 F A D 基 因 的 系统进 化树
F ig． 6 M olecular phylogenetic trees ofF A D gene
R S T L F L F R S E H
action
图 7 C s- F A D 基 因在黄瓜 各种组 织 的表达
R ： 根 ； S T ： 茎 ； L ： 叶 ； F L ： 花 ； F R ： 果实 ； sE ： 种子 ； H ： 卷须 。
F ig． 7 E xpression ofC s— F A D gene
in diferentorgans ofcucum be r
R ： R oot； S T ： S tem ； L ： L eaf； F L ： F low er； F R ： F ruit； S E ： S eed： H ： H ook
A B c M P A B c M P A B c M
P A B C M
P A B c M
P
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l362 园 艺 学 报 35卷
3 讨论
RACE技术在克隆 cDNA3 末端和 5 末端序列中表现出极大的优越性。根据 RACE技术所获得的
末端序列设计引物，再通过常规 PCR可获得 cDNA全长序列。与通过 DNA探针或抗体筛选文库相
比，该技术简单、可靠性高 (李关荣 等，2003)。由于只有一端是特异引物，因而非特异性扩增较
多。在本试验中，也产生了一些非特异性扩增产物，进行巢式 PCR扩增可以确保目的产物的正确性，
即使是同一条目的扩增产物带，可能含有的基因也不同，在对重组菌落进行鉴定时，巢式 PCR可以
提高正确性，避免多次测序带来时间和经济上的消耗。本试验初期没有进行巢式PCR，几次测序结
果都不是目的基因，因此更换引物进行多次 PCR鉴定，提高了特异性。另外，如果 RACE克隆的目
的基因表达丰度不高，一次 PCR扩增通常不能产生足以用于克隆的理想产物，二次 PCR还可以提高
产物的量，Frohman等 (1988)认为，如果二次 PCR扩增的循环总数达到 60，理想的 RACE产物就
会在琼脂糖凝胶上，经溴化乙锭染色表现出特异的带。
o3．3脂肪酸去饱和酶基因在其它生物中发现较多，按照拟南芥脂肪酸去饱和酶基因的命名规则，
在叶绿体里表达的命名为 (Iba et a1．，1993)，在内质网中表达的命名为 肼 ，本试验未进行
基因的精确定位，所以暂不能确定。从序列同源性分析看，该基因与许多叶绿体 FAD的亲缘关系近，
因此属于 的可能性较大，从基因的表达分析，该基因在绿色组织中表达量较高，但不含有叶绿
体的根组织也有表达，因此尚不能确定该基因一定是叶绿体 (Matsuda et a1．，2001)。进一步的
研究可以利用原位杂交或免疫组化等方法分析该基因的精确表达部位，并采用基因沉默和过量表达等
手段验证功能，有利于该基因的准确命名和进一步应用。
References
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