全 文 ：第 18 卷 第 3 期
Vol. 18 No. 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 5 月
May 2010
苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素
姚喜红1, 3, 魏臻武1, 2* , 耿小丽1, 3
( 1. 甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州 730070; 2. 扬州大学动物科学与技术学院, 江苏 扬州 225009;
3.草业生态系统教育部重点实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州 730070)
摘要: 苜蓿( Medicago sativa L . )花药悬浮培养体系的建立可为苜蓿体细胞杂交、遗传转化以及获得苜蓿单倍体,
建立苜蓿加倍单倍体群体( DH )提供快捷有效的途径。采用固-液培养基结合的方式建立苜蓿花药悬浮培养体系,
通过探索体系建立的基础条件及其影响因素,可建立适宜的苜蓿花药悬浮培养体系。结果表明, 苜蓿悬浮培养体
系中,基本液体培养基为 NB 培养基,培养液最佳组合为 NB+ 2, 4-D 0. 3 mg# L - 1+ NAA 0. 3 mg # L- 1, 蔗糖 2% ;
建立苜蓿花药悬浮细胞系,应选取淡黄色或乳白色, 结构疏松, 颗粒状胚性愈伤组织为悬浮培养的基础材料;苜蓿
花药悬浮细胞系继代周期为 6~ 8 d; 苜蓿花药悬浮培养时初始接种量为 2 g / 30 mL 时悬浮细胞 PCV、鲜重以及干
重的增殖倍数最高,增殖倍数均超过 4 倍; 植物生长调节剂 2, 4-D 的添加浓度以 0. 3 mg # L- 1为宜; 糖作为组织培
养过程中唯一的碳源,在苜蓿细胞悬浮培养体系中应有一定的浓度范围。因此,苜蓿花药悬浮培养中, 蔗糖浓度为
2% - 3%时效果最好。
关键词:苜蓿; 悬浮培养;接种量; 2, 4-D浓度; 蔗糖浓度
中图分类号: Q813. 1 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 03-0358-07
Establishment of Alfalfa Anther Suspension Culture
System and the Influencing Factors
YAO X-i hong 1, 3 , WEI Zhen-wu1, 2 , GEN G Xiao- li1, 3
( 1. Pratacul tu ral College, Gan su Agricul tu ral Un iversity, Lan zhou, Gansu Province 730070, Chin a; 2. C ol lege of An imal S cien ce &
T echnique, Yangzhou Un iversity, Yangzhou, Jian gsu Pr ovin ce 225009, Ch ina; 3. Key Lab oratory of Grass lan d Ecosystem of
M in ist ry of Educat ion / Sino-U. S. Centers for Grazingland Ecosys tem Sustainabilit y, Lanzhou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: Establishment of alfalfa anther suspension system w ill offer an ef fective approach for alfalfa so-
mat ic hybridizat ion and genetic t ransformat ion, acquisit io n of alfalfa haploid, and cr eat ion o f double hap-
loid ( DH ) . T he object ives of this resear ch w ere to established alfalfa suspension system and explo re the
basic condit ion and influencing facto rs. Combinat ion of so lid and liquid culture mediums w as chosen to es-
tablish this system . T he results show that NB w as the basic liquid medium for the establishment of alfalfa
suspension cell culture system and the best liquid medium combinat ion w as NB+ 2, 4-D 0. 3 mg/ L+ NAA
0. 3 mg / L and sugar concentrat ion w as 2%. Embr yogenic cal lus char acterized w ith st raw yellow or ivory
yellow , graininess, lo ose str ucture should be chosen as basic material to alfalfa anther suspension cell sys-
tem and the subcultur e cycle w as 6~ 8 d. When the init ial inoculat ion dosage w as 2 g / 30 mL, the pro lifera-
t ion mult iples of Packed Cell Volume ( PCV) , w et w eight , and dr y w eight o f suspension cell w as the high-
est and all o f them wer e above 4 t imes. When establishing alfalfa suspension cell system, the ideal concen-
trat ion of 2, 4-D was 0. 3 mg/ L . Being the only carbon sour ce in t issue culture, sugar should have a given
concentrat ion range dur ing the establishment of alfalfa suspension cell culture system. And in alfalfa an-
ther suspension culture, sugar concentrat ion at 2% ~ 3% had the best ef fect.
Key words: Alfalfa; Suspension cultur e; Inoculat ion dosage; Concentrat ion of 2, 4-D; Sugar concentr at ion
苜蓿(Medicago sat iv a L. )由于开放授粉而具
有很高的杂合性。通过苜蓿基因组学研究[ 1, 2] , 可
以缩短育种周期、提高选择效率, 进行分子聚合育
种。花药培养作为诱导植物单倍体的一种重要手
段,自印度学者 Guha等 [ 3] 1964年建立以来,在植物
遗传育种研究方面得到普遍应用。同时, 细胞悬浮
收稿日期: 2009-11-25;修回日期: 2010- 03-29
基金项目:国家/ 8630计划项目( 2008AA10Z149)、国家自然科学基金项目( 30972136)和国家科技支撑计划项目( 2008BADB3B10)资助
作者简介:姚喜红( 1983- ) ,女,甘肃天水人,硕士研究生,研究方向为牧草遗传育种; E-mail: yaoxih ong@ yahoo. com. cn; * 通讯作者 Au-
thor for correspondence, E-m ail: zh enw u_w ei@ yahoo. com. cn
第 3期 姚喜红等:苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素
培养由于分散性好、细胞或细胞团大小均匀, 生长迅
速,重复性好等有利因素[ 4] ,被广泛用于细胞学、发
育生物学及遗传学等领域的研究。细胞悬浮培养不
仅可直接用于原生质体分离和培养、生产次生代谢
物等, 还可以在细胞水平筛选预期突变。苜蓿花药
悬浮培养体系的建立可为苜蓿体细胞杂交提供优良
的培养条件;也可为获得具有目标性状、基因的苜蓿
植株和加倍单倍体群体( DH )的建立, 提供便捷、有
效的方式,为开展苜蓿基因组学研究提供可靠途径。
1953 年 Muir [ 5] 首先在烟草 ( N icot iana toba-
cum L. )和万寿菊( Tagetes er ecta L. )的细胞悬浮
培养上取得成功,开创了建立单细胞无性繁殖系的
方法。1958年 Stew ard等[ 6]人首次由胡萝卜( Dau-
cas car ota L. )细胞悬浮培养经体细胞胚胎发生途
径获得完整的再生植株。近年来细胞悬浮培养技术
在很多农作物上己经建立了具有分化潜力的悬浮细
胞系[ 7~ 11] 。在牧草方面,胡张华等 [ 12]在高羊茅( Fe-
stuca ar undinacea Schreb. )上也获得了悬浮细胞
系的再生植株。胚性悬浮细胞系作为分离原生质体
的来源, 已经广泛用于体细胞杂交和遗传转化。
Bingham 等[ 13] 发现通过组织培养或悬浮培养的方
式而来的苜蓿再生植株具有的再生性能为可遗传性
状。Kao 等 [ 14]对苜蓿悬浮培养所需的激素水平及
矿物盐浓度进行了研究。T amas 等[ 15] 利用悬浮培
养的方法研究了苜蓿组蛋白 H3 的转录稳定性。
Jiang 和 Miles[ 16] 对经斑点苜蓿蚜虫 ( T her ioaphis
tr if oli i maculata)唾液处理的紫花苜蓿悬浮培养细
胞的芬酸类物质的过滤进行了研究。Qamar 等 [ 17]
利用悬浮培养的方式研究了磷酸盐对苜蓿细胞生
长、磷酸盐转录水平以及细胞生理状况的影响。有
关研究国内仅见张晓东[ 18] 对苜蓿悬浮培养与耐受
高浓度 PEG变异体的筛选。
本试验通过苜蓿花药悬浮培养的方式, 探索苜
蓿悬浮细胞系建立的基本条件, 优化苜蓿悬浮细胞
系建立的培养基组合。以苜蓿花药培养诱导愈伤组
织,建立苜蓿悬浮培养体系,从而快速高效获得具有
亲本全套遗传基因的单倍体植株, 为通过细胞悬浮
培养建立苜蓿 DH 群体提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
苜蓿种质资源来自中澳苜蓿项目 ( ASI/ 1998/
026) ,从不同来源苜蓿种质中筛选出具有多叶性状
和株高性状的苜蓿单株。2007 年 6月 15日移栽至
种质资源圃进行杂交。F 1 代于 2008年 6 月 15日
播种。田间管理包括中耕除草、病虫害防治,每年按
期进行春灌和冬灌。本试验培养所用花药来自选系
多叶 0501 @ Sanditi组合。
1. 2 悬浮培养条件
固体培养基为 NB( N6大量+ B5有机+ B5微
量)培养基, 附加生长调节剂 2, 4-D0. 5 mg/ L +
NAA0. 5 mg/ L ;液体培养基为 NB基本培养基,附加生
长调节剂2, 4-D 0.3 mg/ L+ NAA 0. 3 mg/ L。
表 1 苜蓿悬浮培养 NB培养基配方
T able 1 Formulation o f NB medium fo r alfalfa suspension cultur e
培养基成分
Cultu re medium composit ion
含量( mg/ L)
Content
培养基成分
Culture m edium com posit ion
含量( mg/ L)
Contents
KH 2PO 4 400 C uSO 4 # 5H 2O 0. 025
( NH 4 ) 2 SO 4 463 CoCl2 # 6H2O 0. 025
KNO 3 2830 KI 0. 75
M g2 SO 4 # 7H 2 0 185 Zn2SO4 # 7H2O 2
CaCl2 # 2H2O 166 盐酸硫胺素( VB1) 10
FeNa2EDT A 28 盐酸吡哆醇( VB6) 1
M nSO 4 # 4H 2O 10 烟酸( Nicot inic acid) 1
H 3BO 3 3 肌醇( Inositol) 100
Na2M O4 # 2H2O 0. 25
1. 3 花药愈伤组织的诱导
取供试苜蓿品种未成熟花蕾于 4 e 下低温处理
24 h, 70%乙醇消毒 30 s, 再转入 0. 1% HgCl2 溶液
中消毒 5~ 8 m in,无菌水冲洗 3~ 4 次后,剥取花药
接种[ 19, 20]。接种在附加不同浓度组合的 2, 4-D( 2,
4-二氯苯氧乙酸)、NAA (A-萘乙酸)、KT (激动素)、
6-BA( 6-卞氨基腺嘌呤)等激素的愈伤组织诱导培
养基上。蔗糖浓度为 8% ,琼脂为 0. 6% , pH 5. 6~
359
草 地 学 报 第 18卷
6. 1。接种后将培养皿放入 25 e 的暗培养箱中暗培
养 15d后转入温度为 25 e 、光强 1000 lx、光照时间
16 h/ d、湿度 40%的培养箱内培养, 20 d后观察愈
伤组织诱导情况。
1. 4 胚性愈伤组织的获得
应用 NB培养基,附加不同浓度组合的 2, 4-D、
NAA 等激素, 将所诱导的愈伤组织进行继代。每
次继代挑选颜色鲜绿或黄绿色、生长迅速的愈伤组
织予以继代。前两次继代周期为 25 d,然后选择颗
粒较细、色泽淡黄、生长迅速的愈伤组织, 加快继代
频率( 1次/ 18 d)。培养条件同上。
表 2 培养基设计
T able 2 Design of culture medium
编号
N o.
基本培养基
Basic medium
激素(m g/ L) Phytohorm on es
2, 4-D NAA 6-BA KT
1 NB 1. 0 0. 5 0. 5 2. 0
2 NB 0. 5 0. 3 0. 5 3. 0
3 NB 1. 5 1. 0 0. 5 2. 0
4 NB 0. 5 0. 5 0. 0 0. 0
5 NB 0. 3 0. 3 0. 0 0. 0
注: 1-3为愈伤组织诱导培养基; 4为增殖培养基; 5为液体培养基
Notes: No. 1 to 3 are induct ion medium, No. 4 m ult iplicat ion
m edium , and No. 5 liquid medium
1. 5 悬浮细胞系的建立
愈伤组织形成后,选取鲜重 1~ 2 g 继代 5次以
后、最后一次继代 20 d左右的淡黄色或乳白色生长
快、结构疏松颗粒状胚性愈伤组织,置于盛有 30 mL
NB液体培养基的 100 mL 三角瓶中,用镊子将愈伤
组织轻轻夹碎, 然后置于摇床上振荡培养,摇床转速
为 110~ 120 rpm, 24 h 后用 100 目尼龙网过滤, 除
去愈伤组织碎片及大的细胞团,再经1000 rpm 离心
5 m in,除去上层碎渣,将所得的单细胞放入加有 30
mL 液体培养基的三角瓶中,制成细胞悬浮液, 置于
摇床上遮光下培养, 摇床转速为 110~ 120 rpm, 培
养温度 25 士 1 e 。前几次继代时, 待培养物静置 2
min后, 用吸管吸出 2/ 3左右上清液,补充加入新鲜
液体培养基至 30 mL。以后每次继代, 均用吸管吸
取密实细胞体积( PCV )约 1 mL (鲜重约 2 g )的悬
浮细胞至 100 mL 的三角瓶中,加入液体培养基至
30 mL,根据细胞的生长速度, 每 5~ 8 d继代一次。
1. 5. 1 悬浮细胞系生长特性的测定 取 6瓶第 4
次继代后 4 d的稳定悬浮细胞, 倒入无菌的 250 mL
三角瓶,分别混合均匀, 静置 2 min 后, 按照继代的
方法,用吸管吸取密实体积约 1 mL 的悬浮细胞至
100 mL 的三角瓶中, 加入 30 mL 液体培养基,共做
18瓶。每 2 d 取 2瓶进行密实细胞体积( PCV)、鲜
重、干重测定,重复 3次取平均值。
密实细胞体积( PCV)测定: 培养一定时间的悬
浮细胞系,取其充分摇匀的悬浮培养物 10 mL,放入
刻度离心管中, 1000 rpm 下离心 5 min,读取密实细
胞体积。
鲜重的测定:将悬浮培养物倒在己知重量的湿
尼龙网( 100 目)上, 用去离子水洗去培养基。真空
抽滤除去细胞上沾着的多余水分,然后称重。
干重的测定:悬浮细胞经干尼龙网( 100目)过
滤,烘干( 60 e , 10 h)后称重。
分别以悬浮细胞的 PCV ( mL)、鲜重 ( g )、干重
( g )生长量为纵坐标,以悬浮培养时间( d)横坐标作
苜蓿悬浮细胞系培养物生长曲线。
1. 6 悬浮培养的处理
1. 6. 1 悬浮培养的密度处理 不同培养密度对苜
蓿悬浮细胞生长的影响(从稳定悬浮细胞系中分别
吸取密实体积为 0. 1、0. 5、1. 0、2. 0, 3. 0和 4. 0 mL
进行培养)。
从初始实验材料中分别吸取以上浓度的悬浮培
养物, 6 d继代 1次, 在第 3 次继代后的第 6 d分别
测定 PCV、鲜重、干重的增殖数量,重复3次取平均值。
1. 6. 2 悬浮培养的生长调节剂处理 选择对细胞
生长影响较大的 2, 4-D为实验生长调节剂。2, 4-D
浓度分别为 0. 3、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0和 4. 0 mg/ L
将稳定悬浮系培养物接种到附加不同 2, 4-D浓
度的液体培养基中培养,继代 6 d后测定 PCV 增殖
情况。重复 3 次取平均值。初始接种量均为 200
mg/瓶。
1. 6. 3 悬浮培养的糖浓度处理 蔗糖作为悬浮培
养条件下唯一的碳源, 在液体培养培养条件下也起
着调节细胞渗透压的作用。
采用不同浓度蔗糖浓度(分别为 10、15、20、25、
30和 35 g )培养基进行细胞悬浮培养,并对继代 3
次达到稳定状态的悬浮细胞系进行检测, 每 6 d继
代一次。
苯酚- 浓硫酸法测定培养液中的残糖浓度,标
准曲线的绘制: 精确称取 50 g 糖溶于 1 L 蒸馏水
中,吸取 0、2、4、6、8和 10 mL 溶液于 100 mL 容量
瓶中定容,其浓度梯度分别为 0、10、20、30、40和 50
g / L。取上述标准液各 1 mL,加 1 mL 5 % 酚水溶
液( 5%酚水溶液: 精确称取 5 g 苯酚溶于 100 mL
360
第 3期 姚喜红等:苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素
蒸馏水定容) ,混匀后加 5 mL 浓 H2 SO4。放置 20
min 后, 在 487 nm 处, 以第一管溶液作为空白, 测
得不同浓度下吸光度值, 以吸光度值为横坐标,糖浓
度为纵坐标作图, 绘制标准曲线, 求回归方程; 培养
液中残糖浓度的定量分析: 吸取样品液 1 mL 按上
述标准曲线绘制方法处理样品液,以蒸馏水为空白
参比, 测定样品液吸光度。测得吸光度值代入回归
方程式求解样液中残糖浓度。
1. 7 统计分析
利用 Excel 2007和 SPSS 16. 0进行数据处理
和统计分析。
2 结果与分析
2. 1 苜蓿悬浮细胞系的建立及其生长规律
将经继代 4次的参试苜蓿品种疏松愈伤组织接
入 NB液体培养基中 1 d后,培养液出现棕红色, 并
随着时间的变化颜色逐渐加深, 第 4 d 出现明显的
颜色变化。第 2代、第 3 代和第 4代培养液也同样
出现颜色变红的现象, 但程度逐渐减轻, 至第 5 代
时,培养液呈米白色,细胞多为淡黄色的小米粒状的
团粒结构。
在液体振荡培养条件下, 测定细胞重量的变化
(图 1) , 苜蓿花药悬浮培养的生长周期为 14 d。在
继代 6 d 内, 细胞密实体积 ( PCV )、鲜重生长量
( FM P)和干重生长量( DM P)表现出较高的一致性,
这说明细胞分裂和细胞内含物质的积累具有同时
性。悬浮细胞系生长的活跃期在第 2~ 6 d, 这个时
期细胞体积、鲜重和干重呈指数增长,细胞分生能力
非常强。悬浮培养的第 2 d 细胞体积、鲜重和干重
均约增长 1倍。第 4 天各项指标增长约为 3. 6倍。
培养第 6 d之后,悬浮细胞体积和干重的增长趋势
不同, 悬浮细胞体积、鲜重和干重分别增长了 5. 8
倍、6倍和 4倍。第 8 d后增长趋势变缓, 悬浮细胞
体积、鲜重增长了约 6. 1倍, 干重增加了约 4. 1倍。
10 d后, 细胞体积、鲜重和细胞密实体积几乎没有
增长, 10 d后几乎停止生长。故苜蓿悬浮培养周期
以 6~ 8 d为一个继代周期为宜。
2. 2 悬浮细胞系生长的影响因素
2. 2. 1 不同培养密度对悬浮细胞生长的影响 悬
浮细胞的生长随着初始接种量的多少而出现明显差
图 1 苜蓿悬浮细胞系培养物生长曲线
F ig. 1 Growth cuve of suspended alfalfa
cell under suspension culture
异,同时初始接种量与悬浮细胞系的建立时间以及
悬浮细胞系的良好程度也有很大关系。初始接种量
为 1 mL 时,苜蓿花药悬浮细胞 PCV、鲜重以及干重
的增殖倍数最高, 增殖倍数均超过 4倍(图 2)。在
此培养过程中,悬浮培养物分散均匀,悬浮细胞液呈
淡黄色,内含物丰富。随着初始接种量的增加, 悬浮
细胞 PCV、鲜重、干重增殖呈下降趋势,悬浮培养液
也逐渐浑浊。初始接种量超过 1 mL 的情况下, 苜
蓿花药悬浮细胞鲜重、干重的增长都呈明显的下降,
但其 PCV的下降趋势较鲜重和干重相比有较大的
增长。这说明初始种量超过 1 mL 后, 细胞液泡化
程度加大,内含物减少。因此,苜蓿悬浮培养系的建
立以初始接种量( PCV) 1 mL/ 30 mL 为宜。
图 2 起始密度对悬浮细胞生长的影响
F ig. 2 Effect of initial density on suspended
cell gr ow th o f alfalfa
2. 2. 2 生长调节剂对悬浮细胞生长的影响 生长
调节剂在细胞悬浮培养过程中起着很大的作用。由
图 3可知,在苜蓿品种悬浮培养时,随着 2, 4-D浓度
的变化,悬浮细胞系生长表现出明显的变化:在 0. 3
~ 4. 0 mg # L- 1的范围内, 2, 4-D浓度为 0. 3 mg #
L - 1时细胞增殖的速度最快, 在 2, 4-D 浓度为 2. 0
361
草 地 学 报 第 18卷
mg # L- 1和 4. 0 mg # L - 1时细胞也出现明显的增长
变化,但变化程度不如浓度 0. 3 mg # L - 1时显著。
图 3 2. 4-D浓度对悬浮细胞生长的影响
Fig. 3 Effect of 2, 4-D on the suspended cell growth of alfalfa
注:图中数据为平均值;初始接种量为 0. 2 g #瓶- 1
Note: Data are the means; the inital inoculat ion dosage was 0. 2 g # f lask- 1
2. 2. 3 蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响 蔗糖质
量浓度对悬浮细胞系的影响: 悬浮培养中,蔗糖不仅
为细胞提供赖以生长的碳源, 同时也起着调节细胞
渗透压的作用。为确定最适蔗糖浓度, 采用不同蔗
糖浓度培养基进行苜蓿细胞悬浮培养。在 NB液体
培养基中,添加 1%、1. 5%、2%、2. 5%、3%和 3. 5%
的蔗糖为唯一碳源。以糖浓度( g / L )为横坐标, 以
同一时期悬浮细胞鲜重( g)为纵坐标,作糖的质量浓
度对苜蓿悬浮细胞生 长的影响曲线。
随着蔗糖浓度的不断增加,苜蓿悬浮细胞的生
长速度越来越快(图 4)。在蔗糖浓度为 1% ~ 2%
时,苜蓿悬浮细胞生长最为旺盛,细胞鲜重呈直线增
长,为快速生长期。在蔗糖浓度为 3%时,细胞鲜重
增殖最大,约为 6. 2 倍。浓度为 3% ~ 3. 5%时, 细
胞鲜重增殖缓慢,并出现较小的增殖下降情况。
苜蓿悬浮细胞对培养液中糖的消耗情况:
糖标准曲线回归方程为:
y= 114. 7x- 9. 023( R2= 0. 997)
在 NB液体培养基中, 添加 2. 5%的蔗糖为唯
一碳源。附加植物生长调节剂 2, 4-D 0. 3 mg/ L +
NAA 0. 2 mg/ L; 培养液灭菌前调 pH 5. 8;接种 2 g
# L - 1鲜质量细胞; 于摇床上 110~ 120 rpm, 24 ~
26 e ,白天/黑暗( 12 h/ 12 h)振荡培养。每 2 d取样
测定 1次,每个实验重复 3次,取平均值。结果如图
5所示: 苜蓿悬浮细胞在接种后前 2 d, 细胞生长较
为缓慢,只消耗少量的糖,接种后2~ 12 d,进入快速
生长期,细胞分裂加剧, 残糖浓度呈直线快速降低,
到生长末期,培养液中的糖几乎被消耗殆尽。
3 讨论
Mcdonald等 [ 21]通过对苜蓿悬浮培养的研究得
出苜蓿悬浮培养细胞在培养时间为 2~ 7 d时增长
最快。悬浮培养体系的建立过程中, 由于用于接种
的悬浮培养材料是由单细胞和细胞团所组成,因此
在悬浮培养过程中, 初始接种量的多少直接关系到
悬浮细胞的生长以及悬浮细胞系的建立。本试验
中,初始接种量为 2 g / 30 mL 时,苜蓿悬浮细胞的增
长趋势最为显著。在细胞密度太低时, 悬浮细胞生
长较慢,密度太大时,细胞初始生长速度太快,产生
群聚效应,培养液出现明显的棕红色,悬浮细胞液泡
化,细胞内含物质的积累减少,不利于悬浮细胞系的
建立,故只有在适宜的接种密度时,才能促进细胞的
生长,使得培养物分散均匀,形成结构紧实的细胞团
362
第 3期 姚喜红等:苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素
粒,建立稳定的悬浮细胞系。
Kao 等 [ 14]发现高浓度的 2, 4-D条件下, 3 种参
试苜蓿品种悬浮培养可形成胚性愈伤组织, 低浓度
时 2个苜蓿品种形成胚性愈伤组织。在苜蓿细胞悬
浮培养中,生长调节剂 2, 4-D的效果非常显著:在添
加浓度为 0. 3 mg / L /时生长速度最快, 增殖最为明
显, 2, 4-D浓度为 2 mg/ L 和 4 mg/ L 时也出现了较
为显著的强烈生长现象。谢华永等 [ 22]研究发现, 杨
树( Populus sp. )细胞悬浮系的建立过程中随着 2,
4-D浓度的提高,细胞增殖的速度加快,在 2. 0 mg/ L
时杨树细胞质最浓。本试验中悬浮细胞生长出现了
3个峰值,后 2个峰值较前一个低,这可能与以花药
为初始材料有关。花粉较植株组织切段对生长调节
剂浓度更为敏感,在细胞悬浮培养时 2, 4-D浓度对
细胞生长的影响较为显著, 这对豆科牧草花药悬浮
培养体系的合理建立具有一定的指导意义。
在悬浮培养中不同糖浓度的添加效果也不同。
糖是培养液中碳素和能量物质的来源, 同时对培养
基渗透压的调节也有重要作用[ 23]。在苜蓿悬浮培
养的培养基中糖的含量不宜过高。谢华永等 [ 22] 发
现蔗糖浓度为 3% ~ 5%时, 杨树细胞增殖倍数最
大;蔗糖浓度超过 7%,细胞增殖倍数呈明显下降趋
势。张晓东等[ 18] 通过对苜蓿悬浮培养的研究发现
蔗糖为 3% ~ 5%时,培养物生长较快。本试验中蔗
糖浓度为 2%~ 3%时,培养物增殖较大。浓度超过
3%后细胞增殖趋于平缓, 细胞经过快速生长期后,
细胞分生能力减弱,细胞内含物充足,处于干物质累
积阶段,为形成具有分裂能力的细胞团粒结构做准
备。原因可能为前者以四倍体的子叶和下胚轴为愈
伤组织诱导材料, 而以花药为初始材料, 多为单倍
体,杂有四倍体、多倍体细胞,且后者对生长环境更
加敏感。
悬浮培养过程中, pH 的变化也影响着悬浮细
胞系的稳定生长 [ 24]。本实验中培养基在灭菌前调
至 pH 5. 6~ 6. 1, 经 25 m in 高压灭菌后 pH 值下
降,当培养基中接入新鲜细胞后, 由于生理酸性盐
( NH4) 2SO 4的迅速吸收, 导致 pH 值下降; 此后随
着生理碱性盐 KNO 3 的利用, pH 值逐渐上升。同
时在悬浮培养细胞本身的微调功能调节下,使培养
液 pH 值趋于稳定。
图版ÑA.初期花药愈伤组织, B.中期花药愈伤组织, C. 悬浮花药愈伤组织(黄白色) ,
D. 悬浮培养愈伤组织, E. 悬浮培养过程培养液颜色, F. 悬浮花培植株
PlateÑ A. Anther callus at initial stag e; B. Anther callus at metaphase stage; C. Ant her ca llus in suspension
( y ellow ish-white) ; D. Suspension cult ur e callus; E. Co lo r of suspension culture liquid; F . Anther suspension cult ur e plant s
在整个苜蓿悬浮培养体系的建立过程中, 采用
固-液结合的培养方式(图版 A~ F)。本试验从大量
的苜蓿花药培养中筛选出了淡黄色或乳白色的愈伤
组织系,并通过这些愈伤组织获得了苜蓿悬浮细胞
系。实验结果表明, 这些细胞系在继代培养中保持
着旺盛的生长能力,并由于其分散性好,生长速度较
快的原因,能很快获得具有强分生能力的细胞团粒
结构(图版 D) , 以此可获得生长性能较强的再生植
363
草 地 学 报 第 18卷
株(图版 F)。这可为苜蓿悬浮细胞的大量培养及大
规模品种选育提供一定的理论依据。
4 结论
4. 1 苜蓿悬浮培养体系的建立过程中,基本液体培
养基为 NB( N 6 大量+ B5 有机+ B5 微量)组合培养
基,培养液最佳组合为 NB( N 6 大量+ B5 有机+ B5
微量) + 2, 4-D 0. 3 mg/ L+ N AA 0. 3 mg/ L, 蔗糖
2%。苜蓿悬浮细胞系的建立过程中,应选取淡黄色
或乳白色,结构疏松颗粒状胚性愈伤组织为悬浮培
养的基础材料。悬浮细胞系继代周期为 6~ 8 d。
4. 2 苜蓿细胞悬浮培养时初始接种量为 2 g/ 30
mL 时悬浮细胞 PCV、鲜重以及干重的增殖倍数最
高,增殖倍数均超过 4倍。
4. 3 不同浓度 2, 4-D处理结果表明, 2, 4-D对苜蓿
细胞悬浮培养体系的作用为促进悬浮细胞系中细胞
的快速生长。2, 4-D浓度不同,促进作用也呈现明
显的差异。本研究得出苜蓿花药悬浮培养体系中
2, 4-D浓度以 0. 3 mg / L 为宜。
4. 4 在苜蓿花药悬浮培养的培养基中糖的含量不
宜过高。本研究发现在苜蓿细胞悬浮培养中, 蔗糖
浓度为 2%~ 3%时效果最好。
参考文献
[ 1] 魏臻武, 符昕, 耿小丽, 等. 苜蓿遗传多样性和亲缘关系的
SSR和 ISSR分析[ J] . 草地学报, 2007, 15( 2) : 118-123
[ 2] 雷艳芳, 魏臻武, 杨占花, 等. 蒺藜苜蓿种子产量相关性状的
遗传分析[ J] .草地学报, 2009, 17( 3) : 125-128
[ 3] Guha S , Maheshw ari S C. I n vi t ro product ion of em bryos
f rom an th ers of Datura[ J] . Nature, 1964, 204: 497
[ 4] 中国科学院上海植物生理研究所细胞室.植物组织与细胞培养
[ M ] .上海:上海科学技术出版社, 1978: 171
[ 5] M uir W H, H ildeb randt A C, Riker A J. Th e preparation, -i
s olat ion and g row th in culture of single cells f rom high er
plants . Botanical S ociety of America, 1958, 45( 8) : 589-597
[ 6] S tew ard F C, Marion O M, Smith J. Gr ow th and organiz ed
developm ent of cultur e cells. I . growth and divis ion of f reely
suspended cells . Botanical S ociety of Am erica, 1958, 45 ( 9) :
693-703
[ 7] 刘庆昌,米凯霞,鲁迪慧,等.甘薯胚性细胞系悬浮培养的建立
[ J ] .作物学报, 1997, 23( 1) : 22-26
[ 8] 祁新,王权,顾德峰,等.马铃薯悬浮细胞培养[ J] . 吉林农业大
学学报, 1996, 18( 1) 21- 24
[ 9] 陈志贤,李淑敏, T rolinder L.等.棉花细胞悬浮培养胚胎发生
和植株再生某些特性的研究 [ J ] .中国农学科学, 1987, 20( 5 ) :
6- 11
[ 10] 陈克贵,张义正.甘薯细胞悬浮培养的建立及其生长研究 [ J ] .
应用与环境生物学报, 1999, 5( 3) : 275-278
[ 11] 孟新亚,邵玉春,刘冬霞,等. 大蒜胚性悬浮细胞系的建立 [ J ] .
河南农业科学, 2002, 6: 25-27
[ 12] 胡张华,陈火庆,吴关庭,等.高羊茅悬浮细胞系的建立及绿色
植株的高频再生[ J] .草业学报. 2003, 6: 95-99
[ 13] Bingham E T , H urley L V, Kaatz D M, et al . Breeding alfalfa
w hich regen erates f rom callus t issue in culture. Crop Science,
1975, 15: 719-721
[ 14] Kao K N, Michayluk M R. Embryoid form at ion in alfalfa cell
suspen sion cultures f rom different plants [ J ] . T issu e Culture
Associat ion, 1981, 7: 645-648
[ 15] T amas K, Roberts on A J, Waterborg J H. H istone H 3 t ran-
script stabilit y in alfal fa [ J ] . Plant M olecu lar Biology, 1995,
28: 901-914
[ 16] Jiang Y, Miles P W . Phen ol ic acids in f ilt rates of Lucer ne su s-
pension cell cultur es t reated w ith saliva of the spot ted alfalfa a-
phid, Th erioap hi s t ri f ol i i macu lata [ J ] . Entomologia Expe-
runentali s et Applicata, 1996, 80: 551-553
[ 17] Qamar S F A, Sors T G, Cunnin gham S M, et al . Phosph ate
nut rit ion ef fect s on grow th, ph osphate t ransp orter t ranscript
levels and physiology of alfal fa cell s[ J] . Plant Cell, Tis sue an d
Organ Cul tu re , 2005, 82: 131- 140
[ 18] 张晓东,林延安.苜蓿细胞悬浮培养与耐受高浓度 PEG 变异体
的筛选[ J] .核农学报, 1994, 8( 1) : 7-13.
[ 19] 杨占花,魏臻武,张丽芳. 两类 SSR 对苜蓿属种质遗传多样性
和亲缘关系的比较研究[ J] .草地学报, 2008, 16( 5) : 432-438.
[ 20] 耿小丽, 魏臻武, 程鹏舞,等. 苜蓿花药培养与倍性鉴定 [ J ] .
草原与草坪, 2008, 130 ( 5) : 1- 5
[ 21] McDonald K, Alan J. Bior eactor studies of grow th and nu tr-i
ent u til izat ion in alfalfa su spen sion cu ltures . Plant C ell Re-
port s, 1989, 8: 455-458
[ 22] 谢华永,诸葛强.杨树胚性悬浮细胞系建立与原生质体融合研
究[ D] : [学位论文] .南京:南京农业大学, 2004, 1-48
[ 23] Gam borg O L, Shyluk J P. Nu tri tion medium and characteris-
t ics of plant cel l and t issu e cu ltures. In: T horpe T A, et al .
Plan t t iss ue cultur e: M ethods and Applicat ion in Agriculture
[ M ] . New York : Academic press, 1981, 21- 42.
[ 24] 崔红,陈亮,沈明山,等.甘薯胚性悬浮系的建立及其细胞生长
特性研究[ J] .厦门大学学报, 2002, 41( 5) : 55-58
(责任编辑 米 佳)
364