全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 691～693
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 02 - 02 ; 修回日期 : 2004 - 04 - 22
基金项目 : 广东省科技攻关项目 (2 KM03103N) ; 湛江科技攻关项目 〔湛财企 (2001) 114 号 ; (2001) 121118〕3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : mashengjian1 @163. com)
基因枪介导的高羊茅基因转化体系的建立
马生健1 ,3 　曾富华1 3 　徐碧玉2 　卢向阳3 3 　吴志华1 ,3
(1 湛江师范学院生物系 , 湛江 524048 ; 2 中国热带农业科学院热带作物国家重点实验室 , 海口 571101 ; 3 湖南农业大
学生物技术系 , 长沙 410128)
摘　要 : 用高羊茅 ( Festuca arundinacea Schreb. ) 种胚离体诱导的胚性愈伤组织作受体进行了基因枪
的轰击试验 , 确定了以轰击 2 枪 , 子弹距可裂圆片 6 cm , 子弹距轰击受体 6 cm 为最佳轰击参数 , 建立了基
因枪优化转化方案 , 获得了遗传稳定的抗除草剂 PPT 的转化植株。随机抽取的转化植株的 B ar 基因 PCR
检测、总 DNA 点杂交 , 皆成阳性 , 除草剂 PPT 抗性试验表明 , 转化植株比对照有了更强的抗性。
关键词 : 草坪草 ; 愈伤组织 ; 基因枪 ; 转化 ; 抗除草剂
中图分类号 : S 68 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520691203
Protocol Establishment of Tall Fescue Transgene by Biol istics
Ma Shengjian1 ,3 , Zeng Fuhua1 3 , Xu Biyu2 , Lu Xiangyang3 3 , and Wu Zhihua1 ,3
(1 Depart ment of Biology , Zhanjiang Norm al College , Zhanjiang 524048 , China ; 2 The S tate Key L aboratory of Tropical
Crops Biotechnology , Chinese Academy of Tropical A gricultural Sciences , Haikou 571101 , China ; 3 Depart ment of Biotech2
nology , Hunan A gricultural U niversity , Changsha 410128 , China)
Abstract : In this paper , excised mature embryos of tall fescue were used as explants to induce embry2
onic calli , which were used as materials to optimize bombardment parameters of biolistics , and the most
suitable delivery parameters for PDS21000/ He were 6 cm shoot distance , 6 cm distance between particles
and rupture disks , 1100 psi helium pressure and bombarding 2 shots. An optimized transformation protocol
was established and transgenic turfgrass varieties resistant to herbicide with stable heredity were acquired.
All tested tall fescues selected randomly were positive by PCR analysis and by dot blotting analysis for bar
gene. The results of daubing tests with herbicide showed transgenic plants had more resistance than plants
control did.
Key words : Turfgrass ; Callus ; Biolistics ; Transformation ; Herbicide resistance
1 　目的、材料与方法
高羊茅 ( Fest uca arundi nacea Schreb. ) 作为优良的冷季型草坪草在国内外大面积种植 , 但杂草
危害非常严重。作者建立了高羊茅的完整基因枪转化体系 , 获得了遗传稳定的除草剂抗性转化植株。
pBar2Gus 质粒 (图 1) 含抗除草剂的 B ar 基因和 Gus 报告基因 , 由湖南农业大学易自力教授惠
赠。
图 1 　pBar2Gus 质粒结构图谱
Fig. 1 　Construction of pBar2Gus
M1 (愈伤诱导培养基 , 以下没标注单位的数字单位为 mg/ L) : N6 + 2042D 410 + 62BA 011 + 1 %
甘露醇 ; M2 (继代培养基) : N6 + 2042D 410 + 62BA 011 + ABA 410 + 1 %甘露醇 ; M3 (高渗培养基) :
N6 + 2042D 410 + 62BA 011 + ABA 410 + 5 %甘露醇 ; M4 (恢复培养基) : N6 + 2042D 410 + 62BA 011
+ ABA 410 + 1 %甘露醇 ; M5 (继代扩增筛选培养基 Ⅰ) : N6 + 2042D 410 + 62BA 011 + ABA 410 +
PPT 10 + 1 %甘露醇 ; M6 (继代扩增筛选培养基 Ⅱ) : N6 + 2042D 410 + 62BA 011 + ABA 410 + PPT 15
+ 1 %甘露醇 ; M7 (分化长芽筛选培养基) : MS + 62BA 210 + NAA 110 + CoCl2 510 + TDZ 015 + PPT
10 ; M8 (生根壮苗筛选培养基) : 1/ 2MS + NAA 110 + IAA 015 + PPT 10 + MET 210 + 011 %活性炭。
以上各培养基都添加 3 %蔗糖、013 % Phytagel , p H 518。离体种胚的愈伤诱导及再生系统的建立参
照前文〔1〕略加改进。
受体材料的轰击 : 选取生长状态良好的颗粒状胚性愈伤 (直径约 2～3 mm) 为转化受体材料 ,
轰击前将其转至含甘露醇 (5 g/ L) 的 M3 上培养 12～24 h。每枪取 10μL 金粉 - DNA 复合体 , 氦气
压力为 1100 psi , 释放时间为 5 s。轰击后再将其转入不含筛选剂的 M4 上恢复一周后进行筛选培养。
轰击后两周内进行随机取样进行 Gus 酶活检测〔2〕。提取 T0 抗性植株叶片总 DNA〔3〕。按常规方法进行
B ar 基因的 PCR 反应 , B ar 特异性引物为 S1 (5pi2GGA TCC A TG A GC CCA GAA23pi) , S2 (5pi2TCA
GA T CTC GGT GAC GGG CA23pi) , 扩增产物用 112 %琼脂糖凝胶电泳检测。总 DNA 点杂交按 Sam2
brook 等〔4〕的方法进行。
T0 代植株的 PPT 抗性检测 : 用棉花蘸 013 % PPT 液对随机挑取的 10 片转化高羊茅叶片进行全
叶涂布 , 用量以来回 3 次为准 , 分别以各自的非转化组培苗作对照 , 室温自然光照培养。另外 , 用
013 % PPT 液分别对转化高羊茅盆与对照盆进行整体均匀喷施 , 用量至全株叶片都浸湿为止。
2 　结果与分析
211 　轰击次数与轰击距离对转化效果
的影响
轰击参数优化结果见表 1。无论是
轰击 1 枪还是 2 枪 , 都以子弹距可裂
圆片 6 cm , 子弹距轰击受体 6 cm 抗性
率最高。以子弹距可裂圆片 3 cm , 子
弹距轰击受体 9 cm 抗性率最低 , 这可
能是因为 3 cm 距离太近 , 氦气迸发时
加速距离短而影响对子弹的轰击力 ,
而 9 cm 则距离太远 , 迸发时子弹过于
分散且穿壁力减弱。同样轰击距离条
表 1 　不同的轰击条件对高羊茅转化效果的影响
Table 1 　Effects of different shoot conditions on tall fescue transformation
轰击枪数
No.
bom2
bardment
子弹距圆片
Distance from
particles to
rupture discs(cm)
子弹距受体
Distance from
particles to
calli (cm)
总愈伤数
No. total
calli
分化
长芽数
No. calli
regenerated
转化率
Frequency of
transformation
( %)
1 310 610 262 1610 611 ±014
1 610 610 282 2410 815 ±011
1 610 910 60 210 313 ±013
1 310 910 231 310 113 ±014
2 310 610 62 810 1219 ±013
2 610 610 118 2210 1816 ±015
2 610 910 235 2810 1119 ±011
2 310 910 409 910 212 ±013
件下 , 连续轰击 2 枪比只轰击 1 枪抗性率提高了 1 倍左右。因此 , 轰击 2 枪 , 子弹距可裂圆片 6 cm ,
子弹距轰击受体 6 cm 为最佳轰击参数。
212 　优化的基因枪转化体系的建立
基因枪轰击后的愈伤组织经 M4 上恢复 1 周后移入 M5 (含 PPT 10 mg/ L) 扩繁初筛一个月 , 再
移入 M6 (含 PPT 15 mg/ L) 扩繁再筛 1 个月后 , 发现转化瓶中大部分愈伤仍保持轰击前的状态 , 少
部分褐化 , 而非转化对照瓶则出现严重褐化。经两月筛选扩繁后移至 M7 (含 PPT 10 mg/ L) 中分化
筛选 , 非转化对照全逐渐褐化致死 , 而转化的抗性愈伤组织分化长出了绿芽 (图版 , 1) 。刚开始把绿
芽放入强光下诱导 , 半月后发现生根困难 , 及时在培养基中加活性炭及减弱光强与缩短光照时间 , 10
d 后发现芽在 M9 上长出了许多白根。转化株经炼苗后移入土壤 , 成活率达 100 %。
213 　GUS 酶活性、Bar 基因 PCR、分子杂交分析
图版 , 2 显示了 Gus 酶活检测结果 , 上排轰击愈伤出现了蓝色斑点 , 下排非轰击对照则无蓝色斑
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点 , 表明 pBar2Gus 经轰击后在愈伤内有了初步表达。图 2 显示了随机抽取的 5 个转化株的 B ar 基因
PCR 检测结果 , Lane 3～7 都有 015 kb 的特异扩增片段。图 3 显示了随机抽取的 10 个转化植株的总
DNA 点杂交结果 , A3～B6 转化株杂交信号都很强 , 与 PCR 检测的结果相同。
214 　T0转化植株的 PPT抗性表型检测结果
涂抹后 3 d , 非转化对照叶尖有 1/ 6 黄化 , 叶基有 1/ 4 黄化 , 转化植株仅叶尖有一点发黄 ; 9 d 对
照植株全叶黄化 , 叶尖枯萎 , 而转基因植株叶尖仅 1/ 6 黄化 ; 15 d 后对照全部枯死 , 转基因植株叶片
仅有 1/ 4 黄化。随机挑取的 10 片叶 (每株一叶) 全部表现出相同的强抗性 , 抗性率为 100 %。整盆
喷施与上述单个叶片的颜色变化情况大体一致 , 喷施 10 d 后非转化对照已由黄化开始枯死 , 转化盆
则仅叶尖部位略有黄化 (图版 , 3) 。
我们的转化方案中转基因植株从外植体诱导到移栽入土至少要 5 个月时间 , 后期分子检测 B ar
基因未发现假阳性个体 , 转化率最高达 1816 % , 比 Fredy 等〔5〕的 3 %～5 %转化率提高了很多。Cho
等〔6〕在 2000 年利用基因枪对来自于高羊茅与紫羊茅的种胚愈伤进行了转化 , 在 T0 代植株中分别得到
了 25 %～27 %和 50 %～70 %的高转化基因共表达频率。
参考文献 :
1 　马生健 , 曾富华. 高羊茅的组织培养 (摘编) . 植物生理学通讯 , 2003 , 39 (2) : 152
2 　Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plant : The GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep . , 1987 , 5 : 387～405
3 　王关林 , 方宏筠. 植物基因工程原理与技术. 北京 : 科学出版社 , 1998. 598～599
4 　Sambrook J , Fritsh E F , Maniatis T. Molecular cloning : a laboratory manual. New York : Cold Spring Harbor Press , 1989. 1～1000
5 　Fredy A , Jianping Xu. Rapid production of transgenic turfgrass ( Festuca rubra L. ) plants. Journal of Plant Physiology , 2000 , 157 : 441～448
6 　Cho M J , Ha C D , Lemaux P G. Production of transgenic tall fescue and red fescue plants by particle bombardment of mature seed2derived
highly regenerative tissues. Plant Cell Reports , 2000 , 19 (11) : 1084～1089
图版说明 : 1. 在分化筛选培养基上分化长芽 (左 : 对照 , 右 : 转化瓶) 。2. Gus 基因瞬时表达结果。3. 整株喷施 PPT (左 : 转化
株 , 右 : 对照) 。
Explanation of plates : 1. On differentiation selective medium (Left : Control , Right : Transformed flask) . 2. Transient expression of Gus
gene of tall fescue calli transformed . 3. PPT resistance analysis (Left : Transgenic plants , Right : Control) .
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