全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 217 - 220
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 05 - 25; 修回日期 : 2006 - 08 - 14
基金项目 : 北京市自然科学基金项目 (5062007) ; 国家自然科学基金项目 (30671422) ; 国家 ‘863’项目 (2006AA10Z1C9, 2006AA100108)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangfenglan@nercv1com)
与大白菜橘红心基因紧密连锁的 SCAR标记
王国臣 1, 2 , 张凤兰 13 , 余阳俊 1 , 张德双 1 , 赵岫云 1
(1国家蔬菜工程技术研究中心 , 北京 100097; 2首都师范大学生命科学学院 , 北京 100037)
摘 　要 : 利用游离小孢子培养获得的 DH系群体和 BSA法对与大白菜橘红心基因紧密连锁的分子标记
进行了研究 , 筛选到与橘红心球色基因 or连锁的 RAPD标记 S1338656和 AFLP标记 P67M54172 , 其遗传距离
分别为 8 cM和 13 cM , 并将其成功转化成 SCAR标记 SCOR204和 SCOR127。对标记的通用性在 110个大白菜
自交不亲和系育种材料中进行了验证 , 与田间鉴定结果的吻合率分别为 90%和 8911%。SCAR标记的获得
为大白菜橘红心性状的分子标记辅助选择与基因的图位克隆奠定了基础。
关键词 : 大白菜 ; 球叶色 ; BSA; SCAR; 标记辅助选择
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120217204
Iden tif ica tion of SCAR M arkers L inked to O range Head L eaf Gene in
Ch inese Cabbage ( B rassica rapa L. ssp. pekinensis)
WANG Guo2chen1, 2 , ZHANG Feng2lan13 , YU Yang2jun1 , ZHANG De2shuang1 , and ZHAO Xiu2yun1
( 1 N ational Engineering Research Cen ter forV egetables, B eijing 100097, China; 2 College of L ife Science, Capita l N orm al U niver2
sity, B eijing 100037, Ch ina)
Abstract: Bulked segregant analysis was emp loyed to identify molecular markers linked to orange head
leaf gene ( or) trait based on RAPD and AFLP in Chinese cabbage with a doubled hap loid (DH ) population
derived from the F1 between the two parents 912112 (white head leaf) and T12219 ( orange head leaf) via
m icrospore culture. One RAPD marker S1338656 and one AFLP marker P67M54172 were identified to be linked
to or gene with the distance of 8 cM and 13 cM respectively. These two markerswere successfully transformed
into SCAR markers SCOR204 and SCOR127. The accuracy of 90% and 8911% were obtained when 110 differ2
ent incompatibility breeding lines of Chinese cabbage were used to be investigated with two SCAR markers, in2
dicating that these two SCAR makers could be used in marker2assisted2selection in orange head leaf breeding
p rogram s and positional cloning of or gene in Chinese cabbage.
Key words: Chinese cabbage; B rassica rapa L. ssp. pek inensis; O range head leaf gene ( or) ; BSA;
SCAR; Marker2assisted selection
橘红心大白菜比普通大白菜含有较高的维生素 C、胡萝卜素及矿质元素 (徐家炳 , 1998) , 因此
球色育种受到育种家的重视 , 但对球色性状的检测必须在结球末期剖球进行 , 田间选择费时费力。为
建立大白菜橘红心性状分子标记辅助育种技术体系和进行 or基因的图位克隆 , 作者在以前工作的基
础上 , 以 DH群体为材料 , 结合 BSA法 , 利用 RAPD和 AFLP标记技术获得在 or基因两侧与橘红心性
状紧密连锁的标记 , 并将其转化成 SCAR标记。同时 , 验证了连锁标记在不同大白菜材料中的通用性
和用于标记辅助选择的可行性。
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
1　材料与方法
以大白菜橘红心株系 T12219和普通白心株系 912112以及杂交 F1进行游离小孢子培养得到的 100
个 DH株系 (张凤兰和赵岫云 , 2003) 为试材 , 随机选取 10个白心株系和 10个橘红心株系 , 将其
DNA分别等量混合 , 构建白心池和橘红心池。选用 300个 RAPD随机引物和 16条 PstⅠ ( P + 3) 引
物和 16条 M seⅠ (M + 3) 引物组成 256对 AFLP引物组合在两池间筛选多态性引物 , 在 DH群体中
验证多态标记与橘红心性状的连锁关系 , 采用 JoinMap310软件根据 DH群体球色田间调查记录 , 计
算标记与橘红心 or基因的连锁距离 , 并将获得的连锁标记转化成 SCAR标记。随机选择 67个白心自
交不亲和系材料和 43个橘红心自交不亲和系材料验证标记鉴定与田间鉴定的吻合率 , 了解连锁分子
标记在不同大白菜材料中的通用性。
2　结果分析与讨论
211　与橘红心连锁 RAPD标记的筛选
筛选的 300条随机引物中有 280条可扩增到清晰的条带 , 双亲间稳定表现多态的引物 45条 , 多
态率为 15%。利用有差异的 45条引物对两个池的 DNA进行扩增 , 发现 7条引物在两池间有差异谱
带 , 但在打开池进行单株确证时 , 6条引物扩增的标记并不与橘红心球色基因连锁 , 只有引物 S1338
(5′2GTGTGCAGTG23′) 产生的分子量为 656 bp的条带 S1338656在橘红心池的各单株中都存在 , 而在白
心池的单株中不存在 , 重复 1次 , 结果一致 (图 1) , 初步确定了 S1338656与橘红心球色基因存在连锁
关系。
图 1 　引物 S1338在两亲本、F1及池中各 D H单株 D NA扩增结果
M: 分子量标准 (100 bp DNA ladder) ; P1 : T12219; P2 : 912112;
F1 : T12219 ×912112 ; 1～10: 橘红心池中各单株 ; 11～20: 白心池中各单株。
F ig. 1　The am plif ica tion of pr im er S1338 in two paren ts, two pools and every ind iv idua l of two pools
M: 100 bp DNA ladder; P1 : T12219; P2 : 912112; F1 : T12219 ×912112; 1 - 10: Individual p lants of orange pool;
11 - 20: Individual p lants of white pool.
212　与橘红心连锁的 AFL P标记的筛选
采用 ( P + 3 ) / (M + 3) 的选择性引物组合 , 以 16条 PstⅠ ( P + 3) 引物和 16条 M seⅠ (M +
3) 引物组成 256对引物组合 , 对 912112, T12219, 白心池 , 橘红心池进行多态引物组合的筛选 , 获
得 22对引物组合在双亲及两池间表现多态。利用这 22对引物在两池各单株中进行 AFLP再扩增 , 只
获得 1条特异片段 P67M54172 , 在橘红心池 10个单株中有 1株未扩增出 P67M54172 , 在白心池 10个单
株中有 1株扩增出 P67M54172 (图 2) , 标记 P67M54172可能与橘红心基因连锁。
213　所得 RAPD与 AFL P标记在 D H群体中的分离及与橘红心 o r基因的连锁关系分析
对 DH群体各株系 DNA用引物 S1338进行 PCR扩增 (表 1) , 59个橘红心株系中有 5个未扩出
S1338656条带 , 41个白心株系中有 3个扩增到 S1338656 , 即 100个株系中有 8株交换株 , 重组率为
8% , 与田间球色鉴定的吻合率为 92%。
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　1期 王国臣等 : 与大白菜橘红心基因紧密连锁的 SCAR标记 　
图 2　AFL P引物对 P67M 54在橘红心池和白心池中各单株的扩增结果
1～10: 橘红心池中各单株 ; 11～20: 白心池中各单株。
F ig. 2　The am plif ica tion of AFL P pr im er P67M 54 in every ind iv idua l of two pools
Lane 1 - 10: Individual p lant of orange pool; Lane 11 - 20: Individual p lants of white pool.
对 DH群体各株系 DNA用 AFLP引物对 P67M54进行扩增 , 59个橘红心株系中有 4个未扩出
P67M54172条带 , 41个白心株系中有 6个扩增到 P67M54172 , 即 100个株系中有 10个交换株 , 重组率为
10% , 与田间球色鉴定的吻合率为 90% (表 1)。
表 1　S1338656和 P67M 54172标记在 D H群体中的扩增结果
Table 1　Am plif ica tion of S1338656 and P67M 54172 markers in D H popula tion
标记
Marker
球色
Head colour
株系数
Number of lines
有标记株系
Number of lines with marker
无标记株系
Number of lines without marker
重组率
Recombinant frequency( % )
S1338656 橘红心 O range 59 54 5
白心 W hite 41 3 38 8
P67M54172 橘红心 O range 59 55 4
白心 W hite 41 6 35 10
对标记 S1338656和 P67M54172与橘红心基因的连锁关系进行分析的结果表明 , 这两个标记都与橘
红心 or基因存在连锁关系 , 且位于 or基因两侧 , 其连锁距离分别为 8 cM 和 13 cM (图 3)。标记
OPB012850是曾研究已经找到的标记 (刘秀村 等 , 2003) , 利用 JoinMap 310软件分析其与 or的连锁
距离为 6 cM , 大于用 Mapmaker 310软件计算的 318 cM 的连锁距离。这说明 JoinMap 310软件和
Mapmaker 310软件的计算结果存在一定的差异。
图 3　标记 S1338656 , P67M 54172和 O PB012850与橘红心基因 or的连锁图
F ig. 3　 L inkage map of S1338656 , P67M 54172 , O PB012850 and the orange head leaf gene or
214　SCAR引物转化
将连锁 RAPD标记 S1338656进行克隆测序 , 根据测序结果设计 SCAR引物 , 引物 SCAR1 (上游引
物序列为 5′2ATACGACGGTGAGTGGAAG23′, 下游引物序列为 5′2ACTACACCATTGTGTGTCGG23′) 在
56℃退火条件下可获得较好的扩增结果 , PCR产物大小为 204 bp, 与标记 S1338656的扩增结果完全一
致 , 表现共分离 , 命名为 SCOR204 (图 4)。
将连锁 AFLP标记 P67M54172进行克隆测序。根据测序结果设计 SCAR引物 , 引物 SCAR2 (上游
引物序列为 5′2GAGTCGCTACTGGTGAAAC23′, 下游引物序列 5′2AAAGAATTATTGACGCATGA23′) 在
56℃退火条件下获得较好的扩增结果 , PCR产物大小为 127 bp, 与其相对应的 AFLP标记 P67M54172
的扩增结果完全一致 , 表现共分离 , 命名为 SCOR127 (图 4)。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
图 4 　引物 SCAR1 (上 ) 和引物物 SCAR2 (下 ) 对两亲本和两池中各单株扩增结果
M: 分子量标准 (100 bp DNA ladder) ; P1 : T12219; P2 : 912112;
1～10: 橘红心池中各单株 ; 11～20: 白心池中各单株。
F ig. 4 　The am plif ica tion of pr im er SCAR1 ( up) and SCAR2 ( down) in two paren ts and every ind iv idua l of two pools
M: 100 bp DNA ladder; P1 : T12219; P2 : 912112;
Lane 1 - 10: Individual of orange pool; Lane 11 - 20: Individual of white pool.
215　SCAR标记在不同的大白菜自交不亲和系中的验证
对 110个不同的大白菜自交不亲和系用两对 SCAR引物进行扩增 , 结果见表 2。SCAR1引物对的
扩增结果 , 43个橘红心自交不亲和系材料中有 38个扩增到 SCOR204 , 67个白心自交不亲和系材料中
有 6个扩增到此条带 , 因此其标记鉴定与田间鉴定的吻合率为 90%。SCAR2引物对在 110个大白菜
自交不亲和系材料的扩增结果 , 与田间鉴定的吻合率为 8911%。
表 2　SCAR标记 SCO R204和 SCO R127在 110个不同的大白菜自交不亲和系中分离结果
Table 2　The am plif ica tion of SCAR markers in 110 d ifferen t incom pa tib ility lines of Ch inese cabbage
SCAR标记
SCAR markers
球色
Head colour
株系数
Number of lines
有标记株系
Number of lines with marker
无标记株系
Number of lines without marker
吻合率
Inosculate ( % )
SCOR204 橘红心 O range 43 38 5 90
白心 W hite 67 6 61
SCOR127 橘红心 O range 43 37 6 8911
白心 W hite 67 6 61
在 DH群体中 SCOR204与田间球色鉴定的吻合率为 92% , SCOR127的吻合率为 90% ; 在 110个不同
的大白菜自交不亲和系中 SCOR204与田间球色鉴定的吻合率为 90% , SCOR127的吻合率为 8911%。说
明本研究获得的两个 SCAR标记在不同的大白菜材料中进行标记辅助选择具有通用性 , 可以大范围的
在大白菜材料中用于橘红心性状的标记辅助育种 , 从而提高球色育种的选择效率 , 加快育种进程。
References
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orange2red internal head gene in Chinese cabbage. Acta Agriculturae Boreali2Sinica, 18 (4) : 51 - 54. ( in Chinese)
刘秀村 , 张凤兰 , 张德双 , 杨建平 , 王 美 , 徐家炳. 2003. 与大白菜桔红心基因连锁的 RAPD标记. 华北农学报 , 18 (4) : 51 - 54.
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徐家炳. 1998. 北京桔红心 (9728) 大白菜新品系. 中国蔬菜 , (4) : 31.
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张凤兰 , 赵岫云. 2003. 用小孢子培养创建大白菜双单倍体作图群体. 华北农学报 , 18 (4) : 74 - 77.
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