全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 741 - 746
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 03 - 24; 修回日期 : 2008 - 04 - 29
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671713) ; 中国农业大学科研启动基金项目 (2005061)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: libao@cau1edu1cn)
柿树乙醇脱氢酶活性与可溶性单宁含量的关系
刘朝蓬 1 , 郑仲明 2 , 梁银娜 1 , 李　宝 13
(1 中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094; 2 北京市房山区林业局林果站 , 北京 102400)
摘 　要 : 研究了 4种不同脱涩类型柿 (D iospyros kaki Thunb. ) 果实和叶片中的可溶性单宁含量、乙醇
脱氢酶 ( alcohol dehydrogenase, ADH) 活性和 ADH最适反应温度 , 以了解 ADH在脱涩过程中的作用。结
果表明 : 不完全甜柿和完全甜柿果实发育前期 , 可溶性单宁含量逐渐降低 , ADH活性逐渐增高 , 到果实基
本完成脱涩后 , ADH活性又开始降低 , 在不完全甜柿中变化较大 ; 涩柿和不完全涩柿在果实近熟期 , 可溶
性单宁含量有所下降 , 但不能完成脱涩 , 且 ADH活性较低。叶片发育过程中 , 可溶性单宁含量的变化与
ADH没有相关性。ADH的最适反应温度在 25 ℃左右。ADH与柿果实脱涩有一定关系。
关键词 : 柿 ; 可溶性单宁 ; 乙醇脱氢酶 ; 脱涩
中图分类号 : S 66512　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520741206
Rela tion sh ip Between Activ ity of A lcohol D ehydrogena se and Soluble Tann in
in Persimm on
L IU Chao2peng1 , ZHENG Zhong2m ing2 , L IANG Yin2na1 , and L IBao13
(1 College of A gricu lture and B iotechnology, China A gricultura l U niversity, B eijing 100094, Ch ina; 2 Forestry & Fruit S tation of
Forestry B ureau, Fangshan D istrict of B eijing M unicipa lity, B eijing 102400, China)
Abstract: Content of soluble tannin and activity of alcohol dehydrogenase and the op timum temperature
of alcohol dehydrogenase (ADH) in 4 different type fruits of persimmon (D iospyros kak i Thunb. ) were meas2
ured in order to assess the effects of ADH on loss of astringency of persimmon fruits. In the early stage of fruit
development, the pollination2constant/nonastringent ( PCNA ) and the pollination2variant/nonastringent ( PV2
NA ) soluble tannin content decreased, and the activity of ADH increased, but the activity of ADH decreased
when the fruits become non2astringent, especially in PVNA2type fruits. The content of soluble tannin of polli2
nation2constant/astringent ( PCA ) and pollination2variant/ astringent ( PVA ) 2type fruits decreased, and the
activity of ADH was also in lower level in the mature stage. During the leaf development, there is no signifi2
cant relationship between ADH and soluble tannin. The op timum temperature of ADH is 25 ℃. ADH p lays a
role to some extent in loss of astringency of persimmon fruits.
Key word: D iospyros kaki Thunb. ; soluble tannin; alcohol dehydrogenase; deastringency
柿 (D iospyros kak i Thunb. ) 是中、日、韩等国重要的栽培树种 , 依据能否自然脱涩以及种子与
果实脱涩和果肉褐斑形成的关系 , 将柿分为 4种类型 , 即 : 完全甜柿 (pollination2constant/nonastrin2
gent, PCNA)、不完全甜柿 ( pollination2variant/nonastringent, PVNA )、不完全涩柿 ( pollination2vari2
ant/ astringent, PVA ) 和完全涩柿 (pollination2constant/ astringent, PCA ) , 不同类型果实脱涩机制不尽
相同 ( Sugiura & Tomana, 1983; Sugiura, 2005)。
在离体或采后果实中 , 乙醛可直接与可溶性单宁起缩合反应使柿果脱涩 ( Pesis & Ben2A ire,
1984; Matsuo et al. , 1991; Taira et al. , 1992) , 是柿果实脱涩的原因之一。
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乙醇脱氢酶 ( alcohol dehydrogenase, ADH) 可参与鳄梨 ( Kanellis et al. , 1991)、葡萄 (Labat et
al. , 2000)、马铃薯 ( Pinhero et al. , 2007) 等果实成熟调节等多种生理生化代谢 , 在柿果实脱涩过
程中也起着重要作用 ( Yamada et al. , 2002)。
目前 , 关于果实发育期间 ADH活性与可溶性单宁含量的关系 , 报道较少。作者进行 ADH在亲代
和子代之间的遗传特征方面的研究 , 希望通过对不同脱涩类型柿树果实和叶片发育过程中的可溶性单
宁含量、ADH活性和最适反应温度进行研究 , 探讨 ADH活性与可溶性单宁含量之间的关系 , 为进一
步研究 ADH基因在果实发育期不同器官间的差异表达提供参考依据。
1　材料与方法
试验于 2007年 5—10月进行。品种为磨盘柿、西村早生、花御所、次郎和刀根早生。其中西村
早生于 9月 16日成熟 , 刀根早生于 10月 2日成熟 , 磨盘柿、花御所和次郎于 10月 18日成熟。试材
采自北京市房山区河北镇半壁店村果园 , 常规管理。
柿果实从 5月中旬至 8月中旬每隔 30 d取样 1次 , 8月底至 10月中旬每隔 15 d取样 1次 , 叶片
取自邻果部位。
可溶性单宁提取和测定参照 Taira (1996) 的方法。取 2 g果实和 015 g叶片 , 加入 20 mL 80%的
甲醇 , 研磨成匀浆 , 3 600 r·m in - 1离心 5 m in, 取上清液 , 沉淀部分再加入 80%甲醇洗涤、离心 , 取
上清液 , 最后将两次得到的上清液定容至 50 mL。福林 —丹尼斯法 ( Folin - Denis) 测定可溶性单宁
含量。重复 3次。
乙醇脱氢酶的提取和测定 : 粗酶液的提取参照 Tao和 Sugiura ( 1987) 的方法。取 5 mL预冷的
0105 mol·L - 1 Tris -马来酸提取缓冲液 (含 20%甘油、10%可溶性 PVP K230、10 mmol·L - 1β -巯基
乙醇、015% Triton2100, pH 815) , 在冰浴的条件下将样品研磨成匀浆 , 0 ℃, 12 000 r·m in - 1离心
20 m in, 上清液即为酶液提取物 , - 40 ℃保存 , 重复 3次。乙醇脱氢酶活性的测定参照刘存德等
(1980) 的方法 , 反应总体积 3 mL, 其中含有 217 mL的 011 mol·L - 1 Gly2NaOH缓冲液 (pH 910) ,
011 mL的 NAD + (5 mg·mL - 1 ) , 011 mL 95%乙醇 , 对照不加乙醇 , 用无离子水 011 mL代替 , 反应
用 011 mL酶液起动。在 340 nm下测定其光密度的变化 , 酶活性以在 340 nm下光密度改变 011为一
个活性单位计算。
乙醇脱氢酶最适反应温度测定参照霍丹群等 (2006) 的方法。将次郎果实粗酶液分别于 10、15、
20、25、30、35 ℃温度下测定 ADH活性 , 绘制酶活力 —温度曲线 , 确定酶促反应的最适温度。
2　结果与分析
211　果实中可溶性单宁含量与乙醇脱氢酶活性变化的关系
图 1表明 , 果实发育初期 ( 6月中旬 ) , 各个品种的可溶性单宁含量相近 , 在 1%左右。之后 ,
花御所和次郎呈下降趋势 , 在果实近成熟时降至最低 (分别为 0106%和 0105% )。西村早生在 7月中
旬至 8月中旬果实中可溶性单宁含量由 1108%急剧下降至 0106% , 之后维持较低水平。磨盘柿和刀
根早生在前期变化不明显 , 9月中旬以后呈下降趋势 , 果实成熟时在 015%左右。
在供试品种果实发育初期 (6月中旬 ) , 没有检测到 ADH活性。自 7月中旬起 , 磨盘柿和刀根早
生 ADH活性有波动 , 于 9月中旬达到最大值 (分别为 11099和 11647 U·m in - 1 ·g- 1 FM , 活力单位
下同 )。西村早生从 7月中旬至 8月中旬期间 , ADH活性急剧上升到最大值 (21148) , 之后开始降
低。花御所和次郎 ADH活性缓慢升高 , 到 8月底达到峰值 (分别为 01961和 11176) , 之后开始下降
(图 2)。
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　5期 刘朝蓬等 : 柿树乙醇脱氢酶活性与可溶性单宁含量的关系 　
　　结合图 1和图 2可知 , 西村早生 , 花御所和次郎的可溶性单宁含量在 7月中旬至 8月底下降最明
显 , 而此时它们的 ADH活性均处在最高水平 , 西村早生表现最为明显 , 可见 , ADH活性与可溶性单
宁含量呈负相关。
212　叶片中可溶性单宁含量与乙醇脱氢酶活性的变化
由图 3可知 , 5月中旬至 6月中旬可溶性单宁含量变化不大 , 之后开始下降 , 到 7月中旬 , 除花
御所外其它品种都降到最低。花御所叶片中的可溶性单宁含量则一直下降至 8月底 , 之后才略有上
升。
叶片发育过程中 ADH活性的变化在品种间有所不同。磨盘柿在 8月底降到最低 (111852) , 之
后有所增强 , 10月初最高 (321677) ; 刀根早生在 7月中旬降到最低 ( 71799) , 9月中旬达到最大
(291394) ; 果实成熟后磨盘柿和刀根早生的 ADH活性又有所下降。西村早生、花御所和次郎在 5月
中旬至 6月中旬呈上升趋势 , 之后开始下降 , 并且在 7月中旬降到最低 (分别为 101589, 121814和
141484) , 而后又开始上升。不同的是 , 西村早生 ADH活性在 7月中旬后一直呈上升趋势 , 而次郎和
花御所有波动 (图 4)。
在柿叶片中 , ADH活性和可溶性单宁含量没有呈现规律性的变化。
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213　温度与果实 AD H酶活力的关系
温度从 10 ℃升高到 15 ℃时 , 次郎果 ADH活性的变化不大 , 在 15～25 ℃温度范围内 , ADH活
性上升 , 并在 25 ℃时达到最大值 (11105) , 而后随着温度的上升而迅速降低 , 其 ADH的最适反应
温度为 25 ℃。
图 5　温度与 ‘次郎’柿果实中乙醇脱氢酶 ( AD H) 活力的关系
F ig. 5　Rela tion sh ip between tem pera ture and AD H activ ity in fru it
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3　讨论
可溶性单宁含量在 011%或 012%以下时 , 人的味觉器官无涩感 , 因此把可溶性单宁含量低于
011%或 012%作为衡量果实是否脱涩的指标 ( Yamada et al. , 2002; 张永卓 等 , 2006)。有研究表
明 , 完全甜柿在果实发育早期 (6月底 ) 可溶性单宁含量降到 115%以下 , 7月下旬降到 015%以下 ,
基本完成脱涩 ; 不完全甜柿在果实近熟期 (7月底至 8月中 ) 可溶性单宁含量才急剧下降 , 进而完成
脱涩 ; 而涩柿则不能自然完成脱涩 , 且此变化与果实单宁细胞变化有关 (费学谦 等 , 1996; 章镇
等 , 1997)。本研究中 , 完全甜柿品种花御所和次郎的可溶性单宁含量呈缓慢下降的趋势 , 到果实近
熟期完成脱涩。不完全甜柿品种西村早生可溶性单宁变化稍有波动 , 而完全涩柿品种磨盘柿和不完全
涩柿品种刀根早生不能够完成脱涩 , 结果与前人研究的结果基本一致。只是不完全甜柿西村早生的可
溶性单宁含量 , 在 7月中旬到 8月中旬有一个快速下降的过程 , 推测可能与种子发育有关。本研究
中 , 西村早生果实可溶性单宁含量下降最明显的时期 , 乙醇脱氢酶活性最高 , 可能是由于乙醇脱氢酶
的催化作用使乙醇发生氧化产生的乙醛与可溶性单宁发生凝固作用的结果 ; 完全甜柿在脱涩时 , 乙醇
脱氢酶活性也有所增强 , 只是没有不完全甜柿明显。可见 , 乙醇氢酶在甜柿的脱涩过程中的确起到一
定的作用。但由于不同类型或起源的柿品种脱涩机制存在差异 ( Yonemori & Matsushima, 1987; Ikega2
m i et al. , 2006) , 所以 , 关于 ADH的直接作用机制有待进一步研究。
磨盘柿叶片在早期可溶性单宁含量相对较低而 ADH活性较高 , 与早期其他品种上的表现不尽一
致 , 是否因其品种的特殊性 , 有待进一步研究。
ADH活性与物种和温度有着密切的关系。本研究中 , 柿果实中 ADH最适温度为 25 ℃, 与酵母
中 ADH最适温度一致 (廉德君 等 , 1996) , 而与醋酸杆菌菌株 Acetobacter Z127中的 ADH最适温度
为 60 ℃ (霍丹群 等 , 2006) 相比 , 差异较大 , 这可能与试材和 ADH类型等因素有关 , 因为 ADH有
不同形态 (Bartley & H indley, 1980; M itchell & Jelenkovic, 1995) , 相关的影响因素和控制基因也不同
(Wolyn et al. , 1990; Fukuda et al. , 2005; Sauvage et al. , 2007)。本研究中 , 在果实发育初期检测不
到 ADH活性 , 而叶片在测定时间内 ADH活性一直都维持较高水平 , 这可能是由于果实发育前期 ADH
基因没有表达 , 但叶片中 ADH基因表达较早 ; 或是两种器官间 ADH种类和特性不同。有关柿树 ADH
作用特征方面的研究尚在研究中。
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