全 文 ：第20卷 第3期
Vol.20 No.3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 5月
May. 2012
野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究
侯永霞,王俊杰*,赵 彦,云锦凤,陈雪英
(内蒙古农业大学生态环境学院 内蒙古自治区草品种育繁工程技术研究中心
草地资源教育部重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010019)
摘要:以呼伦贝尔草原野生黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,对其组织培养及再
生体系进行系统的研究,以期为其下一步转基因试验提供良好的受体。结果表明:最佳愈伤诱导培养基为 MS+
1.5mg·L-12,4-D+0.4mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,下胚轴和子叶的最佳愈伤诱导率均可达到
100%。最佳胚性愈伤形成培养基为 MS+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,胚性愈
伤形成率为81.5%;最佳分化芽形成培养基为 MS+0.25mg·L-1KT+0.05mg·L-1NAA+2%蔗糖+0.7%琼
脂,分化芽形成率为36.5%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5mg·L-1NAA+1.5%蔗糖+0.7%琼脂,生根率为
93.3%。愈伤诱导结果显示,供试黄花苜蓿材料个体间组织培养再生性存在较大差异,在同一激素水平上有大约
1/3植株的愈伤状态优于其他植株。
关键词:黄花苜蓿;组织培养;再生体系;愈伤
中图分类号:Q943.1;S541 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)03-524-06
TissueCultureandRegenerationSystemofNativeMedicagofalcataL.
HOUYong-xia,WANGJun-jie*,ZHAOYan,YUNJin-feng,CHENXue-ying
(ColegeofEcologyandEnvironmentalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity;InnerMongoliaEngineeringTechnology
ResearchCenterforForageBreedingandReproduction;TheMinistryofEducationKey
LaboratoryofGrasslandResources,Huhhot,InnerMongolia010019,China)
Abstract:UsingcotyledonsandhypocotylsofwildMedicagofalcataL.fromHulunbeiergrasslandasex-
plants,tissuecultureandregenerationsystemofMedicagofalcataL.werestudiedforfurthertransgenic
experimentsprovidingagoodreceptor.Resultsshowedthattheoptimalmediumforcalusinductionwas
MS+1.5mg·L-12,4-D+0.4mg·L-16-BA+3%sucrose+0.7%agar,thehighestcalusinductionra-
tiowas100%.TheoptimalmediumforembryogeniccaluswasMS+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1
NAA+2%sucrose+0.7%agar,inductedratioofembryogeniccaluswas81.5%.Theoptimalmedium
fordifferentiatedbudswasMS+0.25mg·L-1KT+0.05mg·L-1NAA+2%sucrose+0.7%agar,dif-
ferentiatedratioofbudswas36.5%.Theoptimalrootingmediumwas1/2MS+0.5mg·L-1NAA+
1.5%sucrose+0.7%agar,rootingratiowas93.3%.Calusinductionresultsshowedthatthetissuecul-
tureofMedicagofalcataL.haddifferentinductionratiobetweenindividualswiththesamehormone.
Keywords:MedicagofalcataL.;Tissueculture;Regenerationsystem;Calus
苜蓿(Medicago)是世界最广泛种植的豆科牧
草,产量高、营养丰富、适口性好,在畜牧业生产中有
重要的地位和作用,而且由于其繁茂的枝叶和发达
的根系,也是优良的水土保持植物。随着畜牧业的
快速发展和环境条件的变化,传统的育种条件已不
能满足人们对苜蓿品种的需求。组织培养技术为苜
蓿快速育种创造了条件。国际上第1例苜蓿完整再
生植株由Saunders和Bingham通过器官形成和体
胚愈伤组织发育2条途径获得[1],国内最早由杨燮
荣[2]于1998年利用紫花苜蓿(Medicagosativa)的
叶片、叶柄、茎段作为外植体,通过诱导愈伤组织成
功获得再生苗。近几十年,随着组织培养技术的逐
收稿日期:2011-11-11;修回日期:2012-02-27
基金项目:国家“863”课题(2009AA10Z108);国家自然科学基金项目(31060323);内蒙古自然科学基金项目(2009MS0404)资助
作者简介:侯永霞(1987-),女,内蒙古乌兰察布人,硕士研究生,主要从事牧草遗传育种研究,E-mail:tuzilove0511370133@163.com;*通
信作者Authorforcorrespondence,E-mail:jw62@sina.com
第3期 侯永霞等:野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究
渐成熟,紫花苜蓿的各个组织器官以及原生质体[1],
都可以在添加不同外源激素的固体或液体培养基中
直接或间接诱导出再生植株,外植体主要包括叶片、
子叶、上下胚轴、叶柄、茎段、根、花药、子房、花序等,
采用最多的还是下胚轴和子叶,出愈率最高可达到
100%,分化率可达到90%[3]。但是,苜蓿不同种质
材料间的组培再生特性差异较大[4-5]。就苜蓿属植
物而言,黄花苜蓿(Medicagofalcata)的再生性能
与紫花苜蓿存在很大差异,而且不同来源黄花苜蓿
种质材料间的许多生长发育性状也存在较大差
异[6]。在苜蓿抗性育种中普遍认为黄花苜蓿是重要
的抗性基因源[7-8],建立高效的黄花苜蓿再生体系可
为苜蓿遗传工程和育种研究提供转基因受体。目
前,国内有关野生黄花苜蓿组织培养及再生体系建
立的研究很少,马海燕等[9]对新疆野生黄花苜蓿进
行了研究,提供了一定的方法途径。本研究以呼伦
贝尔草原的野生黄花苜蓿为材料,系统研究了不同
外植体、不同激素种类和浓度对黄花苜蓿诱导愈伤
及分化的影响,以期为黄花苜蓿种质创新和转基因
育种研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为野生黄花苜蓿种子,2010年采自内
蒙古呼伦贝尔草原。
1.2 方法
基本培养基为 MS,添加0.7%琼脂,PH 均为
5.8~6.0。试验的整个过程温度为23~25℃,无菌
苗生长阶段、愈伤组织分化阶段和生根阶段的光周
期为16h·d-1,愈伤阶段为暗培养。
1.2.1 无菌苗培养 挑选籽粒饱满的黄花苜蓿种
子用纱布包好,自来水冲洗30min,75%酒精震荡
消毒30s,无菌水冲洗3~5次,0.1%升汞震荡消毒
6~8min,无菌水充分冲洗尽量使种子表面无升汞
残留,滤纸吸干种子表面,接种于出苗培养基上。
1.2.2 愈伤组织诱导 取培养10d的无菌苗(图
1-A)下胚轴和子叶,子叶切成面积为3~4mm2,下
胚轴切成2~3mm的小段接种于愈伤诱导培养基
上,添加的激素为2,4-D和6-BA,其中2,4-D设5
个浓度梯度,分别是0,1.0,1.5,2.0和2.5mg·L-1,
6-BA设6个浓度梯度,分别是0,0.3,0.4,0.5,0.75
和1.0mg·L-1,共30个组合,具体情况如表1所
示,愈伤诱导培养基中加30g·L-1蔗糖。每种培养
基子叶4个重复,下胚轴3个重复,每个重复12个外
植体。30d后统计愈伤率。在这个阶段,每一种激素
水平诱导愈伤时所用的外植体均为单株试验。
1.2.3 胚性愈伤组织的诱导及分化芽的形成 挑选
呈现淡绿色、成团状结构且愈伤块较大的愈伤组织接
种于胚性愈伤组织诱导培养基中,分化培养基添加的
激素是KT和NAA,其中KT设4个浓度梯度,分别是
0,0.3,0.5和1.0mg·L-1,NAA设5个浓度梯度,分
别为0,0.1,0.3,0.5和1.0mg·L-1,共20个组合,具
体情况如表2所示,分化培养基中加20g·L-1蔗糖。
每个处理设5个重复,每个重复13个外植体。20d后
统计形成胚性愈伤组织数。之后,继续转入表3所示
的培养基中,诱导胚状体形成分化芽,然后转入不添加
任何激素的MS培养基中使分化芽形成植株。每个处
理设3个重复,每个重复52个外植体。其他颜色较绿
但愈伤块较小的愈伤组织继代培养,愈伤继代培养基
为MS+1mg·L-12,4-D+0.15mg·L-16-BA+20
g·L-1蔗糖。
1.2.4 诱导生根 将生长到2~3cm高的组培苗转入
生根培养基中,生根培养基为1/2MS中添加不同浓度
的NAA,浓度分别为0,0.5和1.0mg·L-1,使组培苗
生根,30d后统计生根率。
1.2.5 再生体系建立过程评价指标
愈伤组织诱导率(%)=
诱导出愈伤组织的外植体数
接种的外植体数
×100;
胚性愈伤形成率(%)=
胚性愈伤形成数
接种的愈伤组织数×100;
分化芽形成率(%)=
分化芽形成数
接种的胚性愈伤数×100;
生根率(%)=
生根的幼苗数
接种的幼苗数×100。
1.3 数据处理
采用SAS9.0进行数据统计和方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同外植体和不同激素对愈伤组织诱导结果
影响
在黄花苜蓿胚性愈伤诱导的过程中,不同外植
525
草 地 学 报 第20卷
图1 野生黄花苜蓿再生体系建立过程图
Fig.1 RegeneratedprocessofwildMedicagofalcataL.
注:A.无菌苗;B.最佳愈伤;C.同一激素水平不同单株愈伤;D.胚性愈伤;E.分化苗;F.生根苗;G.分化苗的根;H.移栽苗
Note:A.sterileseedlings;B.excelentcalus;C.differentindividualcalusonthesamehormonelevel;D.embryogeniccalus;E.differ-
entiatedseedlings;F.rootedplantlet;G.rootofdifferentiatedseedlings;H.plantletinpot
体开始出愈的时间不同,下胚轴4d后开始出愈,子
叶7d后开始出愈。在只添加2,4-D的培养基上均
能形成愈伤组织但都发白且稀软,基本没有胚性绿
点。在只添加6-BA的培养基上外植体不能形成愈
伤,或者只在外植体的伤口处稍愈。说明2,4-D在
愈伤诱导过程中起着决定性作用。Saunders和
Bingham[1]于1972年在获得苜蓿再生苗的过程中
也首次强调了2,4-D在愈伤诱导中的重要作用。由
表1可知,野生苜蓿愈伤诱导率最高的激素组合为
MS+1mg·L-12,4-D+0.4mg·L-16-BA,子叶
和下胚轴的愈伤率均可达到100%,且愈伤状态也
最好,颜色呈鲜绿色,结构紧密(图1-B)。6-BA浓度
在同一水平时,随着2,4-D浓度的增大,愈伤率从高
到低所对应培养基中2,4-D 的浓度依次为1.5
mg·L-1>1mg·L-1>2mg·L-1>2.5mg·L-1,
且2,4-D浓度越大,愈伤褐化越严重。2,4-D在同一
浓度时,低浓度的6-BA不利于愈伤组织的诱导,随
着6-BA浓度的增大,下胚轴愈伤率变化不大,但也
有逐渐降低的趋势,子叶的愈伤率逐渐降低。当
6-BA浓度超过0.4mg·L-1时,高浓度的2,4-D能
抑制子叶愈伤的形成,与低浓度2,4-D条件下的愈
伤率比较差异显著。
在单株试验中,发现在能产生愈伤的培养基上,
同一激素水平诱导的愈伤表现为有的单株外植体愈
伤绿,有的愈伤白 (图1-C),统计数据显示,能产生
较好状态的愈伤植株大约占接种植株总数的1/3。
2.2 不同激素对胚性愈伤组织及分化芽形成的影
响结果
愈伤组织在添加激素KT和NAA的培养基上
诱导胚性愈伤组织时,愈伤组织在7d后颜色开始
由淡绿色慢慢变为鲜绿色,且表面也逐渐突起,胚状
体开始萌发,渐渐成熟(图1-D)。由表2可知,KT
在胚性愈伤形成的过程中起着重要作用,KT浓度
逐渐增大时,胚性愈伤形成数呈先增高后降低的趋
势,说明KT能促进愈伤组织胚状体的发育,但高浓
度的 KT 同样也抑制胚状体的形成,KT 浓度为
1mg·L-1时,胚性愈伤形成率差异显著。试验结
果表明,KT浓度为0.5mg·L-1时,胚性愈伤的形
成数普遍比其他水平的高,说明 KT 浓度为0.5
mg·L-1是黄花苜蓿适宜的胚状体诱导浓度;在
KT浓度一定时,胚性愈伤的形成数随着NAA浓度
的升高而降低,说明在胚性愈伤形成的过程中低浓
度的NAA比较合适,试验中筛选的适宜胚性愈伤
组织形成的最佳激素配比为 MS+0.5 mg·L-1
KT+0.1 mg·L-1 NAA,胚性愈伤形成率为
81.5%。20d后转入表3所示的培养基中,这个阶
段的激素水平都要适当降低,成熟的胚状体开始慢
慢分化出芽,最适培养基是F1,最高的分化芽形成
率达到36.5%,由表3可知,高浓度的NAA会抑制
625
第3期 侯永霞等:野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究
表1 不同激素种类对黄花苜蓿愈伤组织诱导的影响
Table1 EffectsofdifferenthormonesonthecalusinductionofMedicagofalcataL.
培养基编号
Mediumnumber
2,4-D
/mg·L-1
6-BA
/mg·L-1
子叶愈伤率/%
Rateofcotyledon
下胚轴愈伤率/%
Rateofhypocotylcalus
愈伤生长状态
Stateofcalusgrowth
Y1 0 0 0.00±0.00f 0.00±0.00c -
Y2 1 0 95.83±4.79abc 97.23±4.79ab A-
Y3 1.5 0 97.93±4.15ab 97.23±4.79ab A-
Y4 2 0 93.75±7.99abcd 94.43±9.64ab A-
Y5 2.5 0 93.75±12.50abcd 91.67±8.35ab A-
Y6 0 0.3 0.00±0.00f 0.00±0.00c -
Y7 1 0.3 95.83±8.35abc 100.00±0.00a A+
Y8 1.5 0.3 97.93±4.15ab 100.00±0.00a A++
Y9 2 0.3 95.85±4.79abc 97.23±4.79ab A+
Y10 2.5 0.3 91.68±6.82abcde 97.23±4.79ab A
Y11 0 0.4 0.00±0.00f 0.00±0.00c -
Y12 1 0.4 100.00±0.00a 100.00±0.00a A+
Y13 1.5 0.4 100.00±0.00a 100.00±0.00a A++
Y14 2 0.4 100.00±0.00a 100.00±0.00a A
Y15 2.5 0.4 97.93±4.15ab 97.23±4.79ab A
Y16 0 0.5 0.00±0.00f 0.00±0.00c -
Y17 1 0.5 95.85±4.49abc 100.00±0.00a A
Y18 1.5 0.5 97.93±4.15ab 100.00±0.00a A++
Y19 2 0.5 89.58±8.00bcde 97.23±4.79ab A+
Y20 2.5 0.5 87.50±10.77cde 94.43±9.64ab A
Y21 0 0.75 0.00±0.00f 0.00±0.00c -
Y22 1 0.75 91.68±6.82abcde 100.00±0.00a A+
Y23 1.5 0.75 93.78±4.15abcd 100.00±0.00a A+
Y24 2 0.75 87.50±10.77cde 94.47±4.79ab A+
Y25 2.5 0.75 83.33±6.82e 91.67±8.35ab A
Y26 0 1 0.00±0.00f 0.00±0.00c -
Y27 1 1 89.58±8.00bcde 100.00±0.00a A
Y28 1.5 1 93.75±7.99abcd 100.00±0.00a A
Y29 2 1 85.40±10.49de 91.67±8.35ab A
Y30 2.5 1 83.33±6.82e 88.87±9.64b A
注:-:表示不产生愈伤组织,A-:表示愈伤状态发白、稀软且没有明显结构;A:表示愈伤组织发淡黄色,结构致密或松散,有的甚至褐化;
A+:表示愈伤组织黄绿相间,结构致密或松散;A++:表示状态最好的愈伤组织即淡绿,结构紧密且不软。同列不同小写字母间差异显著
(P<0.05);下同
Note:-:nocalus;A-:notgoodcalus;A:moderatecalus;A+:goodcalus;A++:excelentcalus.Differentsmallettersinthesame
columnindicatesignificantdifferences(P<0.05).Thesameasbelow
表2 不同激素种类对黄花苜蓿胚性愈伤诱导的影响
Table2 EffectsofdifferenthormonesontheembryogeniccalusinductionofMedicagofalcataL.
培养基编号
Mediumnumber
KT
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
胚性愈伤形成率
Rateofembryogeniccalus/%
培养基编号
Mediumnumber
KT
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
胚性愈伤形成率
Rateofembryogeniccalus/%
P1 0 0 4.62±6.89j P11 0.5 0 59.98±14.77cde
P2 0 0.1 35.42±8.78ghi P12 0.5 0.1 81.52±13.99a
P3 0 0.3 30.80±7.7hi P13 0.5 0.3 73.82±8.78ab
P4 0 0.5 29.26±10.04i P14 0.5 0.5 66.12±8.78bcd
P5 0 1 27.72±8.78i P15 0.5 1 53.82±5.41def
P6 0.3 0 43.10±6.85fgh P16 1 0 30.80±7.70hi
P7 0.3 0.1 67.66±6.44bc P17 1 0.1 47.70±6.39efg
P8 0.3 0.3 63.06±11.38bcd P18 1 0.3 43.10±11.64fgh
P9 0.3 0.5 59.96±6.44cde P19 1 0.5 38.48±9.39ghi
P10 0.3 1 53.82±5.41def P20 1 1 32.34±8.43hi
725
草 地 学 报 第20卷
分化芽形成,当浓度超过0.15mg·L-1时,分化芽
形成率差异显著。分化进入后期,分化芽继续生长
成苗(图1-E),这时继续使用激素会导致玻璃苗的
形成,所以可将再生苗转入不加任何激素的 MS培
养基中培养。
表3 不同激素种类对黄花苜蓿分化芽诱导的影响
Table3 Effectsofdifferenthormonesonthedifferentiated
budsinductionofMedicagofalcataL.
培养基编号
Mediumnumber
KT
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
分化芽形成率/%
Rateofdifferentiatedbuds
F1 0.25 0.05 36.50±7.70a
F2 0.25 0.15 31.13±3.06a
F3 0.25 0.25 20.80±1.44b
F4 0.25 0.5 12.27±4.70b
2.3 分化苗生根诱导结果
黄花苜蓿分化苗(图1-F)在3种生根培养基中
均能生根(图1-G),但添加 NAA的生根培养基中
根的数量及粗细程度均优于不加NAA的1/2MS,
生根较快,7~10d开始有根长出,而后者要10d以
后才能生根,当NAA浓度为0.5mg·L-1时,生根
率最高,可达93.3%,说明NAA对苜蓿的生根有明
显的促进作用。
2.4 再生苗的移栽
将生根30d后的再生苗经过炼苗后,移入土
中,90%以上的植株都可以成活(图1-H)。
3 讨论
植物组织培养技术的原理是细胞的全能性,即
在含有营养物质及植物生长激素的固体或液体培养
基中,培养离体植物器官或细胞并诱导使其长成完
整植株的技术。但是同一植物不同部位的器官组
织,形成完整植株的能力,会因其生理状态、再生功
能和外源营养的加入不同而表现出差异[10],不同外
植体的选择将导致愈伤组织及胚状体的形成和发育
能力之间的差异[11]。许多资料显示,紫花苜蓿的下
胚轴是愈伤诱导及分化的最佳外植体[12-13]。本试验
的结果表明,以黄花苜蓿的下胚轴和子叶为外植体
诱导愈伤组织,其愈伤率都可达到100%,但下胚轴
形成的愈伤状态比子叶的好,且具有更短的出愈时
间。
植物不同基因型对植物的愈伤诱导和分化能力
有很大影响,Saunders[1]和TonyHHChen[14]于20
世纪70年代在苜蓿的组织培养试验中提出基因依
赖的特点,认为基因型对紫苜蓿愈伤组织和体胚的
形成有一定影响。李聪等[15]对22个国内外不同基
因型的紫花苜蓿做了再生性试验,结果表明不同基
因型的苜蓿在苗的分化能力上存在较大差异。本试
验也证实了这一点,在对供试的黄花苜蓿材料愈伤
诱导时进行的单株试验中发现约有1/3植株诱导的
愈伤状态优于其他植株,这一结果可为系统选育提
高黄花苜蓿的再生效率提供参考。
在紫花苜蓿再生体系建立的过程中许多资料显
示,培养基中添加外源的生长素和细胞分裂素是必
需的[16-17],2,4-D对紫花苜蓿愈伤组织的诱导起着
决定性的作用[18],单独使用诱导的愈伤在后期分化
阶段较难形成胚状体,与适当浓度的细胞分裂素配
合使用不但可以提高愈伤率,还可以大大促进胚状
体的萌发[19];王晓春等[20]在金达苜蓿再生体系的研
究中发现愈伤诱导培养基中2,4-D和6-BA的添加
量为8︰0.2。本试验在黄花苜蓿的愈伤诱导中也
获得了相同的结果,单独使用2,4-D诱导的愈伤基
本不能进行下一步的分化,与6-BA协同作用能更
好的发挥作用。由于2,4-D往往只促进愈伤组织形
成和增殖,抑制器官分化,因而在分化过程中必须将
其除去[21]。在分化阶段,生长素和细胞分裂素换成
了KT和NAA,适宜浓度的KT对胚性愈伤组织的
形成有促进作用,浓度低不利于胚状体萌发的启动,
浓度高会使胚性愈伤分裂太快,使得愈伤块结构松
散且褐化,降低胚状体的诱导率,搭配低浓度的
NAA使用,可进一步促进细胞的分裂和扩大,同时
NAA可以诱导不定根的形成,但在胚性愈伤诱导
的后期及分化芽形成时要降低 NAA的浓度,避免
太多不定根的形成而抑制芽的分化。吕冬霞和曲长
福[22]也指出,生长素和细胞分裂素的结合使用比单
一使用更有利于于植物愈伤组织的分化。在胚状体
形成的后期,要降低激素的使用浓度甚至不使用任
何激素,使形成的胚状体能进一步分化成苗而不至
于继续形成次生胚或产生玻璃苗[23],因为长时间的
激素刺激可能会导致胚状体又向脱分化的趋势转
变,而且长时间激素刺激形成的再生苗比较弱。
4 结论
本试验对呼伦贝尔野生黄花苜蓿的组织培养及
再生体系进行了系统的研究,建立了一套黄花苜蓿
825
第3期 侯永霞等:野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究
组织培养高效再生体系,愈伤诱导率可达100%,胚
性愈伤形成率为81.5%,分化芽形成率为36.5%,
生根率为93.3%,可为下一步转基因试验提供良好
的受体。
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(责任编辑 李美娟
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)
更正声明
《草地学报》2012年第20卷第2期368页《川西北高寒牧区老芒麦和虉草青贮效果初步研究》一文中脚
注的作者简介中“博士研究生”应为“硕士研究生”,特此更正说明。
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