全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (2) : 256～261
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 06 - 07; 修回日期 : 2004 - 07 - 26
基金项目 : 上海市科技兴农重点攻关项目 (20012323; 2003D22121) ; 国家自然科学基金项目 (30470120) ; 国家高技术研究发展计划专项
(2002AA241251; 2004AA241120)3 通讯作者 Author for correspondence
黄瓜全雌性基因连锁的 AFL P和 SCAR分子标记
娄群峰 1 　陈劲枫 13 　Molly Jahn2 　陈龙正 1 　耿　红 1 　罗向东 1
(1 作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 康乃尔大学育种系 , 伊萨卡 , 纽约
14853, 美国 )
摘 　要 : 本研究以全雌品种 ‘戴多星 ’自交系和弱雌品种 ‘北京截头 ’自交系为双亲杂交获得 F1 ,
然后得到 F2 性型分离群体 , 利用分离群体分组分析法 (Bulked SegregantAnalysis, BSA) 构建全雌和弱雌两
个基因池 , 筛选了 64对 AFLP选择性引物 EcoR I2NN +M se I2NNN组合 , 发现 EcoR I2TG +M se I2CAC引物组合
在全雌基因池中扩增出一条分子量为 234 bp的特异带。经 F2 代单株验证 , 该特异条带能在全雌单株中稳
定出现。以 MAPMAKER (Version 310) 软件分析 , 该标记与全雌性位点的连锁距离在 617 cM。命名该连锁
标记为 TG/CAC234。将该特异条带回收、克隆、测序 , 设计特异 SCAR引物 , 再对 F2 代单株基因组 DNA进
行扩增 , 仅在全雌单株中扩增出 1条分子量为 166 bp的特异带 , 表明已成功地将与黄瓜全雌性连锁的
AFLP标记转化为操作简便、表现稳定的 SCAR标记 , 该标记命名为 SA166。
关键词 : 黄瓜 ; 全雌性 ; 分子标记 ; AFLP; SCAR
中图分类号 : S 64212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0220256206
Iden tif ica tion of AFL P and SCAR M olecular M arkers L inked to Gynoec ious
L oc i in C ucum is sa tivus L.
Lou Qunfeng1 , Chen J infeng13 , Molly Jahn2 , Chen Longzheng1 , Geng Hong1 , and Luo Xiangdong1
(1 S ta te Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, College of Horticu lture, N an jing A gricu ltura l U niversity,
N an jing 210095, China; 2D epartm ent of P lan t B reeding, Cornell U niversity, Ithaca, N Y 14853, USA )
Abstract: Gynoecy p lays an important role in cucumber ( Cucum is sa tivus L. ) heterosis breeding and
identification of the markers linked to this character will facilitate selection of gynoecious cucumber line in
breeding p rogram. In the p resent study, selfed gynoecious cucumber‘Delta Star’and monoecious cucumber
‘Beijing J ietou’were used as parents to make F1 and then selfed to build F2 sex segregated population. Gyno2
ecious and monoecious DNA pools were developed separately using bulked segregant analysis (BSA ). Amp li2
fied fragment length polymorphism (AFLP) technique with 64 p rimer combinations were emp loyed to find the
polymorphism s between both DNA pools, and in gyneocious DNA pool a 234 bp specific fragment was amp li2
fied in the p rimer combination of TG + CAC. This marker was testified with individual DNA of the F2 popula2
tion and the band could only be amp lified in the gynoecious p lants. L inkage analysis using the software of
MAPMAKER ( version 310) indicated its genetic distance to the gynoecious loci was 617 cM , and this AFLP
marker was designed as TG/CAC234. This band was collected and sequenced to synthesize a sequence2charac2
terized amp lified region ( SCAR) p rimer. The p rimer was used to amp lify the individual DNA s of the F2 popu2
lation and obtained a specific band of 166 bp in the gynoecious p lants, indicating a successful conversion of
the SCAR marker from AFLP one. This SCAR marker was designed as SA166 , and has been p ractically useful
to the marker2assisted selection in our cucumber breeding p rogram.
Key words: Cucumber (Cucum is sa tivus L. ) ; Gyneocious; Molecular marker; AFLP; SCAR
　2期 娄群峰等 : 黄瓜全雌性基因连锁的 AFLP和 SCAR分子标记 　
黄瓜 (Cucum is sa tivus L. ) 是重要的设施栽培作物 , 其雌花率的高低直接影响到产量的多少。目
前设施栽培优良的黄瓜品种都具备全雌性或强雌性特征。全雌性是黄瓜优势育种的重要途径。但由于
黄瓜性别表现受到遗传和环境等多种因素的影响 , 应用传统的方法 , 从表型上进行全雌性基因的选择
效率不高 , 给全雌性的有效利用带来困难。应用与目的基因相连锁的分子标记进行辅助育种能直接从
基因型上对后代单株进行选择 , 提高准确率 , 从而大大地提高育种效率。
目前 , 与植物性别决定基因连锁的分子标记研究主要集中在雌雄异株植物中 , 如大麻 (Cannibis
sa tivas L. )〔1, 2〕、石刁柏 (A sparagus off icina lis L. )〔3〕、银杏 (Ginkgo biloba L. )〔4〕等。相比之下黄瓜性
别表现更为复杂 , 除雌雄异花同株外 , 还有全雌株、两性株、雄花两性花同株 , 雄花、雌花及两性花
同株等类型。黄瓜全雌性状被认为主要由 F基因控制 , 同时还受到隐性 gy基因和一些修饰基因的作
用〔5, 6〕。迄今 , 有关黄瓜性别决定相关基因的分子标记研究较少。已构建的少数黄瓜分子标记连锁图
谱将 F基因进行了定位 , 如 Fazio等〔7〕发表的连锁图上与 F基因最近的为 510 cM的 1个 SSR标记。
然而 , 在这些连锁图上 , 对 F位点贡献率的解释有所差异〔7～9〕。因此 , 目前能用于黄瓜全雌性辅助育
种实践的分子标记仍不多见。
AFLP标记技术现已普遍地用于图谱的构建〔10, 11〕、性状连锁标记的筛选〔12, 13〕、亲缘关系的分
析〔14〕等工作。本研究利用 AFLP技术 , 研究与黄瓜全雌性状连锁的标记 , 希望获得连锁紧密的 AFLP
标记 , 以实现黄瓜全雌性状的标记辅助育种 , 加速我国黄瓜全雌性品种的选育进程。
1　材料与方法
111　植物材料和性型分离群体的构建
亲本 1: CC3, 华北型黄瓜品种 ‘北京截头 ’ (来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 编号为
V05A464) 的 8代自交后代。雌花率在 20%以下 , 为纯合弱雌 ; 果皮多刺。
亲本 2: EC1, 欧洲雌性系 ‘戴多星 ’ (来源于 R IJK ZWAAN公司 ) 的 6代自交后代。未见出现
雄花的单株 , 为纯合全雌 ; 果皮光滑。
利用 CC3和 EC1的正反交 F1、F2 代和以 CC3为回交亲本的 BC1 代作性型遗传分析 , 分离比例以
卡方测验进行显著性分析。各代的性型统计以全株上下均为雌花 , 无 1朵雄花为全雌性 ; 主茎 20节
内雌花与雄花比例大于 50%为强雌性 ; 小于或等于 50%的为弱雌性。
利用 F2 代群体进行 AFLP分子标记研究。F1 代的全雌单株自交时 , 利用 300 mg/kg的硝酸银水
溶液于 3～4片叶龄进行叶面喷施 , 每隔 3 d喷施 1次 , 共喷施 2次。诱导出雄花后进行单株隔离授
粉。
112　AFL P研究方法
AFLP研究主要参考 Vos等〔15〕的方法。其中条带的显示采用银染法。部分步骤略有修改。
11211　基因组 DNA的提取和 DNA池的构建 　基因组 DNA提取采用 CTAB法〔16〕。利用琼脂糖凝胶电
泳和溴化乙淀显色进行 DNA浓度的定量。F2 单株 DNA提取后 , 利用 BSA法〔17〕各取 10个全雌和弱
雌单株 DNA等量混合 , 构建成全雌和弱雌 DNA池用于 AFLP引物的多态性筛选。
11212　酶切和接头的连接 　取 015μg基因组 DNA , 采用 EcoR I和 M se I进行双酶切。酶切后与 EcoR I
和 M se I接头连接。EcoR I接头 : 5pi2CTCGTAGACTGCGTACC23pi, 3pi2CATCTGACGCATGGTTAA25pi; M se I
接头 : 5pi2GACGATGAGTCCTGA23pi, 3pi2TACTCAGGACTCAT25pi。
11213　酶切连接产物的扩增 　取 5μL酶切连接产物为模板进行预扩增。预扩增程序为 : 94℃ 1 m in,
56℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 36个循环 ; 72℃延伸 7 m in。
预扩增产物 1∶30稀释 , 作为选择性扩增的模板。选择性引物组合共 64对 , 由 8个带 2个选择性
碱基的 EcoR I2NN引物 , 和 8个带 3个选择性碱基的 M se I2NNN引物组成。选择性扩增程序为 : 94℃
预变性 30 s; 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 120 s, 然后每个循环退火温度降低 017℃, 经 13个循环后 ,
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退火温度降至 56℃; 再进行 23个循环的扩增 :
94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 120 s。
扩增反应在 PTC2100 PCR仪上进行。所用预
扩增和选择性扩增引物序列见表 1。
11214　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 　选择性扩增产
物在 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶 (6%丙烯酰胺 ,
0132%甲叉丙烯酰胺 , 7 mol·L - 1 尿素 , 1 ×
TBE) 中电泳分离。电泳缓冲液为 1 ×TBE, 恒
功率 60 W 预电泳 30 m in后 , 将扩增产物加入等
体积的上样缓冲液 (98%甲酰胺 , 10 mmol·L - 1
EDTA, 0125%溴酚蓝 ) , 95℃变性 5 m in后 , 立
即转移至冰浴中冷却 , 然后每个样品取 8μL上
样 , 60 W电泳 2～3 h。
11215　银染 　电泳后 , 小心分开两块玻璃板 , 将
附着凝胶的长玻璃板放入 10%冰醋酸中固定 30
m in; 再用去离子水漂洗 2次 , 每次 5 m in; 然后
表 1　AFL P预扩增和选择性扩增引物序列
Table 1　Pre2am plif ica tion and selective am plif ica tion pr im er
sequences used in AFL P
预扩增引物 3
Primers for
p reamp lification
选择性引物
Primers for selective amp lification
E00 E2AA 5pi2GACTGCGTACCAATTCAA23’
E2AG 5pi2GACTGCGTACCAATTCAG23pi
E2AC 5pi2GACTGCGTACCAATTCAC23pi
E2AT 5pi2GACTGCGTACCAATTCAT23pi
E2TA 5pi2GACTGCGTACCAATTCTA23pi
E2TG 5pi2GACTGCGTACCAATTCTG23pi
E2TC 5pi2GACTGCGTACCAATTCTC23pi
E2TT 5pi2GACTGCGTACCAATTCTT23pi
M00 M2CAA 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACAA23pi
M2CAG 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACAG23
M2CAC 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACAC23pi
M2CAT 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACAT23pi
M2CTA 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACTA23pi
M2CTG 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACTG23pi
M2CTC 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACTC23pi
M2CTT 5pi2GATGAGTCCTGAGTAACTT23pi3 E00: 5pi2GACTGCGTACCAATTC23pi; M00: 5pi2GATGAGTC2
CTGAGTAA23pi。
转入染色液 (2 g硝酸银 , 3 mL 37%甲醛溶于 2 L去离子水 ) 中染色 30 m in, 用 2 L去离子水快速漂
洗 5～6 s, 立即转入显影液 (60 g碳酸钠 , 3 mL 37%甲醛 , 400μL 10%硫代硫酸钠溶于 2 L去离子
水 ) 中 , 轻摇至条带清晰后 , 加入等体积的 10%冰醋酸停显 , 约 10 m in后用去离子水漂洗干净。自
然干燥保存。
11216　连锁性分析 　利用 Mapmaker ( version 310) 软件对 F2 代分离群体单株的标记和性型表现数据
进行连锁分析 , 并利用 Kosambi函数将重组率转化为遗传图距 ( cM )〔18〕。
113　特异条带的回收克隆及 SCAR标记的转化
对连锁标记进行条带的回收。以灭菌的解剖刀准确切下多态条带 , 转入装有 200μL重蒸水的离
心管中。置于沸水浴中 15 m in, 然后 12 000 r·m in - 1离心 10 m in。取 5μL上清液作为模板再次以相
应引物组合 , 相同条件进行扩增。扩增产物经测序胶电泳验证分子量后 , 克隆于 pGEM 2T easy载体
上 , 单菌落质粒提取后 , 经酶切鉴定 , 由上海博亚生物技术有限公司进行 DNA测序。
根据测序后去除接头的全序列 , 利用 Primer Prem ier 510软件设计 SCAR引物 , 由上海博亚生物
技术有限公司合成引物。以 F2 代单株的基因组 DNA验证 SCAR引物的特异性。SCAR2PCR扩增体系
20μL, 其中包含 10 ×Buffer 2μL, MgCL2 115 mmol·L - 1 , dNTP 150μmol·L - 1 , 引物 015μmol·
L - 1 , 基因组 DNA约 50 ng, Taq DNA聚合酶 1 U。扩增程序为 : 94℃预变性 5 m in; 94℃ 1 m in, 63℃
1 m in, 72℃ 2 m in, 30个循环 ; 最后在 72℃下延伸 7 m in。
2　结果与分析
211　利用分离群体进行黄瓜全雌性遗传规律分析
以全雌性 EC1和弱雌性 CC3为亲本进行正反交获得 F1 代。共观察 F1 代单株 54株 , 均表现全雌
性 , 全株上下无一朵雄花 , 说明黄瓜全雌性对弱雌性为完全显性 , 由核基因控制。对 BC1 和 F2 代群
体单株的性型统计表明 , BC1 代群体共有 98株 , 其中 53株全雌性 , 45株弱雌株。经 X2 测验 , BC1
代全雌与弱雌株比例完全符合 1∶1的分离比 ( P值为 0125～015, 大于 0105) , 表明黄瓜全雌性状由
单显性基因控制。同时对 F2 代共 166个单株的性型统计表明 , 其中全雌性 67株、强雌性 57株、弱
雌性 42株。理论上来说 , F2 代单株性型表现应该为两种类型 , 即全雌型和弱雌型。但在本试验中 ,
F2 代群体也有出现少量雄花的强雌性株 , 可能是雌性表现受到环境条件的影响 , 产生少量雄花 , 因
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　2期 娄群峰等 : 黄瓜全雌性基因连锁的 AFLP和 SCAR分子标记 　
此统计时将全雌株和强雌株合并作为雌性株 , 经 X2 测验 , F2 代雌性株与弱雌株分离比例完全符合
3∶1的比例 ( P值 = 1, 大于 0105) , 也表明黄瓜全雌性状由单显性基因控制。
212　AFL P引物在全雌和弱雌 D NA池间的多态性
采用 64对 AFLP引物组合对分别由 10个单株混合组成的全雌和弱雌 DNA池进行扩增 , 共产生约
4250条带 , 每对引物平均扩增出约 70条带。筛选出在全雌和弱雌 DNA池间表现多态的标记共 5个 ,
EcoR I2NN /M se I2NNN分别为 AA /CAT142、AG/CAC350、AT/CTC260、TA /CTG263、TG/CAC234。
213　多态性标记在 F2 代单株中的检测及连锁距离的确定
利用上述具有多态带的 5个引物组合对 F2 代单株进行 PCR验证。结果发现 , 其中 TG/CAC234与
全雌性表型存在连锁关系 , 绝大多数全雌单株中出现该条带 , 而雌雄异花同株单株中则未见该标记
(图 1)。所用 F2 代单株共有全雌性 38株 , 雌雄异花同株 42株。标记检测表明其中全雌单株中有 34
株出现该标记 , 4株未见该标记。雌雄异花同株单株中 , 有 3株未出现该标记 , 39株出现该标记。利
用 Mapmaker ( version 310) 计算出标记与全雌性位点的连锁距离在 617 cM , 连锁较为紧密。
图 1　E2TG和 M 2CAC引物组合扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
1～10: 全雌性单株 ; 11～20: 雌雄异花同株单株 ; M: pBR322 DNA /A lu I分子量标准。箭头示全雌性单株中出现的特异带。
F ig. 1　The PAGE electrophoresis results of selective am plif ica tion w ith pr im er com b ina tion E2TG and M 2CAC
1 - 10: individual gynoecious p lants; 11 - 20: individual monoecious p lants; M: pBR322 DNA /A lu Imarker.
The arrow showing the specific band from gynoecious p lants.
214　AFL P标记转化为 SCAR标记
对该连锁标记进行回收、克隆、测序 , 序列如图 2所示 , 全长共 234 bp。去除接头部分序列后 ,
所得特异片段长度为 200 bp (图 2)。根据 Primer Prem ier 510软件设计 SCAR引物。上下游引物位置
为第 3～24和第 143～168个碱基 , 扩增产物长度为 166个碱基。引物 SA1序列为 : 5pi2CAAAATGTC2
CTATGACTGGTAA23pi, SA2序列为 : 5pi2CATATTGATCACAATGTTCTTAAA23pi。
图 2　全雌性特异标记 TG /CAC234全序列
黑体为 AFLP引物 TG/CAC序列 ; 带下划线的序列为 SCAR特异引物 SA166
F ig. 2　D NA sequence of the AFL P fragm en t TG /CAC234
The sequence in bold is the sequence of the AFLP p rimer TG/CAC; The underlined is the sequence of the specific p rimers SA166
利用所设计的特异引物对 F2 代单株的基因组 DNA进行扩增鉴定。结果经琼脂糖电泳检测表明 ,
在全雌单株中扩增出 166 bp长的片段 , 而在雌雄异花同株单株中则未见该标记 (图 3) , 表明已成功
地将该 AFLP标记转化为 SCAR标记。并将该 SCAR标记命名为 SA166。
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图 3　SCAR标记 SA166在 F2 代单株中的扩增结果
1～8为全雌株 ; 9～16为雌雄异花同株 ; M为 pBR322 DNA /A lu I分子量标准 ; 箭头示特异带位置。
F ig. 3　Am plif ica tion for the ind iv idua l plan ts of F2 popula tion w ith the spec if ic pr im ers SA166
1 - 8: individual gynoecious p lants; 9 - 16: individual monoecious p lants; M: pBR322 DNA /A lu Imarker.
The arrow showing the specific band from gynoecious p lants.
3　讨论
我国在黄瓜全雌性基础理论研究和全雌性品种选育方面虽有过一些报道 , 但与欧美等发达国家相
比仍存在较大的差距。目前 , 我国大型温室中栽培的黄瓜品种多为进口的全雌性单性结实品种 , 春夏
栽培全雌性状表现稳定。而国产相关优良品种较少 , 已有的强雌性品种其雌花率常常随栽培季节的变
化而变化。本试验利用 AFLP标记结合银染技术获得了与黄瓜全雌性位点连锁距离为 617 cM的标记 ,
并成功地将其转化成操作简便、表现稳定的 SCAR标记。这是目前国内首次报道的与黄瓜全雌性基因
位点紧密连锁的分子标记 , 该标记能在苗期对黄瓜全雌性单株进行有效的选择 , 这对黄瓜全雌性品种
的辅助选育具有重要的实践意义。
黄瓜性别表现被认为主要受到两个主效基因 m 和 F相互作用的影响。F基因能加速植物的性转
变过程 , 决定雌性化的程度 ( FF > Ff > ff) , 即 FF为全雌性 , Ff为强雌性 , ff为弱雌性〔19〕; M 基因
控制黄瓜植株性别是单性花 (基因型为 M _ ) 或两性花 (基因型为 mm ) , 纯雌株型基因型为M _
FF〔19～21〕。而 F基因又受到 In2F ( F增强基因 ) 和其它一些基因的修饰。在最近构建的的黄瓜分子标
记连锁图中 , 有 3个与性别表达相关的位点被定位 , 分别为第 1连锁群上的 sex 111 ( F )、 sex 112
( de) 和第 6连锁群上的 sex 611 (AT1222SCAR) , 在后代中 , 当这 3个位点均存在时 , 表现出强烈的
雌性特点〔7〕。在本研究中 , 与 TG/CAC234标记连锁的雌性基因对黄瓜全雌性表型具有决定作用 , 即该
基因存在时即表现全雌性 , 否则表现雌雄同株。因此 , 与 TG/CAC234标记连锁的雌性基因可能是一个
决定全雌性的关键性基因 , 但其是否为 F基因则需要进一步的验证。
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新书推荐 　　　《中国蔬菜品种志》　　　
本书由中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编 , 已于 2002年 9月出版发行。全书分上、下卷 , 1～6章为上卷 , 包
括根菜类、白菜类、芥菜类、甘蓝类、绿叶菜类及葱蒜类 , 计 2263个品种 , 1347页 ; 7～12章为下卷 , 包括瓜类、
茄果类、豆类、薯芋类、水生蔬菜类和多年生蔬菜类 , 计 2550个品种 , 1177页。入志的品种中 , 地方品种占 90%以
上 , 少量在全国栽培时间较长、种植面积较大的一代杂种也选入其中。本书较全面系统而又有重点地反映了中国丰富
的蔬菜品种资源概貌、研究成果及育种水平 , 可供蔬菜科研、教学、生产及种子公司、农业行政单位的人员参考。本
书出版后受到读者普遍好评 , 现尚有少量存书 , 特以优惠价格 490元 (上、下卷 ) 提供给读者 (原价 980元 )。
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报 》编辑部 , 邮编 100081。
《中国蔬菜实用新技术大全》
《中国蔬菜实用新技术大全 》由北京科学技术出版社出版 , 分南方蔬菜卷 ( 120万字 ) 和北方蔬菜卷 ( 170万
字 ) , 每卷均有白菜类、根菜类、甘蓝类、芥菜类、茄果类、豆类、瓜类、葱蒜类、绿叶菜类、薯芋类、水生菜类、
多年生菜类、野生菜类、芽苗菜类、食用菌、设施栽培、蔬菜产品及种子质量标准等 17章 , 每章包括优良品种、栽
培技术、采收、贮藏、运输及加工等内容 (南方卷和北方卷各有侧重 )。定价 : 南方卷 198元 , 北方卷 228元。
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