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Effects of Different Culture Conditions on Isoflavones Content in Callus of Alfalfa

不同条件对苜蓿愈伤组织异黄酮含量的影响(简报)



全 文 :第 15 卷 第 5 期
Vol. 15 No. 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 9 月
Sep. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 05-0500-03
不同条件对苜蓿愈伤组织异黄酮含量的影响(简报)
李 波, 肖 静, 李 铁, 包建成
(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)
关键词: 苜蓿; 异黄酮; 愈伤组织; 影响因子
中图分类号: Q943. 1 文献标识码: A
Effects of Different Culture Conditions on Isoflavones Content
in Callus of Alfalfa
LI Bo , XIAO Jing , LI T ie, BAO Jian-cheng
( C ol lege of Life S cien ce and E ngineering, Qiqihar un iversi ty , Qiqihar 161006, China)
Key words: Alfalfa; Isof lavones; Callus; Ef fect facto rs
黄酮类化合物是一种重要的药物,具有抗炎、镇
痛、扩张血管和保健作用[ 1、2]。由于黄酮的结构非常
复杂,人工合成十分困难,因此从植物中提取黄酮类
化合物已成为国内外研究的热点。苜蓿分布广泛,人
工栽培简单,自然资源丰富。研究不同因子对苜蓿愈
伤组织黄酮类代谢产物积累的影响,筛选出高黄酮类
的愈伤组织,为今后苜蓿异黄酮提取利用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
材料为紫花苜蓿龙牧 801的无菌苗。
1. 2 方法
1. 2. 1 愈伤组织的诱导和继代培养 将苜蓿无菌
苗的茎段切成 0. 5~ 1 cm 的小段, 接种于 MS+ 0. 5
mg/ L6- BA+ 2 mg/ L 2, 4-D+ 30 g 蔗糖(在不考虑
糖浓度对异黄酮积累的影响时) + 10 g 琼脂( pH=
5.8)培养基中。接种 20 d后, 将长势较好的愈伤组
织切成 0. 5 cm3 的小块, 接入配好的 MS 培养基中。
继代培养 15 d左右的愈伤组织即可用于黄酮的提取。
愈伤组织培养条件为: 设白色光照 (光强 9000
lx , 连续光照)和黑暗 2个处理。温度设定 4个梯度
为 20 e 、25 e 、30 e 、35 e ,蔗糖含量设为 15 g/ L、30
g / L、45 g/ L、60 g/ L 4个浓度梯度。
1. 2. 2 绘制标准曲线 用 5 Lg / mL 浓度的异黄酮
进行扫描,以选择最大吸收波长 Kmax ,测定Kmax=
264 nm, 在最大波长下,以空白样作对照,测上述各
浓度的吸光度 OD值,并绘制以 OD 值为纵坐标,浓
度 c为横坐标的标准曲线,计算回归方程:
Y= 0. 1051X- 0. 0023, R
2
= 0. 9997
其中 X 为浓度(Lg / mL) , Y 为 OD值。
1. 2. 3 样品中异黄酮提取及测定 取茎愈伤组织
若干,烘箱中烘干 3 h, 研钵研磨成粉末状, 精确称
取 2 g 用滤纸包好, 置于索氏提取器中, 加 60 mL
70%的乙醇,在水浴锅中加热回流,直至浸泡材料的
回流液体无颜色为止。倒出提取液, 将其减压浓缩
蒸去乙醇[ 3、4] (浓缩为 10 mL 左右)。
将浓缩液置于分液漏斗中用相同体积的石油醚
萃取 2~ 3次,以除去其中所含的脂类物质及色素,
然后再将其减压浓缩, 蒸干, 用 20 mL 80%的乙醇
对浓缩后的余留物质进行溶解。
吸取样品溶液,在 264 nm 波长时测其 OD值,
从标准曲线查样品中黄酮的含量(Lg / mL) ,计算出
干愈伤组织中异黄酮的含量( Lg/ g ) , 异黄酮含量
(Lg / g) = V @ C/ N @ M
收稿日期: 2007-03-28; 修回日期: 2007-06-11
基金项目: 黑龙江省教育厅科学技术研究项目( 10553120)
作者简介: 李波( 1962-) ,女,辽宁省鞍山人,教授,研究方向为植物细胞工程, E-mail: lib o1962@ 163. com
第 5期 李波等:不同条件对苜蓿愈伤组织异黄酮含量的影响
式中 V 为 20 mL , C 为提取液中测得的总黄酮
含量(Lg/ mL) , N 为称取的干愈伤组织的量( 2 g ) ,
M 为提取液稀释的倍数( 40)。
2 结果与分析
2. 1 光照对苜蓿愈伤组织异黄酮积累的影响
观察愈伤组织的生长过程中发现, 在光照和黑
暗两种条件下培养的愈伤组织有明显的不同, 在光
照培养下的愈伤组织呈绿色, 叶绿素含量较多,而黑
暗条件下培养的愈伤组织为黄色且比较疏松, 由表
1可以看出光照条件下异黄酮含量是黑暗条件下的
1. 5倍,说明光照对异黄酮形成有促进作用。
表 1 光照和黑暗下愈伤组织中异黄酮的含量
Table 1 Isoflavones content o f callus under light and dark
条件
Condit ion
吸光度值
Ab sorbance
含量( % )
Con tent ( % )
平均值( % )
Average( % )
光照 0. 941 0. 359
0. 367aA
light 0. 983 0. 375
黑暗 0. 716 0. 273
0. 265bB
dark 0. 675 0. 258
2. 2 温度对愈伤组织中异黄酮积累的影响
在 20 e , 25 e , 30 e , 35 e 4 个温度下, 苜蓿茎
愈伤组织中异黄酮积累情况见表 2,以 25 e 和 30 e
条件下的异黄酮含量较高,且与 20 e 和 35 e 条件下
的异黄酮含量相差极显著( P< 0. 01)。另外, 在对
35 e 条件下的褐变体和 35 e 正常培养的异黄酮含
量进行比较时发现,褐变后的愈伤组织中的异黄酮
含量远大于正常生长的愈伤组织, 是它的 2. 6倍, 这
说明愈伤组织的褐变对异黄酮的积累有利。
表 2 不同温度下愈伤组织中异黄酮的含量
T able 2 Isoflavones content o f callus under
different temperatures
温度( e )
Temperatur e( e )
吸光度值
Ab sorbance
含量( % )
Con tent ( % )
平均值( % )
Average( % )
20
0. 772 0. 295
0. 278bB
0. 694 0. 265
25
1. 301 0. 496
0. 497aA
1. 305 0. 497
30
1. 575 0. 600
0. 570aA
1. 414 0. 540
35
0. 650 0. 248
0. 246bB
0. 640 0. 247
2. 3 蔗糖浓度对愈伤组织中异黄酮积累的影响
15 g/ L、30 g/ L、45 g/ L、60 g/ L 4个不同的蔗
糖浓度梯度下,苜蓿愈伤组织中的异黄酮含量见表
3, 可以看出,蔗糖浓度在 15~ 60 g/ L 之间时愈伤组
织中的异黄酮含量随蔗糖浓度的增大而增大,表明
糖也是影响异黄酮积累的重要因子。
表 3 不同蔗糖浓度下愈伤组织中异黄酮的含量
T able 3 Isof lavones content of callus under differ ent
sucr ose concentrat ion
蔗糖( g/ L)
Sucr os e( g/ L)
吸光度值
Absorb ance
含量( % )
Conten t( % )
平均值( % )
Average( % )
15
0. 163 0. 0692
0. 068dC
0. 193 0. 0668
30
0. 276 0. 1059
0. 104cBC
0. 269 0. 1021
45
0. 361 0. 1380
0. 143bAB
0. 388 0. 1480
60
0. 472 0. 1810
0. 184aA
0. 493 0. 1870
3 小 结
3. 1 苜蓿异黄酮的积累量随蔗糖浓度的增加而增

在本试验中发现蔗糖浓度在 15~ 60 g/ L 之间
时愈伤组织中的异黄酮含量随着蔗糖浓度的增大而
增大。这个结论和其他研究者所报道的蔗糖浓度达
到 45 g / L 时 [ 5] ,异黄酮的含量不再随蔗糖浓度的增
大而增大有所不同,在本试验中当蔗糖浓度达到 60
g / L 时异黄酮含量还在增加。
3. 2 光照可以增加细胞生长和次级代谢物积累量
大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产
要求一定波长光的照射, 并对光照强度和光照时间
有一定的要求,而有些植物次级代谢物的生物合成
却受到光的抑制[ 6]。例如, 欧芹细胞在黑暗的条件
下可以生长,但是只有在光照条件下,尤其是在紫外
线的照射下, 才能形成类黄酮化合物。在苜蓿愈伤
组织的诱导过程中, 光照和黑暗条件下都可积累异
黄酮,但光照条件下积累的多。
光照强度也对植物细胞的生长和次级代谢物的
生成有显著影响[ 7]。因此在植物细胞培养过程中,
应根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种
类,进行光照的调节控制。
3. 3 苜蓿异黄酮积累的温度与植物细胞生长的温
度基本同步
植物细胞的生长、繁殖和次级代谢物的生产需
501
草 地 学 报 第 15卷
要一定的温度条件。在一定的温度范围内, 细胞才
能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢[ 8]。
不同的细胞有各自不同的最适生长温度, 植物
细胞的最适生长温度为 25~ 30 e 。有些细胞生产
次级代谢物的最适温度与细胞生长最适温度有所不
同,而且往往低于生长最适温度。但是若温度太低,
则由于代谢速度缓慢,反而降低次级代谢物的产量,
延长发酵周期。为此在有些植物细胞培养生产次级
代谢物的过程中,要在不同的阶段控制不同的温度,
即在细胞生长阶段控制在细胞生长的最适温度范
围,而在生产阶段则控制在次级代谢物生产的最适
温度范围。
参考文献
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(责任编辑 梁艳萍 才 杰)
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2007年 9月 24日
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5植物遗传资源学报6是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的专业性学术期刊, 全国优
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价数据库统计源期刊,又被5中国生物学文摘6和中国生物学文献数据库、中文科技期刊数据库收录。据中国
期刊引证研究报告统计, 2006年度5植物遗传资源学报6影响因子达 0. 872。
报道内容为大田、园艺作物,观赏、药用植物, 林用植物、草类植物及其一切经济植物的有关植物遗传资
源基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评论。诸如,种质资源的考察、
收集、保存、评价、利用、创新、信息学、管理学等;起源、演化、分类等系统学; 基因发掘、鉴定、克隆、基因文库
建立、遗传多样性研究。
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