全 文 ：第 16 卷 第 2 期
Vol. 16 No . 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 3 月
Mar . 2008
甘肃省苜蓿种质资源遗传多样性 RAPD分析
杨晓莉, 陈 丽 , 班 霆, 韩 鹏, 王晓娟*
(兰州大学草地农业科技学院; 甘肃省草原生态研究所, 甘肃 兰州 730020)
摘要 : 苜蓿( Medicago sativa L . )是世界上重要的豆科牧草, 了解栽培品种的遗传关系和遗传距离对于育种工作具
有重要意义。本研究利用 RAPD 标记技术对甘肃省 11个苜蓿栽培品种 (群)进行遗传多样性分析, 以期为进一步
开展苜蓿新品种选育奠定基础。结果表明: 10 个随机引物共检测到 132 条谱带,其中 107 条为多态性带, 多态性条
带比率(PP B)高达 81. 1% ; 天水苜蓿和定西苜蓿之间的 Roger s 遗传距离较远( 0. 4610) , 而与陇中苜蓿之间的遗
传距离较近( 0. 1406) ; 进一步的 AMOVA 分析显示苜蓿种群大部分的遗传变异发生在种群内( 61. 25% ) , 有
38. 75%的遗传变异发生在种群间, 种群分化不明显。
关键词: 苜蓿; 种质资源; 遗传多样性; RAPD
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2008) 02012906
RAPD Analysis of Genetic Diversity of Alfalfa Germplasms in Gansu Province
YANG Xiaoli, CHEN Li, BAN T ing , H AN Peng, WANG Xiaojuan*
( C ol lege of Pastoral Ag riculture S cience and Technology, Lanzhou University; Gan su Grass lan d
Ecological Research Inst itute, Lan zhou, Gansu Province 730020, Chin a)
Abstract: Alfalfa ( Med icago sativa L. ) is a fo rage legume of w orldw ide impor tance and the genet ic rela
t ionship and distance among cult ivars ar e of gr eat interest fo r breeding prog rams. In this paper, random
amplif ied po lymo rphic DNA ( RAPD) w as used to analy ze the genet ic diversity o f 11 alfalfa cult ivars. A to
tal of 132 discernible loci w ere obtained fo r all populations using 10 primers, and 81. 1% o f these loci w ere
po lymor phic, w hich indicated a high genet ic diversity in the cultivars from Gansu Prov ince. Accor ding to
the Roger s distance, the smallest MRD ( 0. 1406) o ccurr ed betw een cult iv ar s T ianshui and Long
zhong , w hile the lar gest ( 0. 4610) w as detected betw een cult iv ar s T ianshui and Dingx i . T he result of
AMOVA analysis show ed that the major ity ( 61. 25% ) of g enet ic variat ion was w ithin populations and 38.
75% among populat ions.
Key words: M edicago spp. ; Germplasm; Genetic div er sity; RAPD
紫花苜蓿(M edicago sativa L. )是多年生同源
四倍体( 2n= 4x= 32)和异花授粉植物 [ 1] , Lesins &
Lesins将其归属为紫花苜蓿复合体 [ 2]。四倍体苜蓿
基本染色体组在遗传上相对独立,但常发生基因交
流和种质渐渗 ( Int rogr ession) , 导致苜蓿在四倍体
水平上各分类单位之间以及内部的染色体组存在同
源性, 同时遗传基础又表现出相当大的异质性[ 3] , 因
而其种质资源遗传结构复杂多样。丰富的种质资源
为苜蓿育种提供了有利条件,但是,由于引种和品种
资源交流,使现有的一些苜蓿品种在名称和来源上
造成混乱,而且至今未能建立起有效的鉴别方法和
标准,这也在一定程度上限制了优良种质资源的进
一步开发利用。
利用表型特征检测苜蓿遗传多样性是最直接、
收稿日期: 20070528; 修回日期: 20070924
基金项目: 国家重点研究发展计划( 2007CB108904 ) ; 甘肃省自然科学基金项目 ( 3ZS051A25066) ; 兰州大学引进人才专项基金项目
( 582402)
作者简介: 杨晓莉 ( 1980) , 女,甘肃武威人,硕士研究生, 研究方向为牧草遗传育种, Email: yangxl05@ lzu. cn; * 通讯作者 Author for
correspondence, Email: xiaoju anw ang@ lzu. edu. cn
草 地 学 报 第 16卷
最简便易行的方法[ 4] ,但由于受环境、生育期等因素
的影响,使得形态标记在苜蓿分类、保护和育种中的
应用受到一些限制。生化水平上的遗传多态性研究
主要是利用同工酶和种子储藏蛋白等, 虽然生化标
记在苜蓿种质资源遗传多样性分析中广泛使用 [ 5] ,
蛋白质标记仍然存在酶的活性具有发育和组织特异
性、仅反映基因组编码区的表达信息以及标记数量
有限等不足之处。而近年来发展起来的 DNA 分子
标记技术, 如 RAPD ( Random Amplif icat ion Po ly
morphic DN A,随机扩增长度多态性 DNA)、AFLP
( Amplified Fragment Leng th Polymorphism, 扩增
片段长度多态性) 和 SSR ( Simple Sequence Re
peats,微卫星标记)等则克服了形态学标记和生化
标记的缺点,具有方法简便易行、检测位点多和检测
结果不受环境条件影响的优点, 因而被广泛用于植
物种质资源遗传多样性分析。其中, RA PD标记具
有对 DNA需要量极少、对 DNA 的质量要求不高、
操作简单易行和一套引物可检测整个基因组等优
点,成为目前最为广泛使用的分子标记技术, 在品种
鉴定[ 6~ 7] 、亲缘关系分析和亲本选配 [ 8~ 9]、基因定
位[ 10~ 11]、种质渐渗 [ 12]以及遗传图谱绘制 [ 13] 等研究
中被普遍应用。
由于紫花苜蓿为异花授粉植物, 其 DNA 多态
性研究的取样策略与遗传多样性分析直接相关。
Yu和 Paul建议在利用分子标记研究苜蓿系谱发育
关系和选择亲本挖掘最大杂交潜力时, 应采用群体
标记法[ 8]。而 Kidw ell等则认为群体标记法低估了
品种内的变异, 不能准确估计品种间的遗传距离 [ 3]。
因此,在具体应用时应根据研究的目的来选择是采
用单株标记法还是群体标记法。多项研究表明, 我
国苜蓿栽培品种的遗传结构特征是种内变异大于种
间变异[ 14] ,因此以品种培育为目标的分子遗传多样
性分析应采用单株标记方法, 可以确定优良单株进
入下一轮育种环节。
紫花苜蓿种类多、分布广,其遗传多样性与其地
域起源、分布有很大的关系。甘肃省苜蓿面积居全
国之首,在历史上也是种植最早的地区之一, 同时还
是我国主要的苜蓿种子生产基地。目前, 甘肃省苜
蓿种质资源主要包括育成品种(如甘农 1号等)、地
方品种(如陇东等)和引进品种,拥有一批抗旱、耐寒
和抗病性优良的种质资源,是今后选育高产、抗逆和
高品质苜蓿新品种的重要储备,但是,有关甘肃省苜
蓿种质资源分子遗传基础的研究还少有开展,本文
选取了 11个甘肃省有代表性的紫花苜蓿品种共计
110个单株,进行 RAPD标记分析, 为进一步开展苜
蓿品种改良奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
试验地设在兰州大学临泽试验站, 本次试验材
料采自紫花苜蓿种质资源评价苗圃内。品种来源见
表 1, 每个品种随机选取 10个单株。采集的叶片材
料立即放入液氮中保存。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 DNA 提取 在第一茬苜蓿生长的分枝期,
每个单株采集约 0. 1 g 幼嫩叶片用于苜蓿基因组
DNA 提取,提取方法采用改进的十六烷基三甲基溴
化胺( CTAB) 法[ 15]。用紫外分光光度计对提取的
DNA 进行定量检测,之后用琼脂糖凝胶电泳检测所
得 DNA的完整性。
1. 2. 2 引物选择 通过查阅文献,选取了 20 个引
物,以甘农 1号 DNA 为模板进行多态性扩增,最后
选取能扩增出稳定多态性片段的 10 个引物, 用这
10个引物对 110份苜蓿材料进行扩增。
1. 2. 3 RAPD扩增与检测 RA PD 扩增在 PTC
100( M J Research Inc, Amrica )上进行。扩增总体
系为 15 L, 其中包含 30 ng 模板 DNA, 3 mM
M gCl2 , 25 pmo l引物, 2 buf fer [ 20 mM T risHCl
( pH 8. 3) , 100 mM KCl] , 0. 5 mM dNT P, 1. 5 U
T aq酶。热循环参数为: 94 预变性 3 min,再进入
循环, 94 变性 15 s, 36 退火 30 s, 72 延伸
1 min,共 45个循环, 最后 72 延伸 10 min, 于 4
保存。之后扩增产物在凝胶成像系统( Alphalmay
erTM IS3400, German)进行观察拍照。
1. 3 数据分析
1. 3. 1 多态性位点比率( PPB) 在某一特定的位
点上,扩增的 DNA片段出现频率小于 0. 99 的位点
称为多态性位点[ 16] 。
多态位点比率 P= 多态性位点数/检测到的总
位点数
1. 3. 2 遗传距离
采用修订的 Roger s遗传距离( MRD)分析四
130
第 2期 杨晓莉等:甘肃省苜蓿种质资源遗传多样性 RAPD分析
倍体苜蓿的遗传距离 [ 7]。
D
2
ij= ( Y ia- Y ja ) 2 / A
式中, D为品种 i和品种 j之间的遗传距离; Y ia
指带 a在品种 i中出现的频率, Y ja指带 a 在品种 j中
出现的频率; A为总的位点数。
1. 3. 3 变异方差分析( AMOVA) 利用 PREP
AMOVA1. 55软件进行分子方差分析 [ 20] ,计算种群
内、种群间的变异方差分布。
表 1 苜蓿品种名称及来源
T able 1 Name and sou rce of alfal fa variet ies tested
品种名称
Variety name
代号
Code
种名
Species
品种类型
Variety ty pe
来源
Germplasm sou rce
甘农 1号 Gannong No. 1 GN1 M edicag o var ia Martyn 育成品种 Synthetic variety 甘肃农业大学 GAU
甘农 2号 Gannong No. 2 GN2 M edicag o var ia Martyn 育成品种 Synthetic variety 甘肃农业大学 GAU
甘农 3号 Gannong No. 3 GN3 M edicag o sat i va L. 育成品种 Synthetic variety 甘肃农业大学 GAU
中兰 1号 Zhonglan No. 1 ZL1 M edicag o sat i va L. 育成品种 Synthetic variety 中国农科院兰州畜牧研究所 LIAVP, CAAS
河西 Hexi HX M edicag o sat i va L. 地方品种 Local variety 甘肃农业大学 GAU
陇东 Longdong LD M edicag o sat i va L. 地方品种 Local variety 甘肃农业大学 GAU
陇中 Longzhong LZ M edicag o sat i va L. 地方品种 Local variety 甘肃农业大学 GAU
天水 Tiansh ui T S M edicag o sat i va L. 地方品种 Local variety 甘肃农业大学 GAU
定西 Dingxi DX M edicag o sat i va L. 地方品种 Local variety 中国农科院草原研究所 GRI, CAAS
甘杂 27 Ganza 27 GZ M edicag o sat i va L. 地方品系 Local l ine 甘肃农业大学 GAU
庆阳 Qingyan g QY M edicag o sat i va L. 地方品种 Local variety 中国农科院草原研究所 GRI, CAAS
表 2 遗传分析所用的扩增引物及其序列、扩增条带数和多态性位点比率
T ab le 2 Primer name, s equence, the n umber of ampl ified bands , and percentage of polymorphic loci
引物
Primer
序列( 53 )
Prim er sequ ence ( 53)
条带数
Total No. of bands
多态性带数
No. of polym orphic bands
多态性位点比率%
Percentage of polymorp hic loci
OPE1 GTT TCG CTC C 7 6 85. 7
OPE2 T GC T CT GCC C 10 9 90. 0
OPE3 GGT GAC GCA G 14 9 64. 3
OPE4 GT C CAC ACG G 10 7 70. 0
OPE5 CT G CT G GGA C 13 9 69. 2
OPE6 GAA CAC TGG G 13 12 92. 3
OPE7 ACC GCC T GC T 13 11 84. 6
OPE8 ACA T CG CCC A 18 16 88. 9
OPE9 T CC ACT CCT G 16 13 81. 3
OPE10 T TC CCC GCG A 18 15 83. 3
总计 T otal 132 107 81. 1
2 结果与分析
2. 1 引物筛选与遗传多态性分析
用所筛选的 10 引物对 11个苜蓿品种 110 个
DNA 样品基因组进行了 PCR反应, 所得 RAPD 多
态性图谱见图 1、图 2。10个引物在 11 个苜蓿群体
中共扩增出 132个 RAPD 位点, 其中多态性位点
107个, 多态性位点百分率高达 81. 1%。各引物检
测到的单株 DNA 的 RA PD 位点数在 6~ 18 个之
间,平均 13. 2个位点, 10个引物扩增的 RAPD多态
性位点 6~ 16个,平均达 10. 7个,多态性位点比率
在 64. 3%~ 92. 3%。不同引物扩增的多态性带数
及多态位点比率差异明显(表 2)。在所选引物扩增
的带中,并没有检测到品种特异性带。
2. 2 遗传距离
为比较和研究不同苜蓿品种间及品种内的遗传
差异,根据 RA PD扩增的结果, 计算了不同品种间
的 Roger s遗传距离(表 3) , 苜蓿属 11 个品种 110
份材料间的遗传距离在 0. 1406~ 0. 4610之间, 平均
遗传距离 0. 3964,表现出丰富的遗传多样性,其中,
天水苜蓿与陇中苜蓿的遗传距离最小,为0. 1406,而
天水苜蓿与定西苜蓿的遗传距离最大,为 0. 4610。
2. 3 AMOVA分析
AMOVA分析结果显示苜蓿种群大部分的遗
传变异发生在种群内( 61. 25%) , 有 38. 75%的遗传
变异发生在种群间 (表 4) , 种群分化不是很明显
( ST= 0. 3875)。
131
草 地 学 报 第 16卷
表 3 11 个苜蓿种群间的 Roger s 遗传距离
Table 3 Genet ic distance of 11 alfalfa var ieties tested acco rding to Roger s Genetic distance
Pop ID ZL GN2 GZ QY T S LZ GN3 HX LD GN1 DX
ZL ** **
GN2 0. 2406 ** **
GZ 0. 3336 0. 3456 *** *
QY 0. 3396 0. 3508 0. 2709 * ** *
TS 0. 3767 0. 3967 0. 4312 0. 4379 * ***
LZ 0. 3699 0. 3991 0. 4268 0. 4305 0. 1406 ** **
GN3 0. 4332 0. 4560 0. 4235 0. 4327 0. 4223 0. 4307 ** **
HX 0. 4258 0. 4177 0. 3947 0. 3837 0. 4299 0. 3974 0. 3482 *** *
LD 0. 3970 0. 3964 0. 4005 0. 3857 0. 4415 0. 4269 0. 4025 0. 4016 * ***
GN1 0. 4173 0. 4283 0. 3838 0. 4098 0. 4361 0. 4251 0. 3891 0. 3740 0. 4003 * ***
DX 0. 4198 0. 4380 0. 3799 0. 4064 0. 4610 0. 4445 0. 4363 0. 4420 0. 4200 0. 3459 * ***
注: ZL,中兰 1号; GN1,甘农 1号; GN2,甘农 2号; GN3,甘农 3号; QY,庆阳; TS ,天水; LZ,陇中; LD,陇东; DX,定西; H X,河西; GZ,甘杂
Note: ZL, Zhonglan No. 1; GN1, Gannong No. 1; GN2, Gannong No. 2; GN3, Gann on g No. 3; QY, Qin gyang; TS, Tiansh ui; LZ,
L on gzhong; LD, Longdong; DX, Din gxi; H X, H ex i; GZ, Gan za
132
第 2期 杨晓莉等:甘肃省苜蓿种质资源遗传多样性 RAPD分析
表 4 11 个苜蓿种群的 AMOVA分析
T able 4 Analysis of molecular variance ( AMOVA) of 11 al falfa populat ions
变异来源
Source of variat ion
平方和
SSD
变异组分
Variance com ponent
总变异百分比
Percentage of total var iance
P值
Pvalue
种群间 Among populat ion s 1032. 0727 8. 9122 38. 75% < 0. 0010
种群内 Within populat ions 1394. 4000 14. 0848 61. 25% < 0. 0010
3 讨 论
3. 1 RAPD标记的应用仅有十多年, 该方法目
前仍被看作是有益的、成本低廉、多态性高的分子标
记系统[ 17]。RAPD被广泛用于植物研究领域, 特别
是种内和种间变异分析, 进行异花授粉植物苜蓿和
其它牧草的遗传距离分析亦是一种快速、高产和有
用的检测方法 [ 7]。不同来源的苜蓿栽培品种(育成
品种和地方品种)存在高度的遗传多样性,多态性达
81. 1%(表 2)。早期研究表明, 与二倍体物种相比
较,更加复杂的多倍体遗传模式即意味着多倍体物
种的分子遗传基础研究进展相对缓慢[ 18] 。事实亦
是如此,苜蓿的遗传改良进程相对缓慢,这与苜蓿是
同源四倍体、2n= 4x= 32、异花授粉和综合品种等
遗传特征有关。另一方面, 由于不同地域之间环境
条件的差异使得苜蓿在漫长的进化过程中逐渐形成
了不同的种群、品种群、变种和生态型。毕玉芬等根
据遗传距离分析提出, 紫花苜蓿在遗传上既具有一
定的一致性,又具有各自独立的遗传性,遗传背景丰
富[ 19]。根据 Roger s 遗传距离分析, 天水苜蓿与其
它苜蓿品种的遗传距离较远, 这与天水苜蓿分布于
低海拔、湿润多雨地区有关。文中供试的其它苜蓿
种群间的分化与种群的地理分布并不一致, 其原因
可能与省内品种的频繁调种有关。遗传漂变或自然
选择而非迁移或基因流是影响种群分化的主要因
素[ 20]。苜蓿属于异花授粉植物,花粉和种子传播是
影响其遗传分化的主要因素。
3. 2 Yu等采用群体标记法研究后认为, 用筛选出
的 10条特异性引物,在每个品种(群)中取 10 个单
株,就可以区分 18~ 72个品种(群) [ 8]。魏臻武同样
采用群体标记法研究表明, 利用 2~ 3个 RAPD 引
物即可将不同苜蓿品种区分开来[ 9]。本研究采用单
株标记法, 在所筛选的 10 个引物的扩增的带中, 并
没有出现品种特异性带, 即不能将这 11个苜蓿品种
(群)进行区分。可能的原因之一是甘肃省苜蓿种质
交流频繁、品种混杂引起种质不纯,原因之二可能是
RAPD标记为显性标记,其重复性、稳定性和特异性
较 SSR 等共显性标记差。利用单株取样策略和
RA PD标记进行苜蓿品种鉴定, 若要达到将这些苜
蓿品种(群)有效分离的目的,品种内单株个数和引
物数量确定还有待进一步研究确定。
3. 3 进行 AMOVA 分析亦发现 11个苜蓿种群内
遗传多样性( 61. 25%)大于种群间遗传多样性( 38.
75%) ,表明苜蓿种群内的遗传变异占优势, 这与
Musial的研究结果一致[ 21] 。王中仁等认为, 与内繁
育植物相比,异花授粉等外繁育植物,其大多数的高
频率的等位基因都出现在居群内部, 而居群间相似
性却较高,差异较少,从而种群间的遗传变异相对小
于种群内部[ 22] 。Hamrick 等通过同功酶研究植物
的遗传结构也表明, 典型异花授粉植物其遗传多样
性大部分存在于群体内,群体间的遗传变异较少,一
般 90%以上的遗传变异存在异交植物群体内[ 23]。
通常,频繁的种内杂交会导致种群内部高度的遗传
变异。由于苜蓿花能被许多昆虫所接受, 所以虫媒
异交在苜蓿的繁殖过程中起着主要的作用 [ 24] ,即虫
媒异交导致了苜蓿种群之间存在较高水平的基因
流。从而使苜蓿群体内变异增加, 而群体间的相似
性却相对的提高。
3. 4 RAPD方法的简便、快速、灵敏很适宜开展植
物分子遗传多样性的初步研究, 但是, RAPD作为显
性标记所监测到的结果主要反映的是遗传变异被动
丢失的过程,而对于涉及物种适合度的问题所提供
的信息却非常有限 [ 25]。因此,对苜蓿种质资源进行
更加深入的了解, 还需进一步跟踪研究苜蓿种群内、
种群间的基因流状况, 以及一些质量和数量性状的
定位及分离情况, RFLP 及 SSR等共显性标记可直
接用于基因型分析,是替代 RAPD 标记进行苜蓿分
子标记辅助育种( MAS)的有益标记系统。
4 结 论
根据 RAPD分析, 甘肃省苜蓿种质(地方品种
和育成品种)基因组具有丰富的多态性,这与苜蓿异
花授粉特性是一致的。除此之外, 甘肃省地理环境
的异质性也是所选 11 份苜蓿种质资源出现遗传异
质性的原因,紫花苜蓿的分布从干旱区(如河西)、半
133
草 地 学 报 第 16卷
干旱区(如兰州)直至较湿润区(如天水) , 所处海拔
亦呈现明显的梯度变化。另一方面,不同的紫花苜
蓿品种具有不同的驯化和人工选育历史, 特别是引
进国外苜蓿种质资源作为亲本的人工育种工作, 亦
丰富了甘肃省苜蓿种质资源的遗传组成。本研究对
今后苜蓿遗传改良, 特别是杂种优势利用,具有重要
指导意义。
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(责任编辑 梁艳萍)
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