全 文 ：园
艺
学
报
2002, 29 ( 4) : 369~ 371
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 11- 16; 修回日期: 2002- 03- 08
基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 30070529) ; 教育部优秀青年教师资助计划项目; 高等学校博士学科基金项目 ( 1999004001)
* 通讯作者。Author for correspondence (E
mail : luozhr@ public. wh. hb. cn) .
罗田甜柿原生质体分离、培养及植株再生
谷晓峰1
罗正荣1, 2*
( 1华中农业大学园艺系 , 武汉 430070;
2 湖北民族学院园艺系, 恩施 445000)
摘
要: 以 罗田甜柿 休眠芽茎尖诱导的愈伤组织为试材, 对原生质体分离培养技术进行了研究。
结果表明: ( 1) 继代 10 d 的愈伤组织最适于分离原生质体; ( 2) 优化的酶解体系为 CPW+ 0. 5% Cellulase
Onoruka R
10+ 0. 03% Pectinase from Aspergillus Niger+ 0. 7 mol/ L Mannitol+ 1% PVP
10; ( 3) 原生质纯化方式以
上浮法为好, 100! g离心6 min; ( 4) 琼脂糖念珠培养 5~ 6 d 观测到第 1 次分裂, 多为不均等分裂, 60~
70 d形成肉眼可见的小愈伤组织, 愈伤组织增殖到 5 mm 以上, 分化成苗, 转至生根培养基生根。
关键词: 甜柿; 原生质体; 分离; 培养; 植株再生
中图分类号: S 665. 2

文献标识码: A

文章编号: 0513
353X ( 2002) 04
0369
03
1
目的、材料与方法
柿 ( Diospyros kaki L. f. ) 品种为多倍体, 且倍性复杂, 存在种间和倍性间的杂交阻碍, 而且许
多优良品种只着生雌花, 选择适宜的亲本比较困难, 因此将优良基因传递给子代的过程盲目性较大,
效率很低∀1, 2#。目前柿原生质体培养虽已获成功, 但再生的基因型仅限于日本品种∀3, 4#。本文报道
罗田甜柿 原生质体培养及植株再生的研究结果, 以期为中国甜柿的细胞工程和分子育种提供依据。
试材采自华中农业大学果树标本园柿圃。剥取休眠芽茎尖接种于氮元素减半的培养基 MS+
10
mol/L Zeatin+ 1
mol/L IAA 上, 黑暗条件下诱导愈伤组织∀5#。纤维素酶浓度设 0. 1%、0. 3%、
0. 5%、1. 0%、2. 0%, 果胶酶浓度设 0. 01%、0. 03%、0. 05%、0. 1%、0. 2%。酶液 pH 值调至 5. 6,
用 0. 22
m微孔滤膜过滤灭菌。用血球记数板统计原生质体密度并折算成产量。测定原生质体活
力∀5#。分离的原生质体采用琼脂糖念珠培养∀3, 4#。
2
结果与分析
2. 1
继代时间对原生质体分离效果的影响
图1显示, 继代 10 d 后的愈伤组织可以分
离到较高产量及活力的原生质体, 产量为 17. 2
! 105/ g FW, 活力达 89. 3%。可见继代 10 d为
最适于分离原生质体的培养时期。
2. 2
酶液浓度对原生质体分离效果的影响
由图 2 和图 3 可知, 同一果胶酶浓度
( 0. 05%) 下, 随着纤维素酶浓度的提高, 原生
质体产量增加, 0. 5%时最高, 达 6. 8 ! 105/ g FM,
图 1
愈伤组织继代时间对原生质体分离的影响
Fig. 1
Effect of different time of calli growth
after subculture on protoplast i solation
之后浓度增加, 产量下降。在同一纤维素酶浓度 ( 0. 5%) 下, 果胶酶的浓度以 0. 03%为宜, 产量达
17. 6 ! 105/ g FM。此外, 酶液浓度过高时有大量碎片产生, 可能是高浓度酶液对原生质体破坏所致。
图 2
不同纤维素酶浓度对原生质体分离的影响
(果胶酶浓度 0. 05% )
Fig. 2
Effect of different concentration of cellulase on
protoplast isolation ( concent ration of pedt inase 0. 05% )
图 3
不同果胶酶浓度对原生质体分离的影响
(纤维素酶浓度 0. 5% )
Fig. 3
Effect of different concentration of pedtinase on
protoplast i solation ( concentration of cellulase 0. 5% )
2. 3
离心力及界面离心方式对原生质体分离的影响
酶解后原生质体需经 3次离心纯化, 不同的离心力及时间对原生质体产量有影响 (表 1) ; 3种离
心方式对原生质体活力影响不大, 100 ! g 离心 6 min收集到的原生质体基本无破裂, 120 ! g 时则可见
少量破裂原生质体 (表 1)。
由表 2可见, 原生质体分离以上浮法为宜, 离心后形成一条明显的原生质体带 (图版, 1) , 产量
和活力都高于下沉法。酶解后如何最大限度的收集分离的原生质体是培养的前提, 现有文献中仅指出
通过滤膜过滤纯化原生质体∀2, 3#。本试验对相关参数进行了研究, 获得了适宜的纯化体系。
表 1
离心力及时间对原生质体产量和活力的影响
Table 1
Effect of centrifugal force and time of centrifugation
on yield and viability of protoplasts
离
心
Cent rifugation
产 量 Yield
( ! 105/ g FM)
活
力
Viabil ity ( % )
破裂情况
Burst
60! g 10 min 0. 9 82. 1 无 No
100! g 6 min 1. 5 81. 3 极少 Seldom
120! g 5 min 1. 3 83. 2 少量 Few
表 2
不同界面离心方式对原生质体产量和活力的影响
Table 2
Effect of different means of centrifugation
on yield and viability of protoplasts
离心 方式
Means of cent rifugation
原生质体产量
Yield of protoplast
( ! 105/ g FM)
原生质体活力
Viability of
protoplast ( % )
上浮法 Float ing collection 3. 7 89. 3
下浮法 Sinking collect ion 3. 2 82. 3
2. 4
原生质体培养
收集的原生质体 (图版, 2) 以 2 ! 105~ 3 ! 105密度包埋培养 5~ 6 d后观测到第一次分裂, 多为
不均等分裂 (图版, 3) , 两周后转入液体培养, 可见少量多细胞团形成 (图版, 4、5) , 60~ 70 d后
形成肉眼可见的褐色小愈伤颗粒, 转至愈伤增殖培养基中增殖 (图版, 6、7)。当愈伤组织增殖至
5 mm以上时转至分化培养基 ∀MS ( 1/ 2 N) + 10
mol/ L Zeatin+ 0. 1
mol/ L IAA# 分化不定芽。芽高
2 cm以上, 转至生根培养基 ∀1/ 2MS ( 1/ 2 N) + IAA 1 mg/ L#, 黑暗诱导 4 d, 光下培养 15~ 20 d后
出新根 (图版, 8、9)。罗田甜柿原生质体分离、培养及植株再生成功, 为应用原生质体技术创制同
源或异源十二倍体, 以及通过基因工程转移某些优良基因提供了技术支持。
参考文献:
1
罗正荣, 蔡礼鸿, 胡春根. 柿属植物种质资源及其利用研究现状. 华中农业大学学报, 1996, 19 ( 4) : 381~ 388
2
Tamura M, Tao R, Sugiura A. Production of somatic hybrids between Dispyros glandulosa and D . kaki by protoplast fusion. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 1998, 54: 85~ 91
3
Tao R, Tamura M , Yonemori K, et al . Plant regeneration from callus protoplast s of adult Japanese persimmon ( Diospyros kaki L. ) . Plant Science,
1991, 79: 119~ 125
4
Tamura M, Tao R, Sugiura A. Improved protoplast culture and palnt reeneration of Japanese persimmon ( Doispyros kaki L. ) . Japan J. Breed,
1993, 43: 239~ 242
5
Larkin P J. Purif ication and viability determination of plant protoplast . Planta, 1976, 128: 213~ 216
370
















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29 卷
Studies on the Isolation, Culture of Protoplast and Plant Regeration in
Luotiantianshi Persimmon
Gu Xiaofeng1 and Luo Zhengrong1, 2
(
1
College of Horticulture and Forestry , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070, China;
2Department of Horticulture,
Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)
Abstracts: The conditions of isolation and culture of protoplasts from leaf primordial excised from dormant
buds of adult nonastringent presimmon Luot iantianshi were studied. The best combination of enzymes selected
for protoplast isolation from the calli subcultured 10 d was CPW+ 0. 5% Cellulas R
10+ 0. 03% Pedinase+
0. 7 mol/ L Mannitol+ 1% PVP
10. Protoplast purification could be obtained by means of floating collection and
centrifugat ion. Protoplast divided for the f irst time after 5- 6 d, formed multi
cell clusters and grew into visible
mini
callus after 60- 70 d, then mini
callus was transferred onto calli agar medium for proliferat ion. When the
calli grew to more than 5 mm in diameter, they were induced to advent itious bud and rooted.
Key words: Nonastringent persimmon; Protoplast; Isolation; Culture; Plant regeneration
图版说明
1. 原生质体带; 2. 原生质体; 3. 第一次分裂; 4. 2~ 3次分裂; 5. 念珠培养原生质体形成的多细胞团; 6. 原生质
体培养形成小愈伤组织; 7. 转至固体培养基形成的愈伤组织; 8. 诱导的不定芽; 9. 诱导生根长成完整植株。
Explanation of plates
1. Protoplast band; 2. Protoplast s; 3. The first cell division; 4. The second or third cell division; 5. Cell colony;
6. Mini
calli induced from protoplasts culture; 7. Calli formed on solidif ied medium; 8. Adventitious bud; 9. The shoot rooted in medium.
3714期










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