全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (3) : 194～199
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 12 - 05 ; 修回日期 : 2001 - 04 - 23
应用高剂量辐射花粉授粉及幼胚培养诱导苹
果单倍体
何道一1 　孙　山2 　崔德才1 　陈振光3
(1 山东农业大学生命科学学院 , 泰安 271018 ;　2 山东省果树研究所 , 泰安 271000 ;　3 福建农业大学园艺
系 , 福州 350002)
摘 　要 : 以 1 000～1 500 Gy 剂量的γ射线处理‘红星’苹果花粉 , 以此花粉给‘贝拉’、
‘辽伏’和‘富士’苹果授粉 , 获得 3 个品种的幼胚 , 经幼胚培养得到各品种的单倍体植株。
试验结果表明 , 影响高剂量辐射花粉技术生产苹果单倍体效率的主要因素是早期落果、幼胚
败育和带胚乳幼胚不能培养再生植株。初步研究表明 25 日龄幼胚 (胚珠) 可以培养再生植株。
关键词 : 苹果 ; 辐射 ; 花粉 ; 单倍体 ; 胚培养
中图分类号 : S 661. 1 ; S 603 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2001) 0320194206
植物单倍体及双单倍体材料不仅有利于遗传性状的分析 , 还可有效增强育种目的性 ,
缩短育种周期 , 提高育种效率〔1〕, 对于象苹果这样遗传组成复杂的多年生木本果树 , 这类
材料在其性状遗传分析和育种实践中更具价值。在苹果实生苗后代中 , 自发单倍体的频率
极低 , 要鉴定出这样的单倍体也相当费工费时。因此 , 人工创建单倍体成为苹果单倍体生
产的首选方法。早在 70 年代 , 就有苹果花药培养的研究报道〔2 ,3〕, 只有少数获得成
功〔4～6〕。辐射花粉技术不仅可用于诱变育种 , 而且能够诱发产生植物单倍体〔7 ,8〕, Zhang〔9〕
和 Witte〔10〕等曾利用 1 000 Gy 以下的辐射剂量处理具标志性状的苹果花粉 , 诱发产生了苹
果单倍体植株。解剖观察表明 , 即使花粉受到 1 000 Gy 以上剂量的辐射处理 , 它在柱头
上仍能萌发 , 花粉管正常伸长到达胚囊〔11〕。因此 , 为提高辐射花粉诱导单倍体的效率 ,
我们尝试利用 1 000 Gy 以上的辐射剂量处理苹果花粉诱发单倍体的效果。
1 　材料与方法
花粉采自山东省果树所第四分场正常挂果的壮年‘红星’苹果树。在花瓣即将张开时
采取花蕾 , 在室内取出花药自然风干。收集花粉于干燥的青霉素瓶中 , 在山东农业大学辐
照中心进行辐射处理 , 剂量率为 16. 7 Gy·min - 1。处理花粉在当天进行发芽试验。将花粉
接种于含有 10 %蔗糖、0. 6 %琼脂和 10 mg·L - 1硼酸的培养基中 , 在培养箱中 25 ℃保温
4 h , 计算 3 个不同视野的花粉及萌发数 , 取平均值。用测微尺测量花粉管长度。
授粉在山东农业大学实验农场果园、泰安和新泰果树专业户果园中进行。授粉母树为
正常挂果的青壮年树。选择即将开放的花蕾去雄套袋 , 每个花序保留 3 朵花 , 其余去除 ,
去雄后第 2 天授粉、挂牌 , 以未辐射处理的花粉为对照。授粉后 1 周去袋。供试品种为
‘贝拉’、‘辽伏’和‘富士’。
授粉后不同时期调查坐果结实情况。授粉后 70 d 收获果实 , 调查种胚发育情况。收
获的幼胚接种于 MS 的无激素培养基上 , 在 4 ℃低温条件下保存 40 d , 再接种到 MS + NAA
0. 1 mg·L - 1 + BA 0. 5 mg·L - 1的生芽培养基上培养。
分别取出授粉后 25 d 和 40 d 的胚珠 , 接种于 MS + IAA 0. 01 mg·L - 1 + NAA 0. 01 mg·
L - 1 + GA 0. 01 mg·L - 1 + KT 0. 01 mg·L - 1的培养基上培养。生芽培养基组成为 : MS + NAA
0. 1 mg·L - 1 + BA 3. 0 mg·L - 1。
幼胚萌发再生植株经过数次扩增后在生根培养基诱导生根。取其幼根制片进行染色体
计数观察。生根培养基组成为 : MS + IBA 0. 1 mg·L - 1。染色体制片参照林盛华等〔12〕的方
法 , 略改进。
2 　结果与分析
2. 1 　不同辐射剂量对花粉萌发的影响
从图 1 看出 , 除辐射剂量在 500 Gy 时花粉萌发率和花粉管长度有异常表现外 , 总体
趋势是随辐射剂量的升高 , 花粉萌发率降低、花粉管长度下降。辐射剂量高达 1 000～
1 500 Gy 时 , 花粉的萌发率近 70 % , 花粉管仍能伸长到一定长度 , 这表明可以利用这样的
剂量辐射处理花粉以诱导孤雌生殖。
2. 2 　高剂量γ射线处理花粉对苹果坐果和种子产生的影响
高剂量处理花粉 , 使所试各品种坐果结实能力大大降低 , 剂量越高 , 结实率越低 , 受
照花粉授粉后引发的落果主要发生在授粉后 20～30 d。在供试的 3 个品种中均表现出剂量
越高 , 最终果实收获量越少 , 平均单果种子数也越少 (表 1) 。受照花粉授粉也影响果实
的生长发育 , 授粉后 70 d 收获的果实处理组明显小于对照组 (图版 , 1) 。
图 1 　不同辐射剂量对苹果花粉萌发的影响
花粉萌发率　●花粉管长度
Fig. 1 　The effect of different radiation dose
on pollen germination
Germination rate of pollen 　●The length of pollen tube
表 1 　辐射花粉对苹果结实的影响
Table 1 　The effect of irradiated pollen on seed
setting in apple
品 种
Varie2
ties
剂量
Radia2
tion
dose
( Gy)
授 粉
花 数
No. of
flower
pollina2
ted
坐果率 3
Rate of setting
( %)
20 d 30 d
最终结
果率 3
Final
rate of
setting
( %)
平均单果
种子数 3 3
Mean
number
of seed
per fruit
贝 拉 　 0 350 92. 5 c 73. 1 c 60. 8 c 8. 1 b
Bela 1 000 325 69. 5 b 9. 4 b 8. 9 b 4. 0 a
1 500 310 60. 1 a 5. 0 a 4. 2 a 3. 0 a
辽 伏 　 0 350 94. 3 c 68. 0 b 56. 9 c 6. 0 b
Liaofu 1 000 330 69. 4 b 8. 3 a 7. 9 b 3. 2 a
1 500 310 58. 3 a 4. 7 a 3. 9 a 2. 8 a
富 士 　 0 350 95. 7 b 81. 2 b 70. 0 b 7. 0 b
Fuji 1 000 330 70. 1 a 10. 5 a 9. 0 a 4. 7 a
1 500 345 64. 2 a 6. 9 a 5. 8 a 5. 8 a
　　3 百分数比较测验 , 3 3 t 测验。3 Comparative test of percentage , 3 3 t test .
5913 期 　　　　　　何道一等 : 应用高剂量辐射花粉授粉及幼胚培养诱导苹果单倍体 　　　　　　　
2. 3 　高剂量γ射线辐射花粉对苹果种子内含物的影响
以受照花粉授粉 , 不仅影响各品种的坐果结实 , 对种子的正常发育也产生影响。辐射
花粉授粉后产生的种子发育进程明显落后于对照组 , 在授粉后 70 d 收获的各对照品种种
子中 , 胚乳已完全消失 , 而辐射处理花粉授粉的各品种中 , 此时的种子却有 4 种不同的类
型 : Ⅰ空秕种子 , 此种类型所占比例大 , 种子具有正常大小的硬质外种皮 , 内有种胚退化
的痕迹 ; Ⅱ只有胚乳 , 这种类型的种子胚已退化成薄片 , 硬质胚乳占据种子内空间 ; Ⅲ胚
与胚乳共存 (图版 , 2) , 该类种子中胚乳呈半硬化状态 , 胚的形态完全正常 , 具有两片子
叶 , 但比正常胚小得多 ; Ⅳ只有胚 , 该类种子胚乳已完全消失 , 胚发育正常 , 但明显小于
正常胚 , 约为正常胚二分之一 (图版 , 3) 。从受照剂量看 , 剂量越高空秕种子的比例越
大 , 有胚种子的比例越小 , 各品种表现趋势基本一致 (表 2) 。
表 2 　辐射花粉对苹果种子的影响
Table 2 　The effect of irradiated pollen on apple seed structure
品　种
Varieties
辐射剂量
Radiation
dose ( Gy)
种子数
No. of
seed
空种子
Empty seed
( %)
只有胚乳种子
Seed with endosperm
only ( %)
只 有 胚 种 子
Seed with embryo
only ( %)
具胚和胚乳种子
Seed with embryo
and endosperm ( %)
贝拉 Bela 　 0 1 725 0 0 100 0
1 000 110 86. 4 5. 4 　3. 6 4. 5
1 500 　39 89. 7 5. 1 　2. 6 2. 6
辽伏 Liaofu 　 0 1 194 0 0 100 0
1 000 　83 88 4. 8 　3. 6 3. 6
1 500 　33 90. 9 3 　0 6. 1
富士 Fuji 　 0 1 740 0 0 100 0
1 000 138 82. 6 6. 5 　3. 6 7. 2
1 500 116 90. 4 2. 6 　2. 6 3. 4
2. 4 　高剂量辐射花粉诱导产生的不同类
型未成熟胚的培养及萌发
受照花粉授粉后产生 4 种类型的种子 ,
其中两种类型有胚 , 即一种是胚乳完全消
失的胚 , 另一种是胚乳尚存的胚 , 这两种
类型的胚经 40 d 的低温处理 , 接种于生芽
培养基中 , 经约 30 d 的培养 , 前者各品种
均有一定的萌发 (表 3 , 图版 , 4) , 而后
者均未能萌发生芽。
表 3 　辐射花粉诱导产生的幼胚培养及萌发
Table 3 　The germination of young embryo
with irradiatted pollen pollination
品 种
Varieties
无胚乳幼胚数
Young embryo without
endosperm No.
萌发胚数
Germinating
embryo No.
萌发率
Rate of
germination
( %)
贝拉 Bela 　5 4 80
辽伏 Liaofu 　3 3 100
富士 Fuji 　8 5 62. 5
2. 5 　高剂量辐射花粉诱导产生的苹果早期幼胚 (胚珠) 培养
授粉后 40 d 取样时 , 受照花粉组的种子尚不能分离出肉眼可辨的完整幼胚 , 分别对
授粉后 25 和 40 d 的‘富士’胚珠进行培养 , 试验结果表明 , 在 MS + IAA 0. 01 mg·L - 1 +
NAA 0. 01 mg·L - 1 + GA 0. 01 mg·L - 1 + KT 0. 01 mg·L - 1的培养基上经 3 个月的培养 , 25 日
龄的胚珠基部产生白色有结构的组织 , 再经 1 个月的培养 , 开始分化再生植株。植株形态
为典型实生苗类型 , 表明它是由胚发育而来 , 非其它组织产生。但在激素浓度较高的培养
基上 , 25 日龄胚珠只能产生愈伤组织不能再生植株。对于 40 日龄的胚珠在多种培养基上
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培养 , 均未诱导出再生植株。
2. 6 　高剂量辐射花粉诱导的苹果单倍体植株鉴定
辐射花粉诱导的苹果幼胚经培养再生植株和数次扩繁后 , 在生根培养基上长成完整植
株 (图版 , 5) , 经 10 多天炼苗 , 在砂 - 土基质上移栽 , 品种贝拉 4 个单倍体株系 21 个植
株、辽伏 3 个株系 13 个植株和富士 5 个株系 24 个植株均移栽成活。各品种再生植株及其
扩繁的最初几代 , 形态上均表现为叶片尖窄 , 节间紧凑 , 但随着繁殖代数的增加 , 叶片形
态发生多种变化 (图版 , 7) , 对其根尖细胞染色体制片观察 , 能进行染色体计数的细胞
90 %以上为 17 条染色体 (图版 , 6) 。
图版说明　1. 辐射花粉授粉产生的果实 , 左 : 对照 ; 2. 辐射花粉授粉产生的种子 , 左 : 对照 ; 3. 辐射花粉授粉
产生的幼胚 (70 d) , 右 : 对照 ; 4. 辐射花粉授粉产生的幼胚萌发 ; 5. 诱导生根的完整单倍体植株 ; 6. 单倍体植
株根尖细胞具 17 条染色体 ; 7. 扩繁中单倍体植株叶片形态的变化。
Explanation of plate 　1. The fruit from pollination with irradiatied pollen. Left : Control ; 2. The seed from pollination with irra2
diated pollen. Left : Control ; 3. The young embryo from pollination with irradiated pollen (70 d) . Right : Control ; 4. Germina2
tion of the young embryo from pollination with irradiated pollen ; 5. The complete haploid plant with induced roots ; 6. 17 chromo2
somes in root tip cell of the haploid ; 7. Variation of leaves of the haploid in propagation.
3 　讨论
适宜辐射剂量的确定是辐射花粉诱导单倍体产生的一个重要技术参数。适宜辐射剂量
可通过对受照花粉活力和授粉后坐果结实情况观察来确定。影响适宜剂量确定的因素有许
多 , 如花粉品种、辐射处理方法等 , 还有一条重要原则就是根据具体的实验材料和实验目
的来确定适宜剂量。Zhang 等〔9〕利用具标记性状的花粉进行辐射诱导苹果单倍体时采用低
于 1 000 Gy 的相对较低的辐射剂量 , 他们发现采用 500 Gy 的辐射剂量产生的后代中仍有
7913 期 　　　　　　何道一等 : 应用高剂量辐射花粉授粉及幼胚培养诱导苹果单倍体 　　　　　　　
一定数量的二倍体植株存在。我们在试验中一方面没有适宜的具标记性状花粉 , 另一方面
也希望减轻单倍体鉴定的工作量 , 对 1 000 Gy 及以上的辐射剂量辐射花粉诱导苹果单倍
体产生进行研究 , 从试验结果来看 , 1 000～1 500 Gy 的辐射剂量可以诱导苹果单倍体的
产生。
从高剂量辐射花粉授粉后的坐果结实情况看 , 最终收获种胚数量很少 , 影响因素有两
个方面 , 一是早期落果 , 另一个是后期种胚败育。从试验结果看 , 早期落果主要发生在授
粉后的 20～30 d , 这个时期尚无法分离幼胚。我们采用胚珠培养的方式挽救幼胚 , 在适宜
的培养基上培养 25 d 左右的富士胚珠还是可行的 , 此方法若也适于其它苹果品种 , 对于
提高苹果单倍体的诱导效率有重要意义。在收获的空秕种子中都残留胚败育的痕迹 , 目前
还不了解这类幼胚败育的时期和过程 , 也未能采取措施挽救这类幼胚 , 如这类幼胚培养能
得以成功 , 也将会提高诱导苹果单倍体的效率。
辐射花粉授粉后 70 d 收获时有两类种胚 , 即带胚乳的胚和不带胚乳的胚 , 前者未能
萌发 , 后者经过培养后再生植株。Witte 等〔10〕和 Zhang 等〔9〕都发现延长采果期 , 种胚的萌
发率提高 , 这个结果和我们的结果是相似的。尽管带胚乳的胚数量不多 , 但提高这类胚的
萌发还是有现实意义的。
在辐射花粉授粉 70 d 后收获的种子中发现有胚乳存在 , Zhang 等〔9〕在 2 个月和 3 个月
收获的种子中也发现胚乳的存在 , 这说明辐射花粉授粉产生的种胚较正常种胚发育延迟 ,
对这种胚乳尚有待深入研究。
参考文献 :
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12 　林盛华 , 贾定贤 , 蒲富慎 , 等. 我国苹果品种 (系) 染色体数目观察. 中国果树 , 1985 , (3) : 33～34
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Apple Haploid Induction by Pollination with High Dose Irradiated
Pollen
He Daoyi1 , Sun Shan2 , Cui Decai1 , and Chen Zhenguang3
(1 College of Biological Science Shandong Agricultural University , Tai’an 271018 ;　2 Shandong Institute of Pomology ,
Tai’an 271000 ;　3 Department of Horticulture Fujian Agricultural University , Fuzhou 350002)
Abstract : The parthenogenic young embryos were gained in apple varieties (Bela , Liaofu and
Fuji) due to pollination with radiated pollen by 1 000 - 1 500 Gyγ ray. The haploids of these va2
rieties were produced by young embryo culture and regeneration. The investigation indicated that major
factors which limited hapliod production efficiency in apple by such technique included abscission of
fruits in early stage , young embryo abortion and difficulty in regeneration of young embryo with en2
dosperm. The results also suggested that regeneration of 25 d young embryo (ovule) was available.
Key words : Apple ; Radiated pollen ; Hapliod ; Embryo culture
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