全 文 ：园 艺 学 报 2002, 29 ( 4) : 348~ 352
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 07- 02; 修回日期: 2001- 11- 02
大白菜子叶离体培养再生植株
张凤兰1 高田 2 徐家炳1
( 1北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100089; 2 日本国立岩手大学农学部, 盛冈 0208550)
摘 要: 探讨了植物激素、AgNO3和琼脂浓度对大白菜子叶培养芽再生和植株再生的影响。结果表明:
优化培养基条件为MS 培养基中加入 5 mg / L BA、0. 5 mg/ L NAA、2 mg/ L AgNO3 和 1. 2% ~ 1. 6 %琼脂。培
养过程中, 子叶的乙烯释放量对芽再生起很重要的作用, 具有高芽再生率的基因型或高浓度琼脂的培养条
件下 , 子叶产生的乙烯量较少。培养基中有AgNO3存在时, 尽管子叶的乙烯释放量增加, 芽再生率也有提
高。对子叶的乙烯释放量和不定芽再生的关系进行了讨论。
关键词: 大白菜; 子叶培养; AgNO3; 乙烯
中图分类号: S 634. 1 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2002) 04034805
近年来基因工程技术的开发为作物品种改良开辟了新的途径, 但是成功应用基因工程技术的前提
之一是开发高效组织培养和基因转化系统。用农杆菌进行基因转化的效率受两个因素影响, 一是农杆
菌感染外植体的频率, 二是被感染组织的再生频率1 。
与其他芸苔属作物相比, 白菜组织培养非常困难2 。Narasimhulu 等3 曾报道在芸苔属作物 Brassi
ca campestris, B . oleracea, B. nigra , B. juncea, B . napus 和B. carinata种中, 白菜种的组培再生率最
低。国内近几年来对白菜子叶培养的培养基条件有所报道4, 5 , 但对大白菜的研究仍很缺乏。另外,
近几年研究发现乙烯与离体组织再生关系密切。加某些乙烯抑制剂, 如 AgNO3、AVG ( Aminoethoxyv
inglglycine 氨基乙氧基乙烯基甘氨酸) 和 polyamines (多胺) 于培养基中可促进 B . campestris6 , B.
juncea
6, 7 , 萝卜8 等作物的不定芽再生。本研究开发了高再生率的大白菜 ( Brassica campestris L. ssp.
pekinensis) 子叶培养系, 探讨了不同培养基条件对不定芽再生的影响, 并研究了子叶乙烯释放量和芽
再生的关系。
1 材料与方法
1. 1 培养方法
子叶培养参照Ono等9 的方法进行。将种子用 70%酒精表面杀菌 30 s后, 用含有效 Cl- 1% 的
NaClO溶液灭菌 15 min, 用无菌蒸馏水洗 3次, 每次 5 min。将种子播于直径 90 mm 含有 20~ 25 mL
MS培养基 ( 0. 8%琼脂) 的培养皿中, 每皿 20粒。发芽 4 d后, 切下带叶柄 1~ 2 mm的子叶插于装
有40~ 45 mL芽再生培养基的培养皿中, 每皿 10片。芽再生培养基为 MS 加入不同浓度的 BA、NAA
和AgNO3, 并用不同浓度的琼脂固化。培养 2~ 4周后, 调查子叶不定芽再生率和平均每子叶产生的不
定芽数。每处理3~ 4次重复。产生的不定芽移植到不含激素的MS培养基中诱导生根。在25 ! 、16 h
日照的培养箱中进行培养。再生株在蛭石中驯化 2周后移栽到温室。
1. 2 激素、AgNO3 和琼脂浓度对大白菜不定芽再生的影响
以 ∀北京新二号# 品种为试材, 在 MS 培养基中加入不同浓度的 BA ( 0~ 5 mg/ L ) , NAA ( 0~
1 mg/L) , 探讨最佳激素浓度。在此基础上, 在含有 5 mg/L BA 和 0. 5 mg/ L NAA的MS培养基 (以下
称MSB5N5培养基) 中加入 0~ 5 mg/L AgNO3, 研究其对大白菜不定芽再生的效果, 并以 6个品种为
试材, 探讨用不同浓度的琼脂固化培养基对大白菜不定芽再生的影响。需注意的是 AgNO3 不可用高
压灭菌, 用细菌过滤器灭菌后, 再加入到经过高压灭菌的培养基中。
1. 3 乙烯测定
以 ∀北京新二号# 品种为试材, 将子叶培养于装有 2. 5 mg/ L 不含和含 2 mg/ L AgNO3及不同琼脂
浓度的 MSB5N5培养基的 9 mL 玻璃管 (长 5 cm, 直径 1 cm) 中, 测定乙烯的释放量。同法测定再生
率不同的 4个品种的乙烯释放量。玻璃管用橡皮胶塞密封。每个处理 5~ 6次重复, 每个玻璃管只培
养1片子叶。乙烯用气相色谱仪测定10 。
2 结果与分析
2. 1 激素浓度对大白菜子叶培养不定芽再生的
影响
为探讨最佳激素浓度, 首先以 ∀北京新二号#
为试材, 比较 BA和 NAA 20个组合的培养基子叶
不定芽再生情况, 结果见表 1。经 2 ~ 3 周培养
后, 有12个组合的子叶柄基部有不定芽产生, 其
中BA 5 mg/ L+ NAA 0. 5 mg/ L 的处理不定芽再生
率最高, 达到 53. 3% , 但每个子叶平均只产生 1
~ 2个不定芽。未加 BA或 NAA 的培养基上无不
定芽产生, 说明 BA和 NAA 对大白菜子叶培养不
定芽再生是必需的。根据以上结果把含有 5 mg/ L
BA和 0. 5 mg/ L NAA的MS 培养基作基本培养基,
进而研究了AgNO3对促进大白菜子叶培养不定芽
再生的效果。
2. 2 AgNO3 对大白菜子叶培养不定芽再生的影
响
AgNO3对促进大白菜子叶培养不定芽再生效
果明显 (表 2) , 在加入 2 mg/ L AgNO3的 MSB5N5
培养基上获得了最高的不定芽再生率 ( 86. 7% )
和不定芽数 ( 6. 3个)。平均每子叶再生的不定芽
数是不加 AgNO3 培养基的 3 倍。尽管 1~ 4 mg/ L
AgNO3的处理间不定芽再生率差异不显著, 但加
2 mg/L AgNO3 时每片子叶所产生的不定芽数显著
高于其他处理。AgNO3 对白菜5 、芥菜7 及萝
卜8 不定芽再生的促进效果也曾有报道。
2. 3 琼脂浓度对大白菜子叶培养不定芽再生的
影响
琼脂浓度对大白菜不定芽再生的影响也很大,
琼脂浓度为 1. 2 %和 1. 6 % 的处理, 不定芽再生
率和不定芽数都高于 0. 8 %的处理并且不定芽的
分化早 (表 3)。特别是再生率较低的 ∀夏宝# 品
种, 在高浓度琼脂的再生培养基上不定芽再生率
提高了2~ 3倍。
表 1 不同激素浓度组合对大白菜子叶产生不定芽的影响
Table 1 Effects of hormone combinations on shoot regeneration
from cotyledonary explants of Chinese cabbage
BA
( mg/L)
NAA
( mg/L)
不定芽再生率
Frequency of shoot
regeneration ( % )
平均子叶再生芽数
Average number of
shoots per explant
0 0 0 0
0 0. 1 0 0
0 0. 3 0 0
0 0. 5 0 0
0 1 0 0
1 0 0 0
1 0. 1 10. 0 1. 0
1 0. 3 10. 0 1. 5
1 0. 5 16. 7 1. 9
1 1 16. 7 1. 5
3 0 0 0
3 0. 1 7. 5 2. 0
3 0. 3 35. 0 1. 7
3 0. 5 30. 0 1. 6
3 1 26. 7 1. 5
5 0 0 0
5 0. 1 16. 7 1. 7
5 0. 3 45. 0 1. 6
5 0. 5 53. 3 2. 0
5 1 23. 3 1. 2
表 2 AgNO3对大白菜子叶再生不定芽的影响
Table 2 Effect of AgNO3 on shoot regeneration from
cotyledonary explants of Chinese cabbage
AgNO3
( mg/L)
平均芽再生率
Average shoot regeneration
frequency ( % )
平均每子叶再生不定芽数
Average shoot number
regenerated per explant
2 86. 7 aA 6. 3 aA
4 85. 0 bA 5. 2 bB
3 83. 3 abA 5. 1 bB
1 78. 3 abA 4. 3 cB
5 66. 7 bcAB 5. 1 bB
0 53. 3 cB 1. 9 dC
注: 显著性测验, 字母相同者差异不显著。字母不同者表示
在 5% (小写字母) 或 1% (大写字母) 水平上差异显著。
Note: Duncan# s mult iple range test , treatments w ith the same letter
indicated no signif icant difference while with different letter indicated sigmi
ficant diff erence at 5% ( small letter) or 1% ( capital letter) level.
3494 期 张凤兰等: 大白菜子叶离体培养再生植株
将在不同琼脂浓度的再生培养基上诱导的不定芽移到MS 培养基上诱导植株再生, 其植株再生率
见表 4。在琼脂浓度 1. 6 %的再生培养基上诱导的不定芽, 植株再生率高达 100% , 平均每个子叶的
再生植株数为 3株, 但在琼脂浓度 0. 8%的再生培养基上诱导的不定芽, 植株再生率和再生株数分别
为 55. 6 %和 1. 2。可见, 提高培养基的琼脂浓度对大白菜子叶培养不定芽和植株再生非常有益。
表 3 琼脂浓度对大白菜子叶产生不定芽的影响
Table 3 Effect of agar concentration on shoot regeneration from cotyledonary explants of Chinese cabbage
品种
Cult ivars
培养时间
Duration of
culture ( d)
琼脂浓度 Agar concent ration ( % )
0. 8
A B
1. 2
A B
1. 6
A B
北京新二号 Beijing New 2 14 70. 0 4. 9 90. 0 8. 0 97. 5 4. 7
28 87. 5 6. 3 95. 0 8. 9 100 5. 7
北京 80号 Beijing 80 14 62. 5 4. 5 95. 0 5. 3 90. 0 4. 5
28 85. 0 5. 5 97. 5 5. 7 95. 0 5. 5
优黄 Youhuang 14 67. 5 3. 7 92. 5 6. 1 87. 5 4. 6
28 85. 0 5. 9 95. 0 7. 0 97. 5 5. 6
CR新黄 CR xinhuang 14 40. 0 5. 1 80. 0 6. 6 84. 2 4. 3
28 85. 0 6. 8 92. 5 7. 0 94. 7 6. 8
新早 898 Xinzao 898 14 42. 5 3. 0 77. 5 4. 5 85. 0 3. 5
28 92. 5 6. 6 97. 5 6. 0 87. 5 5. 2
夏宝 Xiabao 14 17. 5 3. 0 35. 0 5. 5 65. 0 3. 0
28 33. 3 5. 1 2. 5 5. 7 75. 0 5. 5
注: A为不定芽再生率 ( % ) ; B为平均每子叶再生不定芽数。
Note: A. Shoot regenerat ion frequency ( % ) ; B. Number of shoots per explant .
2. 4 子叶的乙烯释放量和不定芽再生的关系
本研究对不同培养基上培养的子叶的乙烯释
放量进行了测定。发现: 再生培养基中加入 Ag
NO3时促进了子叶乙烯的释放 (表 5)。
加入AgNO3时不定芽再生率和子叶的乙烯释
放量间的正相关关系在萝卜的下胚轴培养8 、白
菜子叶培养11 中也有报道。另一方面, 在研究不
同浓度琼脂的培养基和不同芽再生率的品种的子
叶乙烯释放量时, 却发现不定芽再生率和乙烯释
放量成负相关。当培养基的琼脂浓度增加时, 子
叶的乙烯释放量降低 (表 6) , 在高浓度琼脂培养
基上不定芽再生率的提高, 可能是由于子叶的乙
烯释放量减少的结果。同时, 对 4个不同芽再生
率的品种子叶培养的乙烯释放量测定结果表明,
乙烯释放的高峰期为培养 9~ 11 d, 无芽再生的两
个品种 (雪风、山东 5号) 的乙烯释放量高于芽
再生率高的品种 (北京新二号、CR黄健 65) (表
7)。
表 4 琼脂浓度对大白菜子叶培养植株再生的影响
Table 4 Effect of agar concentration on plant regeneration
from cotyledonary explants of Chinese cabbage
琼脂浓度
Agar concent rat ion
( % )
植株再生率
Frequency of plant
regenerat ion ( % )
平均每子叶再生植株数
No. of regenerated
plants per explant
0. 8 55. 6 1. 2
1. 2 83. 3 2. 4
1. 6 100 2. 9
表 5 培养基中加或不加 AgNO3 子叶的乙烯释放量
Table 5 Level of ethylene produced by cotyledonary explants
cultured on medium supplemented with and without AgNO3
培养基
Medium
( mg/L)
培养日数
Days after
culture ( d)
乙烯释放量
Ethylene produced
( L∃L- 1∃h- 1)
MS+ BA 5+ NAA 0. 5 0 0. 11
1 0. 37
3 2. 38
5 1. 79
7 2. 41
MS+ BA 5+ NAA 0. 5+ AgNO 3 2 0 0. 19
1 1. 16
3 2. 95
5 5. 42
7 3. 98
350 园 艺 学 报 29 卷
表 6 不同浓度琼脂固化培养基上子叶的乙烯释放量
Table 6 Level of ethylene produced by cotyledonary explants cul tured
on medium solidified with different concentrations of agar
琼脂浓度
Agar conce
ntrat ion ( % )
培养日数
Days after
culture ( d)
乙烯释放量
Ethylene produced
(L∃L- 1∃h- 1)
0. 8 0 0. 19
1 1. 16
3 2. 95
5 5. 42
7 3. 98
1. 2 0 0. 24
1 1. 10
3 1. 88
5 2. 16
7 4. 85
1. 6 0 0. 32
1 0. 84
3 1. 32
5 2. 95
7 2. 53
表 7 不同芽再生率的品种子叶的乙烯释放量
Table 7 Level of ethylene produced by cotyledonary explants of 4
cultivars with different regeneration abili ty
品种*
Cult ivars*
培养日数
Days after culture ( d)
乙烯释放量 Ethylene
produced (L∃L- 1∃h- 1)
北京新二号 0 0. 17
Beijing New 2 3 4. 17
7 7. 30
11 8. 84
15 7. 59
CR黄健 65 0 0. 26
CR Huangjian 65 3 3. 04
7 6. 96
11 12. 78
15 7. 75雪风 Xuefeng 0 0. 32
3 8. 99
7 19. 62
11 22. 78
15 17. 71
山东 5号 0 0. 15
Shandong 5 3 4. 06
7 10. 82
11 18. 04
15 13. 38
* 北京新二号和 CR黄健 65为高子叶再生率的品种, 雪风和
山东 5号为无芽再生力的品种。
* Beijing New 2 and CR Huangjian 65 are cult ivars with high shoot
regenerat ion ability, while Xuefeng and Shandong 5 are cultivars unable to
regenerate.
3 讨论
本研究探讨了植物激素、AgNO3 和琼脂浓度对大白菜子叶培养不定芽再生的影响, 确立了大白菜
子叶培养优化的培养基为 MS基本培养基中加入 5 mg/L BA、0. 5 mg/ L NAA、2 mg/ L AgNO3和 1. 2%
~ 1. 6 %琼脂。在此培养基条件下, 北京新二号、北京 80号等品种的不定芽再生率达 95%以上, 植
株再生率达 100%。BA和 NAA对大白菜子叶培养的不定芽再生必不可少。Takasaki等12 也曾报道在
白菜子叶培养的不定芽再生中 BA和NAA是必不可少的激素。而甘蓝型油菜的子叶培养, 只有 BA是
必需的激素9 。本研究表明提高培养基的琼脂浓度, 可促进大白菜子叶培养的不定芽再生和植株再
生。Peng等13 曾报道甘蓝型油菜小孢子培养来源的不定胚在再生培养基琼脂浓度较高时表现较高的
植株再生率, 并认为是由于培养基的水分状况 (水势) 不同所致。
近年来, 人们越来越多地认识到乙烯在离体组织和细胞培养中对细胞再分化的重要性。高浓度的
乙烯导致 B. campestris 离体组织培养芽的畸形生长及抑制芽的再生7, 11 。抑制乙烯生物合成的AVG,
可促进某些作物的不定芽再生8 。Pua等14 还报道将ACC的反义 RNA转化到芥菜中, 降低了转化芥
菜的乙烯产生, 增加了其不定芽的再生。以上这些结果都表明乙烯释放量和不定芽再生的负相关关
系。至于加入AgNO3导致乙烯释放量增加的原因还不清楚, 有人认为可能是 Ag+ 干涉乙烯的感受15
或Ag+ 逆境造成7 。另外, Beyer16 提出Ag+ 通过与膜上存在的乙烯受体竞争结合, 并干扰乙烯信号
传递途径, 使乙烯无法正常与受体结合, 而抑制乙烯的作用。因此在培养基中加入 AgNO3 后, 尽管
其乙烯释放增多, 但由于 Ag+ 存在, 使乙烯不能发挥功能, 不定芽再生仍表现提高。而提高培养基的
琼脂浓度, 使子叶的乙烯释放量减少, 从而提高了子叶不定芽的再生; 同样具高芽再生率的品种其乙
烯释放量也明显低于不能再生的品种。综上所述, 在离体组织培养中, 通过减少外植体的乙烯释放或
干扰乙烯的正常功能, 可达到提高离体细胞或组织再生的目的。另外在培养基中 AgNO3 存在的情况
下仍有少数品种无不定芽再生, 说明乙烯不是影响不定芽再生的唯一原因。
3514 期 张凤兰等: 大白菜子叶离体培养再生植株
由子叶而来的再生株移于蛭石中驯化后移栽于土壤中, 再生株与原品种无任何形态差异。
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Plant Regeneration from Cotyledonary Explants of Chinese Cabbage Cultured in
Vitro
Zhang Fenglan
1
, Takahata Yoshihito
2
, and Xu Jiabing
1
( 1 Beijing Vegetable Research Centre, Beijing 100089, China; 2Faculty of Agriculture, Iwate University , Morioka 020- 8550, Japan)
Abstract: Effect of hormone combinat ions, AgNO3 and agar concentrat ion on shoot and plant regeneration
from cotyledonary explants of Chinese cabbage was described. Maximum shoot regeneration was obtained in MS
medium containing 5 mg/ L BA, 0. 5mg/ L NAA, 2 mg/L AgNO3 and solidified with 1. 2 %- 1. 6 % agar. Ethy
lene production from cultured explants seemed to play important role in shoot regenerat ion. Explants of cultivars with
high regenerat ion frequency or if cultured on the medium solidified with higher concentration of agar generally
showed low levels of ethylene product ion. However, AgNO3, which also enhanced shoot induction, resulted in an
increase in ethylene production. The possible interaction between ethylene and shoot regenerat ion is discussed.
Key words: Chinese cabbage ( Brassica campestris L. ssp. pekinensis ) ; Cotyledon culture; AgNO3; Ethy
lene
352 园 艺 学 报 29 卷