全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(2)：135—140
Acta Horliculturae Siniea
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‘禅寺丸’甜柿 2n花粉形成机制的研究
谷晓峰 罗正荣 2
( 华中农业大学园艺林学学院 ，武汉 430070； 湖北民族学院园艺系，恩施 445000)
摘 要：以 2n花粉发生频率较高的甜柿品种 ‘禅寺丸 ’为试材 ，研究影响 2n花粉形成的减数分裂行
为。结果表明：2n花粉形成受融合纺锤体 (fused spindles)，八字形纺锤体 (u4~,te spindles)及后期Ⅱ染色
单体不正常分离 (abnormal disorientation of sister chromatid)3种减数分裂行为控制；融合纺锤体及八字形纺锤
体形成的 2n花粉占2n花粉总数的94．8％，在遗传上等同于 FDR(first division restitution，第 1次分裂重组)
型配子；由姊妹染色单体不正常分离形成的 2n花粉在遗传上等同于 SDR (second division restitution，第 2次
分裂重组)型配子。甜柿 2n花粉绝大多数为 FDR型 ，因而在倍性育种中有重要的应用价值。
关键词 ：柿 ；2n花粉；减数分裂
中图分类号：S 665．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2003)02-0135-06
柿 (Diospyros kaki Thunb．)的栽培品种多为6倍体 (2n=6x=9o)，其中部分具雄花的品种可产生
2n花粉，比例为 0．1％ ～19．5％不等 ’¨2J。许多研究表明，利用 2n配子育种不仅可以提高杂种倍性，
而且在传递杂合性 (heterozygosity)和上位性 (epistasis)中有特殊的育种价值 】。2n配子形成主要来
自异常的减数分裂，根据其遗传效应 ，可分为第 1次分裂重组 (first division restitution，Ⅱ)R)和第 2
次分裂重组 second division restitution，SDR)两种类型，理论上 FDR可以传递亲本 80％以上的杂合
性，而SDR只有40％H】。Sugiura等利用筛选的 ‘禅寺丸’甜柿 2n花粉与 ‘次郎’授粉，借助胚抢救
技术获得了九倍体甜柿新种质，但研究没有涉及到 2n花粉的形成机理 】。庄东红等在观察 ‘禅寺丸’
花粉母细胞的减数分裂和小孢子形成过程时，发现了不减数分裂现象【5J，但未对其遗传效应进行分
析。为了增强育种工作的目的性及预见性，有必要首先了解亲本的 2n配子类型。本研究选用花粉量
大、未减数花粉含量多、生产上最常见的甜柿授粉品种 ‘禅寺丸’为试材，通过对其花粉母细胞减数
分裂过程的细胞学观测，研究了导致 2n花粉形成的减数分裂行为及其类型，以期为甜柿 2n配子育种
提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 材料
试材为武汉市林业技术推广站品种圃 (武汉市江夏区郑店镇 )成年 ‘禅寺丸’柿树上的雄花
芽。
1．2 方法
1．2．1 减数分裂过程观察
于始花前 30 d开始，每天上午采集雄花 1次 (60 80朵)，卡诺氏液 (乙醇 ：冰醋酸 =3：1)固定
2—24 h后，70％酒精4~C保存，共采集 18次。镜检时，蒸馏水洗去固定液或酒精，将适量花药内含
物挤于载玻片上，丙酸一苏木精一水合三氯乙醛染色5 min，压片，BH-2型Olympus显微镜观察并摄
收稿日期 ：2oo2—08—15；修回日期 ：2OO2—10—28
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30070529)；教育部优秀青年资助计划项 目；高等学校博士学科专项科研基金资助项 目
(1999004001)
*通讯作者。Authorfor corespondence．
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园 艺 学 报 30卷
影记录。
1．2．2 纺锤体及二分体、三分体和四分体数 目统计
选择处于中期 Ⅱ分裂相的花粉母细胞作镜检，随机观察 2O个视野，每个视野不少于 3O个分裂
相，统计各种纺锤体数目；同时，镜检处于分体阶段的花粉母细胞，随机观察 2O个视野 ，每个视野
不少于40个分体，统计二分体 、三分体及四分体数目。
1．2．3 2n花粉数 目及比例统计
2n花粉数 目统计按 2n花粉数 目=2Oy+Tr计算【引，其中 D)r代表二分体个数，Tr代表三分体个
数。每种分体形成的 2n花粉比例 =每种分体形成的 2n花粉数 目／花粉总数 (n+2n)，每种分体形成
的 2n花粉在总 2n花粉中所占比例 =每种分体形成的2n花粉数目／2n花粉总数。
1．2．4 2n花粉 DNA含量测定
采用德国 Partec公司的 Partec CyStain UV precise P试剂盒提取核 DNA和荧光染色。主要步骤：取
少量花粉放入 55 mm直径的塑料培养皿中，加入4OO 核提取缓冲液 (Solution A of the Hish Resolution
Kitfor Plant DNA，Partec，Minster，German)，用刀片破碎 花粉，释放细胞核；将样 品提取液通过
30／an细胞滤膜 (CeⅡ．Trics disposable filter，Partec)；向滤液加入 1．6 IlL的 DAPI核荧光染液 (4’，6．
diamidno．2．phenylindole，Solution of B of the kit)，测量仪器为 PAS倍性分析仪 (Partec)；以染色体数目
2n=90的 ‘罗 田甜柿 ’组培苗 叶片为对照。数据分析采用 Partec公 司的 DPAC软件 (Data Pool
Apphcation of Cytometre)。
2 结果与讨论
2．1 减数分裂过程中纺锤体类型
2．1．1 垂直纺锤体
‘禅寺丸’甜柿花粉母细胞减数分裂中期 Ⅱ可检测到细胞内存在两组染色体，一组呈极面观，一
组呈侧面观 (图版 ，1)，牵引其定位的两组纺锤体处于不同的平面，称为垂直纺锤体。
2．1．2 平行及融合纺锤体
减数分裂中期Ⅱ可以观测到平行纺锤体，即两组染色体处于同一平面 (图版，2)；后期Ⅱ可见纺
锤丝牵引染色体移向平行纺锤体两级 (图版，3)。融合纺锤体为平行纺锤体的一种特殊情况[ ，本试
验观察到两组染色体互相靠近、两组纺锤体融合为一体的现象 (图版，4)。
2．1．3 八字形纺锤体
花粉母细胞内一个平面的两组纺锤体互成一定角度，构成八字形纺锤体 (图版，5～7)。八字形
纺锤体也是平行纺锤体的一种特殊情况l7]，推测其对后期 Ⅱ的染色体分离以及核形成和分布有影响。
2．2 各种减数分裂行为对二分体、三分体及四分体形成的影响
花粉母细胞正常减数分裂后期 Ⅱ，染色单体在纺锤丝的牵引下向垂直纺锤体的四极移动，呈四面
体排列 (图版，8)，胞质分裂形成四分体，发育成 4个 n花粉。
在甜柿花粉母细胞减数分裂过程中，平行纺锤体为定位异常的纺锤体之一 ，并且较垂直纺锤体
更为常见，其在末期 Ⅱ牵引四组染色体处于一个平面 (图版，3)，形成四分体，发育成 4个 n花粉，
不参与2n花粉的形成。同时表 1结果显示，平行纺锤体和垂直纺锤体两者比例合计为78．16％，分
体阶段统计的四分体比例为 82．56％，两个数据接近，由此进一步证明平行纺锤体并不参与 2n花粉
的形成，因为如果平行纺锤体参与2n花粉的形成，则分体阶段统计的四分体比例将大大低于目前
值。
融合纺锤体在中期Ⅱ牵引两组染色体相互靠近，末期Ⅱ重组于一个核内，胞质分裂形成二分体，
产生 2个2n花粉 (图版，9)。表 1中显示融合纺锤体数目比例 (6．9％)大于分体阶段二分体比例
(4．82％)，说明可能一些融合纺锤体在减数分裂过程中并没有实现两核重组，而是形成 4个子核，胞
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质分裂为四分体 ，这也从另一方面验证了平行纺锤体没有参于 2n花粉的形成，而是形成四分体的机
制 。
关于是融合纺锤体还是平行纺锤体导致 2n配子形成的问题一直存在争议。某些研究表明，平行
纺锤体会导致 2n花粉形成【 ， ，而 R踟anna【m]和 Veile ]¨在马铃薯上的研究结果表明是融合纺锤体
而不是平行纺锤体导致 2n配子形成。本研究所获得的证据支持平行纺锤体不参与 2n花粉形成的观
点。
含有八字形纺锤体的细胞只有一极发生核重组，这一极含有两核，另两极各有一核，胞质分裂形
成三分体 ，发育成 1个 2n花粉和2个 n花粉 (图版，10、12)。由表 1可知，三分体由八字形纺锤体
和姐妹染色单体异常分离两种分裂行为形成，其分布比例为 12．62％，明显低于八字形纺锤体分布频
率 (13．79％)，究其原因可能是由于八字形纺锤体在花粉母细胞内所成的角度不同 (图版，5—7)，
一 些角度较小的八字形纺锤体虽然牵引两组染色体向纺锤体一级移动，但 由于到达时两者相距较远，
无法实现核重组而形成三分体。
此外，本试验在减数分裂后期 Ⅱ还观测到少量的特殊分裂现象，此期正常的分裂应该是每组染色
体的姐妹染色单体在纺锤丝的牵引下各自移向纺锤体两极；但在一些花粉母细胞中，一组染色体的姐
妹染色单体分离正常，而另一组染色单体并不在纺锤丝的牵引下移向两极，而是包含在一个核内 (图
版，11)，形成三分体。Ray等在冰草研究中也曾观察到此异常分裂现象u 。
表 1 花粉母细胞中期 Ⅱ各种纺锤体和分体阶段二分体、三分体及四分体分布频率
Table1 FreqI蛐 of dlfereat叩indl荡 atmetal，II躐 1I ofI cI ip叫。 aim dyads。 triads。aim tetrads at s0orad stage
2．3 2n花粉的形成与二分体、三分体比例的关系
已知二分体发生频率为4．82％，三分体发生频率为 12．62％，四分体为 82．56％。按 1个二分体
产生 2个 2n花粉 ，1个三分体产生 1个 2n花粉和2个 n花粉 ，1个四分体产生4个 n花粉估算，则由
二分体产生的2n花粉比例为 2．57％，由三分体产生的 2n花粉比例为 3．34％，两者合计为 5．91％。
利用花粉直径差异统计了1 256个花粉粒，2n花粉的发生频率为6．13％，和通过分体比例得到的2n
花粉的发生频率基本一致。由此可见，甜柿 2n花粉的产生是以中期 Ⅱ八字形纺锤体定位形成三分体
和融合纺锤体定位形成二分体为主要途径的。
2．4 2n花粉 DNA含量的测定
小孢子四分体阶段，二分体或三分体的出现是 2n配子形成的最直接证据[ ]，通过二分体和三分
体比例统计的 2n花粉比例为5．91％，为了进一步确认这些大花粉倍性是否为正常花粉的两倍，以六
倍体植株叶片为对照 ，利用 PA倍性分析仪进行了花粉 DNA含量的测定。测定结果显示 自然花粉出现
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一 个主峰 (55．14)和一个小峰 (115．68)(图 1，B)，
植株叶片的荧光强度 (124．24)基本一致 (图 1，A)，
由此进一步验证了大花粉为染色体未减数的2n花粉。
j
j
目
葺
j
o
U
巅
j
理
再
小峰荧光强度约为主峰的两倍 ，与对照六倍体
这说明大花粉核 DNA含量是正常花粉的两倍 ，
200 300 4O0 500
荧光强度Fluorescence intensity 荧光强度Fluorescence intensity
图1 花粉核 DNA流式细胞光度分析
A：对照 (6倍体叶片)；B：花粉。
． 1 Analyses offlow cytometry ofnud~ir DNA
A：Control(hexaploid plant，leaf)；B：Natural pou~m．
2．5 不同减数分裂行为形成的 2n花粉的遗传效应
一 般认为，同一物种 2n配子的发生受多种机制控制 ，形成的是 FDR型和 SDR型配子的混合体【1引。
本研究结果显示 ‘禅寺丸’形成的 2n花粉为两种配子的混合体(表 2)：融合纺锤体和八字形纺锤体形成
的2n花粉含有整套亲本染色体组中的所有的非姐妹染色单体，包含有亲本的大部分遗传信息，在遗传
上等同 FDR型配子，两者形成的 2n花粉所占比例合计达 94．8％；姐妹染色单体不正常分离形成 2n花
粉机制中，由于是姐妹染色单体不能正常分离，包含在一个核内，形成的2n花粉最多仅含有亲本一
半的遗传信息，在遗传上等同于SDR型配子。同一材料中不同类型2n配子的存在，对于推断2n配子
的育种学价值是很有用处的。
表 2 不同减数分裂行为形成的 2n花粉类型
Table 2 Genetictypeof2np0Ⅱ皤 formatted by d萱矗l朗qltm sm睫ha 圈啮
3 小结
甜柿 2n花粉形成主要受 3种不正常减数分裂行为控制 ，最主要 的是八字形纺锤体 (triangk
spindles)，其次为融合纺锤体 (fused spindles)，形成三分体和二分体，发育成 2n花粉，同时利用 PA
倍性分析仪测定花粉的 DNA含量 ，进一步确定了2n花粉的倍性。由于 FDR型 2n配子在传递亲本杂
合性及上位性方面比SDR高的多，因而近年来被广泛用于三倍体育种及从低倍性的野生型转移优良
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 0
2 2 l l
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基因到高倍性的栽培品种。甜柿94．8％的2n花粉属于 FDR型，因此在倍性育种上有重要的应用价
值。
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Abnormal Meiosis
kak／Thunb．)
Gu Xiaofeng and l_uo ZhengrongI·
( Colege of Horticulture and Forestry，Huazhong Agticula~al
Hubei Institutefor Nationalities，Enshi 445000，China)
Unitersity，Wuhan 430070，Ch／na； D甲田 of Hoa／mdmre，
Abstract：The objective of this study was to determine the eytolngieal origin of 2n posen in‘Zenjiman】’
persimmon．Polen mother cel analyses revealed that 2n polen resulted from fused spindles，tri~ ,le spindles ，or
abnormal disorientation of sister ehromatid during metaphase II and anaphase II of mierosporogenesis．94 ．8％ of
2n po len formation was controled by fused spindles an d tI~tngle spindles ，which were genetically equivalent to first
division restitution(FDR)type of gamete formation．The other 2n polens were geneticaly equivalent to second
division restitution(SDR)type of gamete formation．Thus 2n polen produced from IjiIlal1l persimmon cal
provide potential value for po lyploidy breeding in persimmon．
Key words： Persimmon；2n po len；Meiosis
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140 园 艺 学 报 30卷
图版说明：1．中期Ⅱ垂直纺锤体 (X 360) 2．中期 Ⅱ平行纺锤体侧面观 (X 360) 3．后期 Ⅱ平行纺锤体 (X 360) 4．中期
Ⅱ融合纺锤体 (X 660) 5—7．中期 Ⅱ八字形纺锤体 (X 360) 8．末期 Ⅱ垂直纺锤体 (X 550) 9．二分体 (X 360) 10．三
分体 (X 70) 11．姊妹染色单体不正常分离 (X 660) 12．2n花粉 (箭头所示)和 n花粉 (X 70)
锄a60nof pImes：1．perpendicular spindles at metaphase I (X 360) 2．paralel spindles with two side views(X 360) 3．paralel
spindles at ar )lase I (X360) 4．fused spindles atm apIlase I (Xo5o) 5～7．t~glgle~,ldles atmeI叩hase I (X 360) 8．per-
pendieular spindles at tdq I (x 55O) 9．dyad(x 36o) 10．triad(x 7o) 11．almonnity-disintegtafioa 0f si或盯d a吡 d(x
660) 12．unreduced (arrows)and polen(X 70)
《园艺学报》被引频次、影响因子在中国科技期刊排序中名列前茅
●据中国科学技术信息研究所2O02年 11月公布，本刊总被引频次 (795)和影响因子 (0．528)在
全国1447种科技期刊中分别居第鼹位和第 152位；在农业类科技期刊中分别居第3位和第6位。
●据中国科学引文数据库统计的中国科技期刊前 300名排行表，本刊均居第42位。
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