全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(3)：322—324
Aeta Ho．n6cu]tume&reca
草莓外源 LEA 3基因的导入
王俊丽 ，2 葛会波。 彭士琪。 张红梅 续九如2
( 河北大学生命科学学院，保定 071002； 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083； 河北农业大学园艺学
院，保定 071001)
摘 要：以草莓 (Fragaria alclno．~a Duch．)品种 ‘Darslect’的花药为试材，以 MS培养基为基本培养
基，进行愈伤组织的诱导。通过基因枪法将来源于大麦的胚胎发生晚期丰富蛋白基因LEA 导入愈伤组织细
胞，经过除草剂 PFF的4次筛选培养，获得了抗性愈伤组织及再生植株。通过地高辛标记的探针进行
Southern杂交分析 ，检测到了杂交带，表明 LEA 基因整合到草莓染色体基因组中。
关键词 ：草莓 ；花药；愈伤组织；LEA 蛋白基因；转化
中图分类号：Q 785；S 668．4 、文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X(2003)03．o322．o3
1 目的、材料与方法
利用农杆菌介导法、电击法、基因枪法研究草莓基因转化已经有成功的报道【l 】。本研究以草莓
花药为材料，通过愈伤组织的诱导，获得受体组织。利用基因枪法将来源于大麦 (Hordeum vulgare
L_)的胚胎发生晚期丰富蛋白基因 LEA 导人草莓细胞 ，获得转基因草莓植株，提高草莓的抗旱耐盐
碱能力 ，为草莓抗旱耐盐新品种的培育开辟一条新途径。
试材来 自河北大学实验园内种植的草莓 (Fragaria 0 Duch．)法国栽培品种 ‘Darslect’。取
萼片尚未裂开的花蕾，用 70％的乙醇消毒 30 s，用 0．1％ HgCh消毒 10 min。取出花药，接种到培养
基上进行愈伤组织诱导培养。转化所用质粒 pBY520图谱如图 1所示。LEA 基因以Act工为启动子，
PiIl2为终止子。Bar基因为选择基因，由 CaMV 35S和 nos调控。借助 PDS．1000型基因枪，将外源
DNA导人愈伤组织细胞中。轰击后的愈伤组织培养1周后，转入含有除草剂PPr(phosphinothricin)的
选择培养基上进行筛选。之后转入再生培养基上进行再生培养。通过基因枪将由 CaMV 35S和 n0s调
控的 Gus基因导人愈伤组织后，采用组织化学染色法检测 Gus的瞬时表达。DNA的提取按 CrAB
(cetyl t 科hyl ammonium bromide)方法进行，用地高辛试剂盒 (德国，RMB)标记的 1．0 kb DNA和标
记的 Marker作探针进行 Southem blot分析。
XhoI H／ndlll EcoRI BamHI XbaI PstI EcoRI EcoRV
ActI 3 pin2 35S 鼢 nos
l l 巨至量三至昌 厂—] 巨至蚕吾
I f
图 1 质粒 pBY520图谱
Fig．1 Structure ofplam ~ pBY520
2 结果与分析
2．1 愈伤组织的诱导
观察发现，花药接种到 MS+2,4一D 1．0～4．0 mg／L和 MS+2，4-D 1．0—4．0 me／L+6-BAO．20 mg／L
培养基上时，虽然也能诱导出愈伤组织，但愈伤组织为乳白色，水浸状，并随着时间的延长，部分开
收稿日期：2OO2—06—17；修回日期：2OO2一ll—o4
本研究所用质粒由美国康奈尔大学分子生物学及遗传学系吴瑞教授提供，特此致谢。
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3期 王俊丽等：草莓外源 3基因的导入 323
始褐化 ，部分变成白色 “海绵状”组织。MS+6一BA 1．0～2．0 mg／L+2，4一D 0．1～0．5 mg／L和 MS+
6-BA 1．0～2．0 mg／L+NAA 0．1～0．5 mg／L培养基均能诱导出黄色愈伤组织 ，诱导率在 70％以上 ，并
且 6一BA 2．0 mg／L和 NAA 0．2 mg／L配合使用时，诱导率几乎达到 100％。
2．2 LEA3蛋白基因导入及抗性愈伤组织的筛选
经过轰击后的愈伤组织和对照 (未轰击的愈伤组织)培养 1周后转到 LS+6一BA 2．0 mg／L+NAA
0．2 mg／L+PFF 10．0 mg／L+蔗糖 30 L+琼脂 9 g／L培养基中进行选择培养 ，观察发现，抗性组织
(转化组织)色泽鲜亮，分裂增生快，经 4次选择后 ，逐步形成较大的愈伤组织块。而非抗性组织
(非转化组织)及对照逐步褐化、死亡。
2．3 植株再生培养
将经过4次筛选培养的抗性愈伤组织转入 MS+6一BA2．0 mg／L+NAA 0．1 mg／L+CH 500 mg／L+蔗
糖 30 L+琼脂 9 g／L培养基中进行再生培养，约 3周后出现绿色芽点，5周后即可形成高 2～3 cm
的小植株 (图 2，表 1)。
图2 草莓转化再生植株
№ ．2 llt~gmeratatl l~ants of 瑚 strawberry
表 1 转 化 结果 统 计 表
Table1 Sumnm yof trtmsformation
将 20个再生芽和 20个对照芽转入含有 PFF 5 mg／L的 LS培养基中再次进行选择时，8个芽死亡，
12个再生芽能够正常生长发育。从理论上讲，转化细胞经过多次筛选 (培养基中附加PFF)得到抗性
愈伤组织，由抗性愈伤组织再生所得的植株理应为抗性植株，但实际上并非如此。产生这种现象的原
因是多方面的。首先 ，在转化细胞的选择过程中，个别细胞 “逃逸”选择，出现假阳性愈伤组织，这
些假阳性愈伤组织再生的植株，肯定是对 PFF无抗性的阴性植株。其次，尽管外源 DNA在起初确实
整合到宿主染色体上 ，但在再生的过程中发生了基因丢失 ，从而使再生植株失去对 PFF的抗性。再
次，外源 DNA的随机插入 (位点效应)和基因的拷贝数对基因表达具有一定的影响。不适的整合位
点和拷贝数往往对基因表达产生负影响，即导致基因沉默 (gene silence)或失活。
2．4 Gus基因的瞬时表达和 Southern杂交结果
分别将 Gus基因转化的愈伤组织和对照 (未转化)放入染液中进行染色，观察发现，转化的愈伤
组织呈蓝褐色，而对照仍为黄色。这表明 Gus基因已被导入愈伤组织中，并且能够进行瞬时表达，同
时也表明本研究所用的基因枪系统是有效的。
将染色后的材料放到 75％的乳酸水溶液中，在 1磅的压力下加热 15 min，转化材料溶液变成蓝
色，而对照的溶液为浅绿色。在不同波长下分别测定其OD值，结果如图3。
以地高辛标记的探针进行杂交，转化株检测到了杂交带，表明 LEA3基因确实整合到了草莓染色
体 DNA中 (图4)。
转化后的愈伤组织经过 PFF的4次筛选和再生芽的 1次选择 ，再加上 Gus基因能够进行瞬时表
达，Southern杂交结果表明 LEA 蛋白基因整合到草莓染色体 DNA中，但外源基因能否转录和表达，
尚需进一步的分子生物学检测和胁迫处理试验加以印证，如 Northern杂交 、Western杂交和一系列的水
分、盐分胁迫等，这是今后要进行研究的几个主要问题。
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324 园 艺 学 报 3O卷
{
0
0 0
0
波长
W avelength(nⅡn
图3 反应液吸收光谱
F ．3 U t spectra ofthe reactionmedia
1 2 3 4 5 6 7
图4 Southern blot分析结果
— — — — 2．0kb
— — 1．0kb
1．阴性对照，2～6．转基因植株，7．Marker。
Fig．4 The result of southern blot
1．Negative control，2—6．Transgenic plants，7．Marker
参考文献：
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．LEA3 Gene Transferred into Strawberry
Wang Junli。 ，Ge Huibo3，Peng Shiqi。，Zhang Hongmei。，and Xu Jiuru2
( of Science，Hebei Uni~ y，Baoding 071002，China； Colege of B／dog／ca／Sc／ence and Techno／ogy， ，lg
Forestry ， 100083，Ch／na； Colege ofHorticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Ch／na)
Al~-traet：Callus of anther from strawbery (Fragaria allanz28sa Duch．Darslect)was induced on MS
inL~uIn．Late embryogenesis abundant protein gene，LEA3，from barley(ttordeum vulgare L．)was introduced
into strawberry callus by the aid of biolistic-mediated transformation method．After 4 times of PPI’selected culture．
resistant calli and regenerated plants were obtained．The hybridization bands were determined in diferent transgenic
plants by Southem blot，and this showed that LEA3 gene was integrated into strawberry genome．
Key words：Strawberry；Anther； Calus； LEA3 gene；Transformation
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