全 文 ：园 艺 学 报 2002, 29 ( 4) : 321~ 325
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2002- 01- 28; 修回日期: 2002- 03- 20
基金项目: 辽宁省教委攻关项目
银杏细胞培养物中银杏内酯的HPLC测试委托国家民委生化工程重点实验室、大连市生化工程中心、大连民族学院生化工程研究
所完成, 特此致谢。
提高银杏悬浮培养细胞内酯合成的研究
王关林1 李春斌2 方宏筠1
( 1辽宁师范大学生命科学学院, 大连 116029; 2 大连理工大学化工学院, 大连 116012)
摘 要: 对12个不同品种的银杏树幼叶及其诱导的愈伤组织进行银杏内酯含量测定, 发现不同基因型
的银杏内酯含量存在较大差异: 圆铃和金坠两个品种含量最高, 分别达 0. 43%和 0. 41% ; 七星果品种含量
最低, 为 0. 13% ; 金坠品种幼叶愈伤组织中银杏内酯含量最高, 为 0. 0334% ; 有 3 个品种的幼叶愈伤组织
未检测到银杏内酯。选取银杏内酯含量高、生长旺盛的愈伤组织在 B5 液体培养基中进行了细胞悬浮培养,
研究多种生长因子对细胞生长和银杏内酯合成的影响。结果表明, 在 150 mL培养瓶中装 50 mL培养液, 接
种量为30~ 40 g/ L, 培养液初始 pH 为 5. 8, 3 000~ 4 000 lx的强光照, 以 30 g / L蔗糖和 15 g/ L 葡萄糖为碳
源最有利于细胞生长和银杏内酯的合成。用高效液相色谱检测结果显示, 银杏圆铃品种的悬浮培养细胞中
银杏内酯 B最高含量可达细胞干样质量的 0. 0758%。
关键词: 银杏; 细胞悬浮培养; 银杏内酯
中图分类号: S 664. 3; Q 942. 6 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2002) 04032105
银杏 ( Ginkgo biloba L. ) 叶中主要有效成分黄酮苷和萜内酯具有多种药理作用。银杏叶提取物及
其加工产品在世界上每年销售额达数十亿元美元1 。银杏叶中的银杏内酯 ( ginkgolides) 和白果内酯
(bilobalide) 为银杏所特有的重要成分, 至今尚未发现存在于其它任何植物中2 。银杏内酯 (包括
ginkgolide A、B、C、D、M和 J) 被认为是当前最有应用前景的天然血小板聚集诱导因子 PAF 受体拮
抗剂, 且尤以银杏内酯B ( GB) 活力最强3 。由于银杏内酯在天然植物中含量极低, 且主要存在于根
和处于生长状态的叶中, 采叶影响树木的生长, 材料来源困难。因此世界上许多科学家都对银杏细胞
培养生产银杏内酯进行了一定的研究, 1991年加拿大的 Carrier等4 首先确定了培养物中银杏内酯的
存在, 1993年又报道银杏内酯 ( GA+ GB+ GC) 在愈伤组织和悬浮细胞中含量分别为 0. 0026%和
0. 0047%。戴均贵等5 1998年报道由银杏叶诱导的愈伤组织中 GB 含量达 0. 0023% , 于荣敏等6 1999
年报道银杏悬浮培养物中银杏内酯含量可达 0. 0099%。作者由高内酯含量圆铃品种银杏树幼叶诱导出
愈伤组织, 经多代驯化、筛选建立了优良银杏细胞悬浮系, GB含量可达细胞干样质量的 0. 0758%。
1 材料与方法
1. 1 材料及培养基
银杏幼叶为同一时间采自辽宁省经济林研究所的佛手、圆铃、宇香、岭南、亚甜、马铃 5号、马
铃9号、金坠、大白果、梅核、圆头、七星果等 12个不同品种的 3~ 5年生幼树, 每品种选取 3棵
树, 采叶部位为各树南侧树冠中部最外方枝条的顶端。这些树栽于同一试验地, 其生长环境和树龄基
本相同。采用由银杏幼叶诱导而来的优良绿色愈伤组织建立细胞悬浮培养系。
愈伤组织固体培养采用 MS 培养基附加 NAA 1. 0~ 2. 0 mg/L、BA 0. 5~ 1. 0 mg/ L、蔗糖 30 g/L,
pH 5. 8, ( 25 ! 1) ∀ , 3 000~ 4 000 lx强光照条件下培养, 每隔 35 d继代 1次。液体培养采用 B5 培养
基添加NAA 0. 5~ 1. 0 mg/ L、BA 0. 2~ 0. 5 mg/ L、蔗糖30 g/L、葡萄糖 15 g/ L, 其它条件同固体培养,
摇床转速为110 r/ min, 150 mL摇瓶中培养基装液量为 50 mL, 接种量为 30~ 40 g/ L。
1. 2 细胞生长量的测定和培养物中银杏内酯的分析
悬浮培养细胞经尼龙网过滤, 蒸馏水洗涤 3次, 抽滤去表面水分, 称量鲜样质量 ( g/ L) , 60 ∀ 烘
干后称量干样质量 ( g/ L)。细胞增长率= (收获细胞量- 接种细胞量) /接种细胞量 # 100%。
总内酯含量测定采用分光光度计法7 。银杏内酯的提取、纯化、检测采用 HPLC 法8 , 仪器为岛
津LC10A高效液相色谱仪, 色谱柱为大连依利特公司 ODS C18, 流动相为甲醇∃水= 33∃67, 进样量
10 L, 流速 1. 0 mL/ min; 柱温 30 ∀ , 检测波长219 nm, 检测器为二极管阵列检测器。银杏内酯 B回
归方程为: Y= 3 # 10- 5X- 0. 3197, R2= 0. 9915。( Y为 GB含量 g, X为峰面积)。银杏内酯生物产量
(mg/ L) = 内酯含量 ( %) # 收获细胞干样质量 ( g/ L) # 1 000。
2 结果与分析
2. 1 不同品种幼叶愈伤组织中银杏内酯含量比较
不同品种银杏幼叶及其愈伤组织中银杏内酯含量 3次测定结果的平均值见表 1。幼叶内酯含量以
圆铃和金坠品种最高, 分别达 0. 43%和 0. 41% ; 七星果品种最低, 为 0. 13%; 愈伤组织内酯含量以
金坠品种最高, 为 0. 334% , 有 3个品种未检测到银杏内酯。一般规律为, 银杏叶中内酯含量高的品
种, 由它们诱导而来的愈伤组织中的银杏内酯含量也较高。经多次继代培养和筛选, 选取圆铃银杏品
种幼叶诱导而来的愈伤组织来建立细胞悬浮培养系。
2. 2 接种量对悬浮培养细胞生长的影响
在以生产次生代谢产物为目的的植物细胞悬
浮培养中, 要求细胞具有较高的生长速率, 获得
图 1 接种量对悬浮培养细胞生长的影响
Fig. 1 Effect of inoculation on the growth of suspension cell
表 1 不同品种银杏叶和愈伤组织中银杏内酯的含量
Table 1 Content of ginkgolides of young leaf and
callus from varieties of Ginkgo biloba L.
品 种
Varieties
幼 叶
In young leaf ( % )
愈伤 组织
In callus ( % )
佛手 Foshou 0. 16 0. 000
圆铃 Yuanling 0. 43 0. 282
宇香 Yuxiang 0. 14 0. 036
岭南 Lingnan 0. 37 0. 251
亚甜 Yatian 0. 27 0. 000
马铃 5号 Maling 5 0. 26 0. 156
马铃 9号 Maling 9 0. 35 0. 237
金坠 Jinzhui 0. 41 0. 334
大白果 Dabaiguo 0. 22 0. 149
梅核 Meihe 0. 16 0. 107
七星果 Qixingguo 0. 13 0. 125
圆头 Yuantou 0. 19 0. 000
了高生长速率的细胞系后, 再通过各种影响因子的调控来提高细胞系中次生代谢产物含量。本试验研
究了 20、30、40、50、60、70 g/ L 接种量 (鲜样质量) 对银杏细胞生长的影响, 结果见图 1 (为简化
图中曲线只绘出了 20、40、60 g/ L 接种量)。细胞生长达到最大量的周期与接种量直接相关, 接种量
大, 细胞生长周期短; 接种量小, 细胞生长周期长。因此接种量以 30~ 40 g/ L 为佳。
2. 3 碳源对银杏悬浮培养细胞生长和银杏内酯含量的影响
本试验中观察了蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和乳糖等不同碳源对悬浮培养细胞生长和内酯含量的影
响。选用的不同碳源浓度均为 30 g/ L, 经 3次重复试验, 计其平均值。由表2可见, 以蔗糖为碳源最
适于银杏内酯的积累, 葡萄糖为碳源则最适于细胞的生长, 其它两种碳源效果较差。对不同浓度的蔗
糖和葡萄糖组合进一步的研究结果见图 2。在蔗糖浓度较低范围内, 细胞增长倍数及内酯的含量都随
蔗糖浓度的增加而增加, 蔗糖浓度为 45 g/L 时银杏内酯含量最高。但在培养过程中发现若单纯以蔗
322 园 艺 学 报 29 卷
糖为碳源, 培养细胞随继代次数的增加易发生褐化现象。当培养液中的碳源采用蔗糖和葡萄糖混合供
给的方式时则不易发生褐化现象, 而且银杏内酯的生物产量与单独使用蔗糖差别不大, 因此本试验选
择每升培养基中附加 30 g蔗糖和 15 g 葡萄糖作为银杏悬浮培养细胞系的碳源。
表 2 不同碳源对悬浮培养细胞生长和内酯含量的影响
Table 2 Effect of different carbon suources on the growth
of suspension cell and the content of ginkgolides
碳 源
Carbon source
接 种量
Inoculat ion
density
( g/L)
细 胞
收获量
Harvest cell
( DM g/L)
银杏内酯 Ginkgolides
含量
Content
( % )
产 量
Output
( mg/L)
蔗糖 Sucrose 40 11. 2 0. 304 3. 40
葡萄糖 Glucose 40 12. 7 0. 220 2. 78
麦芽糖 Maltose 40 8. 4 0. 118 0. 99
乳糖 Lactose 40 9. 5 0. 101 0. 96
2. 4 光照强度和光质对悬浮培养细胞生长和银
杏内酯含量的影响
图 2 碳源浓度对悬浮培养细胞生长和银杏内酯含量的影响
Fig. 2 Effect of concentration of carbon source on the
growth of suspension cell and content of ginkgolides
在其它条件相同情况下将培养物置于不同光强下培养, 由图 3可见, 在 0~ 2 000 lx 范围内培养
细胞增长随光强的增加而增加, 此后细胞增长有下降趋势, 但银杏内酯的含量却一直随光强的增加而
增加。而且在培养的过程中, 悬浮细胞会出现浅绿、深绿、黄绿等不同的颜色, 随着光照强度的增
加, 培养细胞有逐渐增绿的趋势。内酯含量测定表明培养细胞越绿, 内酯含量也越高。从悬浮细胞的
增长及内酯含量等诸多因素考虑, 以 3 000 lx 的较强光照较为适宜。
此外, 试验中还分别在日光灯管外加罩白色、红色和蓝色透明塑料薄膜, 在光强都为 2 000 lx 条
件下对悬浮培养细胞在白光、红光和蓝光等不同光质下的生长速度和内酯含量进行了对比。研究表
明, 红光最有利于细胞的生长, 增长倍数可达 7. 3倍, 但细胞中内酯含量最低, 为 0. 201% ; 蓝光下
细胞生长最慢, 增长倍数为 6. 1倍, 但内酯含量最高, 为 0. 352% ; 白光下细胞的生长倍数和内酯含
量居中, 分别为 6. 8和 0. 303%左右。由此可见同类细胞在不同的光质下反应是不同的。
2. 5 银杏悬浮培养细胞生长曲线和银杏内酯形成的关系
在培养条件相同情况下, 分别于培养后的第 3~ 24天中每 3 d随机抽取 6瓶培养物, 测定培养细
胞的增长量和其中内酯含量, 结果见图 4。银杏悬浮培养细胞生长曲线基本为 S型, 其中 0~ 3 d为延
滞期, 3~ 18 d为指数生长期, 18~ 21 d为静止期, 21~ 24 d为衰亡期。
图 3 光照强度对细胞生长和银杏内酯含量的影响
Fig. 3 Effect of illumination intensity on the growth
of cell and the content of ginkgolides
图 4 银杏悬浮培养细胞生长曲线和内酯含量变化曲线
Fig. 4 Growth curve of suspension cell of Ginkgo biloba L.
and ginkgolides content curve
在培养前期银杏内酯含量基本随细胞增长而逐渐增加, 第 15天时达到最大值, 此后含量开始下
降, 进入细胞衰亡期后银杏内酯含量下降了 48%。考虑到银杏细胞增长指数和银杏内酯含量两个因
3234期 王关林等: 提高银杏悬浮培养细胞内酯合成的研究
素, 以选取生长到第 20天时收获细胞为宜。
2. 6 银杏悬浮培养细胞中银杏内酯含量的分析
采用HPLC法对细胞培养物进行检测, 并多次重复, 结果稳定。从高效液相图谱图 5可见, 银杏
细胞悬浮培养物中含有 GA和GB两种成份, 而且 GB的含量较高, 可达到细胞干样质量的 0. 0758%。
图 5 银杏内酯 A (GA) 和银杏内酯 B (GB) 标准品 (左) 与银杏细胞培养物中银杏内酯 (右) HPLC图
Fig. 5 HPLCprofile of standards of ginkgolide A and ginkgolide B ( left) and HPLC profile of
ginkgolides of cell extract of Ginkgo biloba L. ( right)
3 讨论
3. 1 银杏品种与细胞培养物中内酯含量的关系
外植体来源是影响植物细胞培养物次生代谢产物产生和积累的重要因素之一。一般认为若用次生
代谢产物含量高的植物或器官为外植体诱导出来的愈伤组织进行细胞悬浮培养, 其培养物中次生物质
的含量也高。Kirnesley等9 用烟草试验证明, 来自高尼古丁含量的烟草愈伤组织中其尼古丁含量也
高。类似的结果也存在于长春花组织培养中10 。
本研究分析了 12 个银杏品种叶片中内酯含量, 观察到它们的内酯含量差别较大, 最大相差达
3. 3倍, 而且由其分别诱导的愈伤组织中内酯含量也不相同, 并基本与原植物成正相关性, 这与前人
对其它植物的研究结果相一致。细胞培养过程中的影响因素是在此基础上的人工调控, 其增效作用在
每一品种是类似的, 且高内酯含量的细胞培养物增幅更大。因此是基因型起决定性作用。前人在进行
银杏细胞悬浮培养的工作中, 未重视寻找高内酯含量的银杏品种, 这可能是银杏细胞培养技术难以转
化生产的重要原因之一。我国拥有的银杏品种达 100多种, 选取高内酯含量的银杏品种进行细胞培养
将会取得事半功倍的结果。本试验选取银杏内酯含量高的圆铃银杏树幼叶进行愈伤组织的诱导, 建立
高产细胞悬浮系, 从而获得了 GB的较高含量, 为其产业化生产打下了基础。
3. 2 细胞分裂和分化与银杏细胞培养物中银杏内酯含量的关系
我们的试验结果表明, 生长快、分裂旺盛的细胞中银杏内酯含量低, 当细胞进入对数分裂后期,
细胞开始分化时银杏内酯含量高。光照试验的结果表明, 暗培养条件下的白色细胞中银杏内酯含量
低, 光照较强的绿色细胞中银杏内酯含量高。许多植物次生代谢产物的合成与叶绿体的分化有关。齐
藤和季11 比较了 Thermosis lupinoides 的白色愈伤组织和绿色愈伤组织合成扇豆生物碱的差异, 结果表
明, 白色愈伤组织没有生物碱的积累, 而绿色愈伤组织中含有生物碱, 其含量与组织或器官中叶绿素
的含量成正比。在 Chamomile 的培养物中, 只有光下生长的绿色细胞才能积累与原植物同样的精油成
分12 。一般认为次生代谢产物的积累与细胞分化程度之间存在着正向相关性, 即细胞分化程度越高
次生代谢产物含量越高。从上述这些生物碱的生化合成途径分析与叶绿素含量的提高无直接联系, 但
叶绿素的产生, 叶绿体的形成表示着细胞分化程度的提高, 任何一种生物碱类物质都是储存在细胞的
液泡中, 分化程度高, 积累多。依据前人和我们的试验结果, 认为寻找细胞分裂与分化的平衡点是植
物组织细胞培养生产次生代谢产物的关键, 应从细胞的生长周期、目标产物的含量及其收获总量来综
合考虑确定细胞的最佳收获时期。
324 园 艺 学 报 29 卷
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Studies on Increasing Ginkgolides Synthesized in Suspension Cell Culture of
Ginkgo biloba L.
Wang Guanlin1, Li Chunbin2, and Fang Hongjun1
(
1
Life Science College of Liaoning Normal University , Dalian 116029, China; 2Chemical Engineering College of Dalian University of
Technology , Dalian 116012, China)
Abstract: After determination of the content of ginkgolides from varieties of Ginkgo biloba L. , it was shown
that therewere significantly different contents of ginkgolides from different genotypes of Ginkgo biloba L. , in which
the highest were in Yuanling and Jinzhui, the contents reached 0. 43% and 0. 41% respectively, the lowest was in
Qixingguo, the content was 0. 13%, the highest content of ginkgolides in calli from variet ies of Ginkgo biloba L.
was in Jinzhui and reached 0. 334% . There were calli from 3 varieties producing no ginkgolide. The callus with
high content of ginkgolides and growing well was cultured on B5 media. The effects of different growth factors on
growth of cell and content of ginkgolides were studied. The result showed that 50 mL culture solution in the 150 mL
flask, the inoculat ion 30- 40 g/L , the initial pH in culture solution 5. 8, 3 000- 4 000 lx lumination in the
intensity and the mixture of 30 g/ L sucrose and 15 g/L glucosewere optimum to synthesis of ginkgolides and growth
of cell. The result by HPLC detection showed ginkgolides in suspension cells reached 0. 0785% of dry mass of cells
from the variety Yuanling.
Key words: Ginkgo biloba L. ; Cell suspension culture; Ginkgolides
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3254期 王关林等: 提高银杏悬浮培养细胞内酯合成的研究