全 文 ：第２０卷　第２期
　Ｖｏｌ．２０　 Ｎｏ．２
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１２年　 ３月
　 Ｍａｒ．　　２０１２
不同荧光染料对苜蓿原生质体染色效果的研究
李玉珠１，师尚礼１＊，贺延玉２
（１．甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 甘肃省草业工程实验室
中美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州　７３００７０；２．甘肃农业大学研究测试中心，甘肃 兰州　７３００７０）
摘要：以紫花苜蓿品种甘农４号（Ｍａｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｇａｎｎｏｎｇ　Ｎｏ．４’）愈伤组织酶解的原生质体为材料，采用
ＦＤＡ、罗丹明Ｂ、罗丹明６Ｇ、吖啶橙和ＤＡＰＩ共５种荧光染料对原生质体进行染色效果比较，以期为原生质体活力
测定、细胞核计数及原生质体融合过程的观察提供参考。结果表明：ＦＤＡ、罗丹明Ｂ、罗丹明６Ｇ和吖啶橙均可使紫
花苜蓿原生质体清晰染色，可用于细胞融合时亲本原生质体的标识。ＦＤＡ是检测原生质体活力的理想染料；吖啶
橙和ＤＡＰＩ可对细胞核进行特异性染色，可用于融合时细胞核的观察和计数，前者还可用于检测融合细胞的活力。
通过对异源融合体的鉴别及其活力的测定，为摸索融合条件和融合细胞的培养提供了理论依据。
关键词：苜蓿；原生质体；细胞核；染色
中图分类号：Ｑ９４３．１；ＴＱ６１　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０２－０３４８－０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｄｙｅｓ　ｏｎ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ａｌｆａｌｆａ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ＬＩ　Ｙｕ－ｚｈｕ１，ＳＨＩ　Ｓｈａｎｇ－ｌｉ　１＊，ＨＥ　Ｙａｎ－ｙｕ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｉｎｏ－Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｒａｚｉｎｇｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｙｅｓ（ＦＤＡ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　６Ｇ，Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　ａｎｄ
ＤＡＰＩ）ｏｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ　Ｍａｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ‘Ｇａｎｎｏｎｇ　Ｎｏ．４’ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａ－
ｔｅｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｃｏｕｎｔ　ｎｕｃｌｅｉ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｅｙ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ．Ｒｅ－
ｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＦＤＡ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　６Ｇａｎｄ　Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　ｄｙｅ　ａｎｄ　ｍａｒｋ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｏｆ　ａｌ－
ｆａｌｆａ　ｃｌｅａｒｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｆｕｓｉｏｎ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ．ＦＤＡ　ｉｓ　ａｎ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｄｙｅ　ｆｏｒ　ｔｅｓ－
ｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　ａｎｄ　ＤＡＰＩ　ｃａｎ　ｄｙｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｗｈｉｃｈ
ａｒｅ　ｔｈｅｎ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｕｎｔ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｅｙ　ｎｕｃｌｅｉ　ｉｎ　ｃｅｌ　ｆｕｓｉｏｎ．Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｆｕｓｉｏｎ
ｃｅｌｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｃｅｌ　ｆｕｓｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ｆｕｓｉｏｎ　ｃｅｌｓ　ｂｙ　ｉｄｅｎｔｉｆ－
ｙｉｎｇ　ｈｅｔｅｒｏｃａｒｙｏｎ　ａｎｄ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔｈｅｉｒ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｌｆａｌｆａ；Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；Ｎｕｃｌｅｕｓ；Ｄｙｅ
　　紫花苜蓿（Ｍａｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）又称“牧草之
王”，具有营养丰富、适应性强、改土固氮等多种优
点，是世界上栽培历史最悠久，生长面积最大，利用
价值最高的优质豆科牧草［１，２］。利用各种生物工程
技术对紫花苜蓿进行品质改良一直是其研究领域的
热点和重要方向。
原生质体是指除去细胞壁的具有生活力的裸露
细胞，是获得单细胞无性系和选育突变体的优良起
始材料，其最令人瞩目的应用是体细胞杂交（ｓｏｍａｔ－
ｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［３］。植物体细胞杂交可克服有性杂
交遇到的诸多障碍，在转移抗逆性状，进行作物改
良，创造新型物种，定向转移胞质基因控制的性状和
利用配子－体细胞杂交产生三倍体植物上显示出重
要的应用前景。此外，体细胞杂交转移的基因为亲
本自身所携带，不存在安全性问题［４］。对原生质体
进行染色观察不仅是检测原生质体活力的重要方
收稿日期：２０１１－１１－１６；修回日期：２０１２－０２－２５
基金项目：国家牧草产业技术体系专项资金（ＣＡＲＳ－３５）；牧草种质资源保护与利用（ＮＢ２１３０１３５）；甘肃牧区优质饲草生产技术研究与示范
（２０１００３０２３）资助
作者简介：李玉珠（１９７９－），女，陕西宁强人，博士研究生，教师，主要从事牧草和草坪草种质资源保护与育种的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｚ＠ｇｓａｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ；＊通信作者 Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｉｓｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
第２期 李玉珠等：不同荧光染料对苜蓿原生质体染色效果的研究
法，也是研究体细胞杂交过程的重要手段。目前，利
用荧光染料对豆科牧草原生质体进行染色效果的研
究在国内仍为空白。因此，本研究以紫花苜蓿愈伤
组织为原生质体的制备材料，采用ＦＤＡ、罗丹明Ｂ、
罗丹明６Ｇ、吖啶橙和ＤＡＰＩ共５种不同的荧光染色
剂首次对其原生质体染色效果进行了分析与比较，
以期为今后豆科牧草原生质体的进一步培养和融合
提供实践参考。
１　材料与方法
１．１　原生质体的分离与融合
将紫花苜蓿品种甘农４号无菌苗下胚轴及子叶
接种于含 ＭＳ＋２．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ的诱导培养基上诱导愈
伤组织。通过６～８个月的继代，将愈伤组织质量调
整为质地疏松、结构致密的淡黄色或淡绿色的稳定
状态，用于原生质体的酶解。
将１ｇ左右愈伤组织置于约１０ｍＬ混合酶液
中。（２５±１）℃黑暗条件下在３０～６０ｒ·ｍｉｎ－１的摇
床上震荡１４ｈ。酶液组成为２％纤维素酶＋０．５％
果胶酶＋０．３％水平的崩溃酶，酶溶剂配方参考文献
［５］，ｐＨ　５．８，经０．４５μｍ微孔滤膜过滤灭菌。酶解
材料分别经１００和４００目无菌尼龙网筛过滤，除去
未酶解完全的组织和细胞团，滤液经１００×ｇ离心１０
～１２ｍｉｎ收集原生质体。用相应的酶溶剂悬浮，再
离心，重复１～２次。纯化的原生质体悬浮于含有
１０％甘露醇的细胞原生质体清洗液 ＣＰＷ（简称
ＣＰＷ１０）盐溶液中［５］，密度调整为１．０×１０５个·Ｌ－１
左右。
１．２　原生质体的染色方法
各供试染料均在避光室温条件下染色５～１０
ｍｉｎ，然后用ＣＰＷ１０溶液清洗２次，分别在普通光
（即明场，明视野）和荧光（即暗场，暗视野）下进行显
微观察。
１．２．１　ＦＤＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）染色　
ＦＤＡ是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，
在活细胞内，它被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于
荧光素不能自由地通过质膜，因而在完整的活细胞
中积累起来，但在死细胞和损伤细胞中不能积累，因
此，ＦＤＡ染色后发黄绿色荧光的原生质体为有活力
的，不发荧光的及发红色荧光的（叶绿素产生）则表
示死亡［６］。ＦＤＡ用丙酮配制成５ｍｇ·ｍＬ－１溶液，
４℃保存。每ｍＬ原生质体悬浮液加２５μＬ　ＦＤＡ染
料，在荧光显微镜中蓝光激发块（Ｂ激发）直接观察。
１．２．２　罗丹明Ｂ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ）染色　罗丹明Ｂ也
称玫瑰红Ｂ，俗称花粉红，是一种鲜桃红色、碱性人
工荧光染料。在溶液中有强烈的荧光，可用作细胞
荧光染色。配制０．１ｍｇ·ｍＬ－１罗丹明Ｂ水溶液保
存备用。使用时用ＣＰＷ１０溶液稀释１０倍，吸取纯
化的原生质体悬浮液０．５ｍＬ和１００μＬ稀释染料
混匀。荧光显微镜绿光激发块（Ｇ激发）下观察。
１．２．３　罗丹明６Ｇ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　６Ｇ）染色　罗丹明
６Ｇ与罗丹明Ｂ相似，是一种邻苯二酚类生物荧光
染色剂。Ｒ－６Ｇ溶解于含１００．０ｇ·Ｌ－１二甲基亚砜
（ＤＭＳＯ）的溶液中，工作浓度为４０μｇ·ｍＬ
－１，吸
取纯化的原生质体悬浮液０．５ｍＬ和１００μＬ稀释
染料混匀，在荧光显微镜Ｇ激发下观察。
１．２．４　吖啶橙 （ａｃｒｉｄｉｎｅ　ｏｒａｎｇｅ，ＡＯ）染色　吖啶
橙是一种可与核酸亲和的荧光活体染料。该染料具
有膜通透性，能透过细胞膜，使核ＤＮＡ和ＲＮＡ染
色。与ＤＮＡ结合量少发绿色荧光，与ＲＮＡ结合量
多发桔黄色或桔红色荧光［７］。用蒸馏水配制成
０．１％ 的吖啶橙储存液，避光４℃保存。用前１ｍＬ
吖啶橙储存液加ｐＨ　４．８磷酸缓冲液９ｍＬ，配制成
０．０１％ 吖啶橙酸染液。纯化的原生质体经吖啶橙
染色后，用ｐＨ　４．８磷酸盐缓冲液清洗，用荧光显微
镜Ｂ激发进行观察。
１．２．５　ＤＡＰＩ（４，６－联脒－２－苯基吲哚）染色　ＤＡ－
ＰＩ能与ＤＮＡ双螺旋的凹槽部分发生作用而紧密结
合［８］，是一种灵敏度高、特异性强的 ＤＮＡ 荧光染
料。将纯化的原生质体溶液用无水甲醇固定１５～
３０ｍｉｎ，ｐＨ　７．４磷酸缓冲液清洗２次，１μｇ·ｍＬ
－１
ＤＡＰＩ溶液染色，避光放置１０ｍｉｎ，ｐＨ　７．４磷酸缓
冲液清洗２次，荧光显微镜弱蓝光紫外（Ｕ 激发）激
发块观察。
２　结果与分析
本研究选用的５种荧光染料对苜蓿原生质体染
色结果如表１所示。原生质体经染色后在普通光下
观察，ＦＤＡ不能使紫花苜蓿愈伤组织原生质体染
色；荧光下有活性的紫花苜蓿愈伤组织原生质体发
黄绿色荧光，染色清晰（图１）。通过统计相应明场
与暗场中原生质体数量即可准确获得原生质体的存
活率（图２－Ａ，２－Ｂ）。图２－Ａ中箭头所指为无活力的
原生质体。但ＦＤＡ不能特异的将原生质体的细胞
核染色，不便于将细胞质与细胞核进行区分。
９４３
草　地　学　报 第２０卷
表１　５种荧光染料对紫花苜蓿原生质体的染色效果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｙｅｓ　ｏｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｌｆａｌｆａ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ＦＤＡ　 Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ　 Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　６Ｇ ＡＯ　 ＤＡＰＩ
明场 暗场 明场 暗场 明场 暗场 明场 暗场 明场 暗场
原生质体颜色Ｃｏｌｏｕｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ 原色 黄绿色 红色 橙黄色 红色 红色 红色 橙红色 原色 原色
细胞核颜色Ｃｏｌｏｕｒ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｎｕｃｌｅｕｓ 原色 黄绿色 红色 橙黄色、橙红色 红色 红色 红色 黄绿色 原色 蓝色
核清晰度Ｃｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｎｕｃｌｅｕｓ 不清晰 不清晰 不清晰 不清晰 不清晰 不清晰 不清晰 清晰 不清晰 清晰
　　在明视野中观察发现，罗丹明Ｂ和罗丹明６Ｇ
均将原生质体染成红色（图３－Ａ，图４－Ａ）；荧光下，
原生质体分别发橙黄色荧光（图３－Ｂ）和红色荧光
（图４－Ｂ）。罗丹明Ｂ使部分颗粒状内含物被染上深
红色或橙黄色（图３－Ｂ，箭头所示），偶见罗丹明６Ｇ
使内含物发出强烈红色荧光（图４－Ｂ，箭头所示），二
者均不能很好地对细胞核进行特异性染色。
普通光下，吖啶橙可使原生质体染成红色（图
５－Ａ），荧光下有活性的边缘清晰完整的原生质体在
暗场中发出橙红色荧光，细胞核发黄绿色荧光，区分
鲜明，无活性的死亡原生质体发绿色荧光（图５－Ｂ）。
细胞核多为１个，个别为２个（图５－Ｃ，箭头所示），
极少数有３～４个细胞核（图５－Ｄ，箭头所示）。
　　明视野中，ＤＡＰＩ不能使原生质体染色，在Ｂ激
发下紫花苜蓿细胞核发亮蓝色荧光，细胞质无色，可
明显鉴别出细胞核（图６－Ａ），多为１～２个，部分为３
核的细胞（图６－Ｂ，箭头所示），少数为多核的（图６－
Ｃ，箭头所示）。
３　讨论与结论
植物原生质体的染色观察是检测原生质体活
力、观察原生质体融合过程及计数细胞核的重要手
段。本研究利用５种荧光染料对紫花苜蓿原生质体
染色效果进行了初步研究，结果表明不同染色剂在
染色效果上存在差异，对于原生质体培养和体细胞
杂交而言意义各不相同。
０５３
第２期 李玉珠等：不同荧光染料对苜蓿原生质体染色效果的研究
　　经反复试验发现，５种荧光染料中ＦＤＡ、罗丹
明Ｂ、罗丹明６Ｇ和吖啶橙均可对紫花苜蓿原生质体
进行清晰染色，可用于体细胞杂交时不同亲本原生
质体的标识。其中，ＦＤＡ染色效果最好，区分度高，
最适于原生质体活力检测。罗丹明６Ｇ不仅是一种
荧光染料，也是一种细胞质失活剂［９］，广泛用于植物
原生质体非对称融合产生胞质杂种的研究。本研究
首次将其用于植物原生质体染色，浓度为 ４０
μｇ·ｍＬ
－１，与作为抑制剂常用的浓度相同［１０，１１］。
结果表明罗丹明６Ｇ不能将细胞核进行特异性染
色，在非对称融合中，其具有使原生质体失活和染色
的双重作用。黄静等［１２］利用吖啶橙对烟草（Ｎｉｃｏｔｉ－
ａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）原生质体染色前，先加入９５％ 的乙醇
将纯化的原生质体固定１５～３０ｍｉｎ。本研究中紫
花苜蓿原生质体未经乙醇固定也获得了理想的染色
效果，核质染色清晰，对比明显。因此，吖啶橙不仅
可用来检测融合细胞的活力，还可计数细胞核并统
计融合率。ＤＡＰＩ能够与ＤＮＡ强力结合，由于细胞
标记效率高，常用于细胞凋亡检测［１３］及特异性探针
制备进行原位杂交分析［１４］。本研究利用ＤＡＰＩ染
色时，尝试对原生质体不进行固定，但染色效果不
佳。由于ＤＡＰＩ可同时对活细胞和死细胞染色，因
此无法用于原生质体及其融合体的活力检测。
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（责任编辑　李美娟）
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