全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (5) : 885～888
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 22; 修回日期 : 2005 - 04 - 11
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30170640) ; 辽宁省自然科学基金资助项目 (20022080)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: ltl@mail1syau1edu1cn)
番茄酸性转化酶 cDNA片段的克隆与表达分析
姜　晶　李天来 3 　李　伟
(沈阳农业大学园艺学院 , 辽宁省设施园艺重点实验室 , 沈阳 110161)
摘 　要 : 根据番茄细胞壁束缚性和可溶性酸性转化酶基因序列分别设计引物 , 以普通栽培型番茄
(Lycopersicon escu len tum ) ‘辽园多丽 ’和 ‘桃太郎 ’及野生番茄 (L ycopersicon chm ielew skii) 的幼苗为材料
提取总 RNA, 采用 RT2PCR方法 , 扩增出目的 cDNA序列的部分片段并克隆到 pMD182T载体中。经测序后
发现不同基因型番茄的酸性转化酶基因具有高度同源性 , 达到 9915%。进一步检测其在 ‘辽园多丽 ’果实
发育不同时期的表达变化 , 结果表明主要在成熟果实的胶质胎座中大量表达 , 而在果实的其它部位几乎检
测不到其表达。
关键词 : 番茄 ; 酸性转化酶 ; RT2PCR; 序列分析 ; 基因表达
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520885204
C lon ing and Expression Ana lysis of Ac id Inverta se Gene cD NA Fragm en t
from Toma to
J iang J ing, L i Tianlai3 , and L iW ei
( College of Horticulture, Shenyang A gricultural U niversity, L iaon ing Key L abora tory of Protected Horticu lture, Shenyang 110161,
China)
Abstract: According to the published gene sequences of cell wall2binding and soluble acid invertase of
tomato, two pairs of p rimers were designed respectively. The cDNA fragments were obtained by reverse tran2
scrip tional polymersae chain reaction (RT2PCR ) using the whole RNA of different genotype tomatos, ‘L i2
aoyuan Duoli’, ‘Momotaro’and wild type (L ycopersicon chm ielew sk ii) , as the temp lates. The fragments
were cloned into pMD182T vector and then sequenced. The sequences showed highly homology ( to 9915% )
to the published sequences of soluble and insoluble invertases, respectively. Northern blotting was performed
to analyze the exp ression pattern of acid invertase in different development stages of tomato fruit of‘L iaoyuan
Duoli’. The result showed that soluble acid invertase was highly exp ressed in pectinic p lacenta of mature to2
mato fruit, but no exp ression was detected in other parts of fruits.
Key words: Tomato; Acid invertase; RT2PCR; Sequence analysis; Gene exp ression
1　目的、材料与方法
大多数植物的库器官都是以蔗糖的形式接受碳源和能源 , 蔗糖进入库代谢需要转化酶等酶类分解
成为葡萄糖和果糖。其中转化酶主要又以可溶性 (液泡 ) 和细胞壁束缚性两种状态存在 , 这两种形
态的转化酶是由两类完全不同的基因家族编码的〔1, 2〕。不同形式的转化酶在植物不同发育阶段和不同
组织中的作用也不同。因此仅从酶活性测定无法阐明转化酶作用的内在本质 , 只有获得基因 , 进而进
行表达研究才可阐明每个成员在蔗糖代谢与积累及其生理功能的分子机理。目前尚未见在果实发育过
程中番茄酸性转化酶基因在果实维管束系统各部位的表达 , 笔者对此进行了初步探索。从而为深入研
究转化酶基因表达和番茄品质改良提供有用的信息。
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
试材为番茄 (L ycopersicon escu len tum ) 品种 ‘辽园多丽 ’, ‘桃太郎 ’和野生番茄 (L ycopersicon
chm ielew sk ii)。分别取 011 g嫩叶 , 按组织 /Trizol试剂为 50～100 mg/mL提取总 RNA。根据 Genbank
中所登录的番茄酸性转化酶基因的保守序列 , 利用 DNAMAN 510软件进行引物设计。设计细胞壁束
缚性的酸性转化酶基因 (AF5060005) 正向引物为 A I1F: 5pi2TTCTTCTCTTTGGGCTTTGCC, 反向引物
为 A I1R: 5pi2CCAATTCCCAGTACCCTGAGC; 可溶性的酸性转化酶基因 (AF465613 ) 正向引物为
A I2F: 5pi2AACTCCGCCTCTCGTTACACA, 反向引物为 A I2R: 5pi2TAGGATGGTAGCGGACCCTG。委托上
海生工生物工程有限公司合成。以提取的 RNA为模板进行反转录之后向反应体系中加入 10 ×Taqp lus
buffer 2μL, 10 mmol/L dNTP 015μL, 2μmol/L正向引物 2μL, 2μmol/L反向引物 2μL, cDNA模
板 2μL, 灭菌 H2 O 11μL, Taqp lus DNApolymerase 015μL (5 U /μL)。PCR反应参数为 94℃预变性 5
m in, 随后 94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 1 m in, 35个循环后 , 72℃再延伸 10 m in。目的 DNA片段利用
DNA片段纯化回收试剂盒 (大连宝生物 DNA Fragment Purification Kit, DV807A ) 回收后与 pMD182T
载体连接 , 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞。按碱裂解法少量提取质粒。以质粒 DNA为模板进行
PCR鉴定 , 委托上海生工生物工程有限公司测定 DNA序列。取番茄开花后 15、25、35、45和 55 d
的果实 , 按果柄维管束、萼片、果实维管束、中果肉和胶质胎座 5个部位分别取样 , 提取总 RNA ,
经 112%的甲醛变性电泳分离后 , 采取毛细转移将 RNA转移到尼龙膜上进行杂交。杂交探针酸性转
化酶 cDNA片段采用地高辛标记方法 , 所有操作均按照 D IG H igh Prime DNA Labeling and Detection
Starter KitⅡ (Roche) 提供方法进行。
2　结果分析与讨论
211　不同品种番茄酸性转化酶基因的 RT2PCR扩增
以不同品种番茄叶片总 RNA为模板 , 进行 RT2PCR扩增 , 扩增产物经 018%琼脂糖凝胶电泳检
测 , 在两个栽培种和 1个野生种中均扩增得到预期大小的酸性转化酶的 cDNA片段 , 其中细胞壁束缚
性酸性转化酶 cDNA片段为 717 bp, 可溶性的酸性转化酶 cDNA片段为 526 bp (图 1)。
图 1　番茄酸性转化酶基因的 RT2PCR产物电泳图谱
M. DNA Marker; 1, 2分别表示细胞壁束缚性和可溶性酸性
转化酶 ; A, B , C分别表示 ‘辽园多丽’、‘桃太郎’和
野生番茄 (Lycopersicon chm ielewskii)。
F ig. 1　Electrophoresis pa ttern of ac id inverta se RT2PCR
products of toma to
1, 2 indicate cell wall2binding acid invertase and soluble acid invertase;
A, B and C indicate‘L iaoyuan Duoli’, ‘Momotaro’and wild type
(Lycopersicon chm ielewskii) , respectively.
图 2　‘辽园多丽’酸性转化酶基因的质粒 PCR产物电泳图谱
M. DNA Marker; 1, 2表示细胞壁束缚性酸性转化酶 ;
3, 4表示可溶性酸性转化酶。
F ig. 2　Electrophoresis pa ttern of pla sm id PCR products
of‘L iaoyuan D uoli’ac id inverta se
1, 2 indicate cell wall2binding acid invertase; 3, 4 indicate
soluble acid invertase.
212　PCR产物的克隆
RT2PCR产物纯化后与 pMD182T载体连接 , 转化大肠杆菌 DH5α。每个番茄品种的两对基因各挑
取 2个克隆提取质粒。PCR检测为阳性 , 这表明 PCR产物已克隆到载体上 (图 2)。将鉴定为阳性的
克隆进一步进行测序。
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　5期 姜 　晶等 : 番茄酸性转化酶 cDNA片段的克隆与表达分析 　
213　不同番茄酸性转化酶 cD NA片段的序列比较分析
将不同品种番茄的同一序列在 DNAMAN 510中进行多序列比对。结果表明 : 不同品种番茄的
酸性转化酶基因高度同源。同源性达到 9915%。只有个别碱基的差异 (以可溶性酸性转化酶基因
为例的序列比对如图 3所示 , 只列出有差别的部分 )。这说明我们已从不同品种番茄中克隆到基因
序列几乎相同的酸性转化酶基因的 cDNA片段 , 并且酸性转化酶 cDNA序列在番茄中是高度保守
的 , 至于糖在两类番茄中积累的形式不同 , 可能是由于编码酸性转化酶基因的表达在时间和空间
分布不同造成的。
图 3　不同基因型番茄可溶性酸性转化酶基因测序结果的多序列比较分析
Z12025表示 GenBank中可溶性酸性转化酶基因片段序列 ; 符号 “3 ”表示 4组序列比对完全相同的碱基。
F ig. 3　M ultiple sequence ana lysis in d ifferen t genotype toma to fru its of soluble ac id inverta se
Z12025 indicated fragment of soluble acid invertase in GenBank; Symbol indicated by“3 ”is identical in all four sequences.
214　番茄酸性转化酶基因的表达分析
以番茄液泡转化酶的 cDNA片段为探针 , 对
‘辽园多丽’果实发育中的表达做了进一步研究。
结果表明可溶性酸性转化酶基因在果实胶质胎座
中表达比较明显 , 而且随着果实的发育其表达逐
渐增强 , 在果实发育成熟时表达最强。然而在果
柄维管束、萼片、果实维管束及中果肉中几乎检
测不到其表达 (图 4)。这一结果说明番茄酸性转
化酶基因在果实的维管束系统可能没有表达 ,
或其表达量低到检测不到的程度。酸性转化酶
在植物果实中的表达部位和强度不同 , 会改变
植物同化物的分配情况。已有研究表明在蔗糖
积累型的野生番茄中酸性转化酶含量很低 , 进
一步的分子水平研究结果表明 , 转化酶基因在
该果实发育过程中发生转录水平的沉默 , 导致
其在果实中翻译的蛋白也相应减少 , 从而使蔗
糖不能降解为果糖和葡萄糖〔3〕。而本研究中选
用的己糖积累型番茄 ‘辽园多丽 ’在果实胶质
胎座的发育过程中 , 自发育的中期开始出现酸
性转化酶基因表达 , 并且在成熟果实中表达是
逐渐增强的 , 从而使蔗糖由维管束卸载后能够
分解为果糖和葡萄糖。
图 4　以 A I2片段为探针的 RNA变性电泳检测可溶性酸性
转化酶的转录表达
每泳道 RNA的上样量为 30μg; 酸性转化酶转录水平的相对量通
过 OD值以及 rRNA的溴化乙锭染色在每一时间点进行定量。
F ig. 4　RNA gel blot ana lysis shows expression of soluble ac id
inverta se tran scr ipts by using the A I2 fragm en t a s probe
Total RNA (30μg) was loaded in each lane. Relative acid invertase
transcrip t levels were quantified by densitometry and normalized
according to ethidium brom ide staining of ribosomal RNA
for each time point.
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　　齐红岩等〔4〕以普通栽培型番茄为试材进行的 14 C示踪研究结果表明 , 光合产物在番茄果实维管束
系统中主要以蔗糖的形式运输 , 从维管束系统卸载到果实胶状物质后 , 才分解成为果糖和葡萄糖 ; 蔗
糖在果实维管束系统的运转中几乎没有发生降解。由于蔗糖主要由酸性转化酶与蔗糖合成酶催化降
解 , 而在本研究中酸性转化酶基因主要在果实的胶质胎座中表达 , 也就是蔗糖卸载到果实胶质胎座后
才开始降解 , 这与已有的 14 C示踪研究报告一致 ; 而在维管束中未检测到转化酶的大量表达 , 同样也
是蔗糖在维管束不被降解的主要原因。但在中果肉中没有检测到酸性转化酶的表达 , 而 14 C示踪表明
在中果肉中糖类主要以果糖和葡萄糖形式存在。这说明蔗糖可能在胶质胎座被完全降解 , 然后以果糖
和葡萄糖的形式运输到中果肉。笔者虽然就己糖积累型番茄酸性转化酶基因在果实发育过程中的表达
进行了研究 , 但有关己糖积累型番茄酸性转化酶基因在各种胁迫条件的表达变化及其对果实发育和蔗
糖代谢的影响还有待于进一步研究。
参考文献 :
1　Tang G Q, LuscherM, Strm A. Antisense rep ression of vacuolar and cell wall invertase in transgenic carrot alters early p lant development and
sucrose partitioning. The Plant Cell, 1999, 11 (1) : 177～189
2　Sturm A, Tang G Q. The sucrose2cleaving enzymes of p lants are crucial for development, growth and carbon partitioning. Trends in Plant Sci2
ence, 1999, 4 (10) : 401～407
3　Klann E M, Chetelat R T, Bennett A B. Exp ression of acid invertase gene controls sugar composition in tomato (Lycopersicon) fruit. Plant
Physiology, 1993, 103 (3) : 863～870
4　齐红岩 , 李天来. 番茄光合产物运转途径上 14 C - 可溶性糖的变化. 见 : 朱德蔚主编. 中国园艺学会第九届学术年会论文集. 北
京 : 中国科学技术出版社 , 2001. 177～181
Q i H Y, L i T L. Change of 14 C2soluble sugar along photosynthate translation pathway of tomato. In: Zhu D W ed. The symposium of the 9 th
China horticultural institute annual academ ic conference. Beijing: China Science and Technology Press, 2001. 177～181 ( in Chinese)
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