全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(4)：441～46
Acta Horticulturae Sinica
— — — — — — — — — — — —
柿和君迁子试管苗缓慢生长法保存及其遗传稳定性
研究
艾鹏飞 罗正荣
(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070)
摘 要：对柿 (Diospyros kaki Thunb．)和君迁子 (D．1otus L)试管苗缓慢生长法保存及其恢复生长植
株的遗传稳定性进行了研究，结果表明：低温 (6±1)℃和光照800 lx(12 h／d)的条件下，试管苗在添加
有甘露醇20 g／L或PPⅢ 1．0 mg／L的MS(1／2N)+蔗糖20 g／L+琼脂7 g／L+PVP 500 mg／L培养基上或在
含有 CPPU 0．2 mg／L的 1／2 MS(1／2N)+蔗糖 15 g／L+琼脂7 g／L+PVP 500 mg／L培养基上保存 18个月，
平均存活率在90％以上；上述3种方法保存后恢复生长的植株，在核 DNA含量和染色体数目上没有发生
改变；RAPD分析时表明，只有在添加 PP 的保存中，次郎3个单芽姊妹系扩增出的1827条谱带中，增加
了3条新带，变异率为0．16％，君迁子3个单芽姊妹系扩增出的1736条谱带中，增加了1条新带，缺失了l4
条带，变异率为0．86％。该结果为柿属植物种质资源缓慢生长法保存的有效性和可行性提供了理论依据。
关键词：柿；君迁子；试管苗；缓慢生长法；遗传稳定性；种质保存
中图分类号：S 665．2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)04 441-06
Conservation of in Vitro Shoots of Persimmon and Date Plum by Slow
Growth and Genetic Stability of Recovered Plantlets
Ai Pengfei and Luo Zhengrong
(Key Laboratory of Honicuhural Plant Biology，Ministry of Education，P尺C，Huazhong Agricultural University。Wuhan
430070，China)
Abstract：Studies on conservation of in vitro shoots of persimmon(Diospyros kaki Thunb．)and date
plum (D．1otus L．)by slow growth and genetic stability of recovered plantlets were carried out．Results
showed that 90％ of in vitro shoots conserved on MS(1／2N)supplemented with 20 L sucrose，7 g／L agar
and 500 mg／L soluble PVP added with 20 L mannitol or 1．0 nqIg／L PP33 respectively or on 1／2MS(1／2N)
supplemented with 15 g／L sucrose．7 g／L agar and 500 mg／L soluble PVP added with 0．2 mg／L CPPU f0r l8
months at(6±1)℃and 800 lX(12 h photoperiod)maintained viability．Those recovered plantlets conserved
with 3 methods above were analyzed on cytological and molecular levels respectively．Resuh showed both Ha—
clear DNA content and chromosome numbers maintained as norma1．And only few shoots cultivated with PP11，，
in which existed 0．1 6％ variation in Jirou persimmon owing to 3 distinct new bands appearing in l 827 ampli—
fled bands and 0．86％ variation in Date plum for l distinct new band and absence of 14 bands existing in 1 736
amplifed bands when 3 single—bud sibling lines were analyzed by RAPD markers respectively．Thus．it sugges—
ted these procedures would be effective and viable to conserve Diospyros germ plasm by slow growth as above
．
Key words：Persimmon；Date plum；In vitro shoot；Slow gro~_h；Genetic stability；Conservation of gennplasm
柿 (Diospyros kaki Thunb．)和君迁子 (D．1otus L．)是柿属植物中经济价值较高的种类，田间
种植保存费用高，且损失严重。因此，需要寻求经济、实用、安全的保存方法。最近几十年中．随着
离体培养技术的全面展开，以之为基础的缓慢生长法离体保存技术也得到了迅猛发展，目前已成功地
应用于多种植物种质资源的离体保存㈩。作者在已经建立起柿和君迁子离体培养技术体系的基础上，
收稿 日期 ：2003—10—14：修回日期：2003—12—29
基金项目：国家自然科学基金资助项 目 (30070529)
通讯作者 Author for correspondence(E-mail：luozhr@mail hzau．edu．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
442 园 艺 学 报 31卷
主要探讨改变培养条件和修改培养基组分对其试管苗生长的影响，并进一步对保存后再生植株进行了
遗传稳定性评价，以期建立起柿属植物种质离体保存库。
1 材料与方法
君迁子1个单株；柿选用4个品种：次郎、阳丰、富有、罗田甜柿。按前报 建立试管苗无性系。
单芽姊妹系的建立：参照Hao等 建立各基因型单芽姊妹系。即试管苗一个侧芽按前报 培养，
所得试管苗进行第二次侧芽培养，得到的试管苗为单芽姊妹系。
温度和光照试验：温度为培养箱 (6±1)℃或组培室 (25±2)℃，光照为暗处理或弱光照800 Ix
(12 h／d)。取试管苗梢端5 mm转接到含有培养基 MS(1／2N)+蔗糖20 g／L+琼脂7 g／L的三角瓶
中，一层牛皮纸外加双层耐高温聚乙烯薄膜封口。正常条件下先期培养5 d后分别置于不同温度和光
照下，每两个月调查一次存活率和生长高度 (存活的嫩茎)。每瓶3—4株，重复3次。
保存试验：取试管苗梢端5 mm转接到添加有生长抑制剂ABA或生长延缓剂 PP 或渗透调节剂
甘露醇的MS(1／2N)+蔗糖20 g／L+琼脂7 g／L+PVP 500 mg／L培养基上或CPPU的1／2MS(1／2N)+
蔗糖l5 g／L+琼脂7 g／L+PVP 500 mg／L培养基中，正常条件下先期培养5 d后直接置于 (6±1)qC和
800 lx(12 h／d)的培养箱中保存。6个月后，每3个月调查一次存活率。每处理5瓶，每瓶3—4株。
恢复培养：对保存 18个月后存活的试管苗恢复培养和诱导生根 J，6周后调查恢复生长情况。
遗传稳定性检测：测定再生植株流式细胞仪 DNA含量 ]。检测生根植株根尖细胞染色体数 ]。
CTAB法提取植株叶片DNA进行RAPD分析 J。对照为保存前的单芽姊妹系。
2 结果与分析
2．1 温度和光照对试管苗保存的影响
表 1表明，次郎试管苗在不同温度和光照条件下保存时，温度对存活率影响较大，光照对生长高
度影响较大。前4个月试管苗 100％成活；延长到6个月时，(25±2)qC下开始出现了枯死，存活率
降低，同时试管苗高度也出现了负增长；而在 (6±1)qC条件下仍保持 100％成活，苗高也一直在缓
慢增长，且800 lx弱光照时苗生长缓慢、健壮，暗培养时苗纤细、黄化。综上所述，(6±1)℃和800
lx条件下保存试管苗，存活率高，苗生长缓慢。因此，在以后的保存试验中均采用这个条件。
表1 温度和光照对次郎试管苗保存的影响
Table 1 Efects of temperature and Ught on the survival and growth of Jirou shoots in vitro
注：M代表月；同列内相同字母示邓肯氏新复极差法检验在0．05水平上差异不显著，下同。Note：M：Months；Means within
columns followed by the$aiTle letter are not significantly different at P：0．05 level by Duncan’s new multiple test．The same below
．
2．2 CPPU对试管苗保存的影响
表2表明，CPPU为0．2 mg／L时，次郎和罗田甜柿试管苗缓慢生长保存 18个月后仍保持较高的
存活率，浓度过低或过高时保存期相应缩短。分析其原因，发现CPPU浓度过低，保存的试管苗几乎
停止生长，逐渐黄化死亡，浓度过高时苗也停止生长，且产生大量愈伤，最后连同愈伤一起变褐死亡。
2．3 甘露醇对试管苗保存的影响
甘露醇能够提高培养基渗透压，从而抑制试管苗的生长。本试验用甘露醇保存得到了较好的结果
(表3)，浓度为20 g／L时，次郎和阳丰试管苗保存 18个月后存活率仍保持在95％以上。
维普资讯 http://www.cqvip.com
表3 甘露醇浓度对柿试管苗保存后存活率的影响
Table 3 Efect of mannitol concentration on the survival of conserved persinunon shoots in vitro (％ )
2．4 ABA对试管苗保存的影响
ABA能有效的抑制植物茎的伸长生长，可用于试管苗保存 j。本试验发现，ABA (0、0．5、
1．0、2．0和5．0 mg／L)处理的次郎和富有试管苗保存到 l8个月时，存活率都低于50％，且当浓度
大于2．0 mg／L时，试管苗顶芽及上部叶易枯死，下部叶缘发红，枯死现象严重。因此，ABA不太适
宜于柿试管苗缓慢生长法保存。
2．5 PP瑚对试管苗保存的影响
由表4可知，PP，，浓度对次郎和君迁子试管苗保存的影响较大，浓度为 1．0 mg／L时，保存 l8个
月的次郎试管苗90．6％存活，君迁子试管苗没有出现死亡；浓度为0．5和2．0 mg／L的处理次之；浓
度为5．0 m L时表现出对试管苗的毒害作用，死苗现象严重。因此，PPm最佳处理浓度为1．0 mg／L。
表4 PP333浓度对次郎和君迁子试管苗保存后存活率的影响
Table4 Efect ofPP33 concentration 01the survival of conserved Jirou andDate plum shotsinvitro (％)
2．6 保存后的试管苗恢复培养
对上面3种较好的方法保存 l8个月的次郎试
管苗恢复培养时进行了比较 (表5)，在保存期
间，试管苗伸长生长量从大到小依次为甘露醇20
L、CPPU 0．2 mg／L、PP33 1．0 mg／L；增殖倍数
从大到小依次为 CPPU 0．2 mg／L，甘露醇2O g／L，
PP，，1．0 m L(图版 I，2a～2c)；恢复培养时，
3种方法保存后存活的试管苗都迅速生长，且生长
表5 不同缓慢生长法保存次郎试管苗18个月的结果比较
Table 5 Comparison of Jirou shots in vitro conserved
for 18 months by diferent slow-growth methods
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报
势强 (图版 I，1，3)。6周后，恢复生长苗在生根处理时，生根率高，根条数多 (图版 I，4)。
2．7 再生植株遗传稳定性检测
恢复保存后再生植株遗传稳定性分析结果表明，在 DNA含量和染色体数目上表现出与保存前的
对照一致，没有发生变异 (图 1；图版 1I，1～5)。分别对添加 CPPU 0．2 mg／L、甘露醇 2O L和
PP 1．0 mg／L的3种方法保存 18个月后的次郎再生植株进行RAPD分析 (每种保存方法随机选取保
存后的3个单芽姊妹系，以保存前的1个单芽姊妹系为对照)，112条随机引物的扩增谱带中，在cP—
PU 0．2 mg／L和甘露醇20 L上保存的没有出现缺失带或新增带 (图版 Ⅱ，6，7)，而在 PP 1．0
mg／L上保存的出现了3条新带 (图版1，9)，变异率为 0．16％。同样的方法对罗田甜柿在 CPPU
0．2 mg／L、君迁子在PP 1．0 mg／L上保存 18个月后的再生植株遗传变异分析，结果罗田甜柿在所
检测的范围内没有发现变异 (图版Ⅱ，8)，而君迁子共出现了 14条缺失带和 1条新带 (图版 Ⅱ，
lOa～10d)，变异率为0．86％。分析在保存过程中引起变异的可能原因主要与保存方法，即保存培养
基中不同的添加物有关。
兽
暑
=
籁
蜒
墓
愚
3 讨论
荧光强度 Fluorescence intensity
图1 试管苗核 DNA流式细胞光度法分析
保存前和保存后的君迁子；b，b’．保存前和保存后的次郎。
Analysis by flow cytometry of nucleus DNA of in vitro shoots
0 50 100 150
a ， a ’
． Date plum before—conserved and conserved；b，b’． Jirou before—conserved and conserved．
缓慢生长法是一种中期的保存方法，影响其保存效果的因素很多，但主要是培养条件 (如培养
温度和光照等)和培养基组分 。本试验以柿和君迁子试管苗为外植体，对影响保存的培养温度、
光照和培养基组分3个主要因子进行了研究，结果在低温 (6±1)cC和光照800 lx(12 h／d)条件下，
试管苗在添加有甘露醇2O L或PP 1．0 mg／L的MS(1／2N)培养基或含CPPU 0．2 mg／L的1／2MS
(1／2N)培养基上不需继代保存 18个月后，存活率最高可达 100％。在添加有ABA的培养基中保存
效果不甚理想，这可能与ABA是一种生长抑制剂，在抑制试管苗伸长生长的同时加速了其衰老进程
有关，具体原因待进一步探讨。
离体保存的非常态，是否已引起保存后再生材料遗传物质的改变，是该种保存方法的有效性和可
行性的重要依据。本研究分别对甘露醇2O L或PP 1．0 mg／L的MS(1／2N)培养基上或CPPU 0．2
mg／L的1／2MS(1／2N)培养基上保存后的再生植株进行了遗传稳定性分析。结果，在核 DNA含量
和染色体数方面，没有发生改变，这可能与柿是一种多倍体植物，在缓慢生长的特殊环境中，DNA
或基因拷贝数的多倍性有利于其细胞生存有关。DNA水平上的分析发现，前两种方法保存的材料在
所检测的位点没有出现变异带，而在PP 1．0 mg／L的培养基上保存的材料中，次郎3个单芽姊妹系
中有 1个出现了1条新增带，1个出现了2条新增带，君迁子3个单芽姊妹系中1个出现了6条缺失
带，1个出现了5条缺失带，1个出现了3条缺失带和 1条新增带。同时，在整个 RAPD分析中，偶
瑚 鲫 o
维普资讯 http://www.cqvip.com
州
：山能开硎 {川 川比 鞘 l!j仃 n 条什 ． J工J 比山啦 J’I最新带 I】4嚣缺k惦．
I FI J 邮Iljl H J 3象新 ，泄n 堤 鬯暂l^ 谜 J 象 外怕休的蛙l叫 什疋外．J J俯
，J较k盖系 订E￡ 旬2倍怍 (2n一2 30) 趺j)lj址6 怵 【2,1=6x=9(¨ ，i耋样．n f 怀 『愆
的 I)Nl、某化点的I政变较 储删刊 1 舟似伟 』世 帕 f 射诎掩删刮．忙j fJl{ 愆
I腹竖』ll不能 啦{_L0f物鲇台的f L( 这 位点 坚心法山脱 的缺k) ～ fI 1 『_较
多的 色阵纠救．比低侣休il『J世 _I1J 位电讣偿能 J“ 长1 仕丌1蠼悒q K浊 fJ 箭}_i+1
监多 k少有 ；讣材利北J H上戋 遮就埘I证r h J 选择 ：JIJ． ll蛭维持l尢 最个体 I¨相l Iq?ll J~
I1】l佝越f々罄础同 睫 这种选扦将是 蚀的．不见打 5 F
参考文献：
i n Ⅲ “ I Ⅵ ⋯i 、 f h~lh·l。 一 ~llt L·I[I·¨⋯⋯⋯ ¨ *Jtl~l『y!li~。I T『}f c⋯ E r¨i ⋯ ⋯ ‘ h t lirn l【1I I H I‘，7 I 2
2 『 ll L1I n{ I uIn H—ql41 JJ ‘ J 20~12 】 【J1 272，274
till,、 J fl¨ c I h。 x x I~l r 【I L】『 。 - ⋯ 【J_l al,ph l_⋯ Ⅲ l’ “iiirI，h_．I‘ i ．1 I⋯ ⋯ I⋯ I，_J}h rl rl r Ⅵ、H
lnI· 】 Y ⅢIl 4 ：45 5
4 化艟 一 Il 新 m J I1 1I 血曲 }l 【 j_!} 呻 件 l 2“) j0【2) 【6q—l’I
5 J,~tlth虬 JI《 廿 ⋯}4忡 ¨| 』鲫 也悱 『 0¨0．27{4 235 q
n r # 《}L鸺 ；讣 } ·} I[Hli -rl Jf ‘，J 地 h !f{ 2h(s1 ．30 T
’ 瑞 j¨ 埘j 姒 m f n I 戚 驯L 、I" l~lg5．4 Il 84
H 、。{ h、 k I c h,JⅢ I I『 Il~[II W·¨ ⋯⋯i,l Itil Iltl『 I r1~gi!Ⅲlh r[1filf PI『‘兀tI；~-I． ．、⋯11’ ¨Ll J_I¨『
2㈣ l I F7一III
1』ki¨ l’ hl,k l·⋯ K， “tkI’ 』I】 l【 ¨tni_¨ ¨ I rl⋯I JIn。 ⋯L“Ipi~ll‘ I⋯{ 1．I⋯1、⋯ {¨Lt}ItJ『l,1~4}n” ¨I i⋯i h】
l,h 2“】I II 7·I” I42
¨ }I州 fm七 fl， L flfi~tfi3 ”II／iltl }f- J ．20DI 7 ) 257一i
目 I说 I仳 m邮lJ 2l 2 *m 伸 IIIIl_2t I ll 211 I
． I I FII si
JI i FJ~J m u 昔{1 件竹E1‰Ⅱ I 1 骨J1 J m ·Lkm rk lj 稍J I
I；xplalmtion 0I plates l：】 - l 1 J li l⋯ ‘Il Jl ilm “1il~lI ⋯ ll、 I l、 肿 2 1lJ【_ I_ n¨l¨ ⋯ ⋯ 1 ⋯ ，州 l¨ J I_
㈨ ⋯hc__l 。h‘⋯ ‘1⋯⋯ ‘h¨ 】¨ ⋯J lll n 2 I 21 J
． ⋯⋯⋯11 f、21f I，PIl_ I【J rlg I {2 r ⋯ 『I⋯l
“ ⋯ ’it J~l‘‘ r~al J 【l 、一 I}4 Ii、l 、 I、¨i Itf r|_、I_川 l vI⋯ I^ I m 舯 ⋯II ⋯
维普资讯 http://www.cqvip.com
I卷
《： ． 弧 壤 蒜 mo． ， ：≯0：。．’
； 。‘“
J
京 。’嚣蒸_I寺
=：
s
篓
一 ～
． 蜘 ㈣ 罴囊～
●
缸 =蓦 _至 拈 茎
～ u Ⅵ 2 ● l_
如柚 m ‰ 一 籼 _萋⋯=主Ⅲ=兽 ～ 川 二三 胁版．m“s ．_至_至 _星_至酣 ”m
维普资讯 http://www.cqvip.com