全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 02-0124-05
苜蓿青贮接种菌系 Li6、Al2、Ru2的筛选及其发酵特性
王小芬,崔宗均* ,胡跃高,陈晓燕,高丽娟,张　涛
(中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100094)
摘要: 以 pH 值的降低迅速、稳定, L ( + )乳酸积累量多为指标, 通过连续的限制性培养, 从发酵饲料、青贮苜蓿及乳酸菌制剂
中分别筛选出L i6、Al2 和Ru2三组菌系, 以期作为苜蓿青贮用菌剂。该三组菌系均 pH 下降迅速,发出香甜气味,在玉米粉培
养基、苜蓿汁培养基、MRS 培养基中将 pH 稳定到3. 8～4. 0 之间,所需时间分别为 10 h、16 h 和 20 h。气质联机分析结果表
明,发酵液中含有较高的乙酸、乳酸,还有少量甲酸、丙酸等挥发性脂肪酸及丁二醇、乙酸乙酯、异丁醛、乙醛和乙酰胺等风味物
质;在代谢产物中乙酸和乳酸占总代谢物的98%以上, 其中 L ( + )乳酸的比率高达 60%～70%。
关键词: 草原学;苜蓿; 青贮;菌系; 筛选;发酵特性
中图分类号: Q815; S816. 53　　　　文献标识码: A
Selection of Inoculants of Li6、Al2、Ru2 for Alfalfa
Silage and Analysis of Their Fermented Characteristics
WANG Xiao-fen, CU I Zong-jun
* , HU Yao-gao , CHEN Xiao-yan, GAO Li-juan, ZHANG T ao
( Co llege o f Agronom y and Bio techno lo gy , China Ag ricultural Univ ersity , Beijing 100094, China )
Abstract: Aiming at a silag e inoculant that could quickly debase and stabilize the pH value o f fresh grass, and
add to it mo re L ( + ) lact ic acid, a cont inuous rest ricted cul tivat ion of the material w as carr ied on unt il thr ee
gr oupso f microbial community-Li6, A12-, Ru2-have been selected f rom fermented forag e, a lfalfa silag e and a
lact ic bacteria agent . The three g roups of m icrobial community alignith the target : debasing the pH value
quickly and inducing the silage to emit a sugary fr ag rance. Uultured in co rn medium , alfalfa medium, and
MRS, the three g roups of m icrobial community cause the mediumspH value to debase to 3. 8～4. 0 w ithin 10
hour s, 16 hours, and 20 hours respect ively. Through GC-M S analy sis, larg e amount of metabolic products
such as lact ic acid and acet ic acid, and some formic acid and propionic acid are obtained. Other mater ials like
butanedio l, ethyl acetate, acetaldehyde, glycerol are also produced. Among the metabolic products, lact ic acid
and acet ic acid take 98% of the total, in w hich 60%～70% is L ( + ) lact ic acid.
Key words : Grassland science; Alfalfa; Silag e; M icrobial community ; Select ion; Ferment ing characterist ic
　　在华北和东北等主产区,由于雨热同期,在苜蓿收
获时因雨淋损失很高。进行苜蓿青贮则是解决此类问
题较为理想的措施,不仅可减少养分损失, 而且保持青
绿饲料的营养成分, 适口性好,消化率高, 且便于长期
保存[ 1]。但苜蓿蛋白质含量高、可溶性碳水化合物和干
物质含量低, 是难于青贮的饲料[ 2]。在青贮料中添加菌
剂可以明显改善青贮品质, 特别是青贮苜蓿,青贮接种
剂的作用最明显[ 3、4] , 可将乳酸产量提高到 80%～
90%
[ 5]。康玉凡等报道,在苜蓿草中添加乳酸菌可降低
霉变率,青贮料品质优等[ 5 ]。Weinberg 等( 1996)认为
青贮菌剂优于化学添加剂(如添加氨水、甲酸、丙酸
等) ,因其为无污染、使用方便、对农用机械无腐蚀的天
然产品[ 6]。我国青贮接种剂的研究刚刚起步,只有少量
的商品上市, 多为进口发酵剂,其价格昂贵,而且对国
内苜蓿生产与环境的适应性及效果还有待证实。因此,
开发适合我国苜蓿青贮条件、成本低、具有自主产权的
菌剂,研究其发酵特性,具有重要的意义。
　　收稿日期: 2003-03-27;修回日期: 2004-04-02
　　基金项目:农业部跨越计划项目“青刈黑麦、苜蓿产业化生产技术集成试验示范”( 2000-24)
　　作者简介:王小芬( 1976-) ,女,博士研究生,主要从事微生物群体功能及有机物资源再利用研究; * 通讯作者 Author for correspon dence
第 12卷　第 2期 草　地　学　报 2004年　6 月
Vo l. 12　　No. 2 ACT A AGRESTIA SIN ICA June　　　　　2004
1　材料与方法
1. 1　筛选培养基与培养条件
1. 1. 1　MRS培养基( 1000 ml)　蛋白胨 10 g, 牛肉膏
10 g ,酵母提取物 5 g, 磷酸氢二钾 2 g, 柠檬酸二铵 2
g ,乙酸钠 5 g, 葡萄糖 20 g ,吐温 80 1 ml ,七水硫酸镁
0. 58 g , 四水硫酸锰 0. 25 g , pH 调至 6. 2～6. 4, 在
115℃灭菌 20 min。
1. 1. 2　玉米面培养基　玉米面 100 g ,氯化钠 0. 5 g ,
水 900 m l,在 121℃灭菌 15 min。
1. 1. 3　苜蓿汁培养基　将新鲜苜蓿用机器粉碎后, 加
水至 2倍,加 0. 5%氯化钠,在 90℃灭菌 20 min。未能
及时使用时在- 20℃冰冻保存。
1. 1. 4　培养条件　深层液体培养。培养基达到培养容
器容积的 90%时,封口, 30℃静止培养。
1. 2　菌种来源
中国农业大学产业处提供的乳酸菌制剂; 日本
life center 公司的发酵饲料;苜蓿青贮发酵物。
1. 3　筛选方法
取供试材料分别1 g 接种于9 ml上述3种培养基
中,重复 10次,在 30℃下静止培养。每 4 h监测pH 变
化。淘汰 pH 下降缓慢的培养物,将 pH 下降迅速的培
养物,继续厌氧培养使其达到极低的 pH ( 4. 0以下) ,
并且固定一种培养基连续继代限制性培养,一直筛选
到 pH 下降基本稳定的培养物。最终用气相色谱法测
定乙酸和乳酸积累量, 筛选到 pH 下降迅速, 乳酸积累
量相对多且耐酸性稳定的菌群。
1. 4　pH 的测定
在培养过程中,用灭菌的移液器吸取 0. 2 ml培养
液滴入 HORIBA微量 pH 计上测定。
1. 5　发酵产物的测定
1. 5. 1　测定仪器　日本岛津公司 QP-5050 型 GC-
M S(气质联用机)。
1. 5. 2　测定条件　分析柱: po ra PLOT Q 型毛细管
柱( 25 m×0. 32 mm) ; 柱箱温度: 80℃保持 1 min, 以
20℃/ min 速度升至 240℃, 保持 11 min,共 21 m in; 汽
化温度: 240℃;监测器温度: 240℃; 监测器电压: 1. 5
kV; 载气: 氦气( 50 kPa ) ; 流量: 50 ml/ m in; 进样器:
Split 1/ 13。
1. 6　测定方法　培养物经过 0. 22
L 微孔过滤器后,
取 10
L 进样。对测定的数据, 利用 NIST 数据库进行
定性分析。根据出峰物的定性分析结果,配置相应标准
样品的稀释液作为标准物进样,用于该物质的定量分析。
2　结果与分析
2. 1　筛选过程
在筛选初期 pH 变化极不稳定, 大部分培养物被
淘汰(图 1-A ) ,随着连续的限制性培养, 留下的培养物
pH 逐步趋于稳定(图 1-B) ,最终以 pH 值的降低迅速、
稳定, L ( + )乳酸积累量多为指标, 从发酵饲料、青贮
苜蓿及乳酸菌制剂中分别筛选出 3 组菌系, 标号为
Li6、Al2、Ru2。
图 1　第 4 代菌系( A )和第 10代菌系( B)
在 MRS 培养基上的 pH 值变化
Fig. 1　Changes of pH value of the F 4( A ) and
F 10( B) M icr obial
2. 2　Li6、Al2、Ru2在不同培养基上的 pH下降特性
2. 2. 1　在 MRS 培养基、苜蓿汁培养基、和玉米粉培
养基中分别培养 Li6、Al2、Ru2三组菌系,其 pH 都迅
速下降,在同种培养基中差异不大, 总体趋势为 Ru2
落后于其他两组菌系(图 2-A、B、C)。但不同培养基间
pH 下降情况有所差异。曲线下降趋势不同,玉米粉培
养基直线下降; MRS 培养基下降较平稳;苜蓿汁培养
基,在培养初期有迟滞期, 4 h后较迅速下降。
2. 2. 2　pH 趋于基本稳定所需的时间, 以玉米粉培养
基中最快,接种后 8 h 降到 3. 9, 此后基本稳定; 其次是
在苜蓿汁培养基中, 16 h到 3. 8而稳定;在 MRS 培养
基中稳定较慢,需 18～20 h。
125第 2期 王小芬等:苜蓿青贮接种菌系 Li6、Al2、Ru2的筛选及其发酵特性
2. 2. 3　在自然条件下苜蓿青贮 pH 下降缓慢且很难
降到 5. 0以下,而本试验筛选的三组菌只需 16 h 均能
将较稀的苜蓿汁的pH降至3. 8。故其对迅速降低苜蓿
青贮的 pH 意义非常重大。
图 2　各菌系在 MRS ( A )、苜蓿汁( B)和
玉米粉( C)培养基上 pH 值的变化
F ig . 2　Changes o f pH value o f Each M icrobial Community
in M RS( A )、Alfa lfa( B)、Corn( C)
2. 3　三组菌系在不同培养基上发酵产物的定性及定
量分析
2. 3. 1　发酵产物定性分析
以 Li6菌系在 MRS 培养基上 2 h 和 16 h 的发酵
产物为例进行分析。在本实验条件下测定到 10余个
峰。NIST 数据库检索分析结果表明 ,这些峰分别为:
1-空气、2-乙醛、3-甲酸、4-乙酸、5-丁二醇、6-乙酸乙
酯、7-丙酸、8-异丁醛、9-乙酰胺、10-L ( + )乳酸、11-甘
油 12-乙醇、13-异丙醛。其中 4号峰和 10号峰变化最
大。发酵产物中丁二醇、乙酸乙酯、乙酰胺、异丁醛、乙
醛、甘油等风味物质,这些风味物质对增加适口性有重
要的意义[ 7]。培养16 h后(图3-B)大部分产物与2 h 的
相同, 也有不同的物质产生: 12-酒精和 13-异丙醛。发酵
16 h的 L ( + )乳酸的峰显著大于发酵初期;而乙酸的峰
与初期相比有所降低。发酵液中未检测到影响青贮质量
的丁酸、异丁酸、异戊酸、乙醇胺和色胺等物质[ 8]。
2. 3. 2　发酵产物的定量分析
2. 3. 2. 1　三组菌系乙酸积累量的变化
三组菌系无论在哪一种供试培养基上,培养初期
均产生较多的乙酸,随着培养时间的延长逐渐增加, 只
有少部分培养物有所减少, 变化不大(表 1)。
在 MRS 培养基上, L i6和 Al2菌系一开始积累乙
酸量就很高,第 38 h的测定量最小; 而 Ru2 菌系第 1
次的测定值最小, 以后的乙酸积累量均较高。三组菌系
的乙酸积累量比较接近,一般在 8. 9～14. 2 g / L。在苜
蓿汁培养基上三组菌系的乙酸积累量的趋势与 MRS
培养基上相似, 而积累量比前者小得多, 大部分在 3. 1
～6. 8 g / L 范围内。在玉米培养基,与在苜蓿汁培养基
上类似,前后变化不大。各菌系乙酸积累量在 3. 7～
7. 0 g / L 之间。
图 3　L i6菌系在 MRS 培养基上 2 h( A )和 16 h( B)
发酵产物分析图谱
Fig. 3　Maps r epr esent ing L i6s Ferment ed Bro th in 2 h( A )
注: 1-空气、2-乙醛、3-甲酸、4-乙酸、5-丁二醇、6-乙酸乙酯、7-丙酸、8-异
丁醛、9-乙酰胺、10-L( + )乳酸、11-甘油 12-乙醇、13-异丙醛
Note: 1-atmosph ere; 2-Acetaldehyde; 3-Fomic Acid; 4-Acet ic Acid; 5-
Butan ediol; 6-Eethyl Acetate; 7-Propionate; 8-Isob utanaldehyde; 9-Ac-
etamide; 10-Lact ic Acid ; 11-Glycerol; 12-Ethanol ; 13-Isopropi-
onaldeh yd e
2. 3. 2. 2　三组菌系乳酸积累量的变化
由表 1可见, 三组菌系在 MRS 培养基和苜蓿汁
培养基上, 随着培养时间的推移, 乳酸积累量逐渐增
加,到 24 h 达到最大值,此后有所下降。但在玉米粉培
养基上, 前 8 h 乳酸积累量变化不大, 而后逐渐下降,
以 Ru2菌系的乳酸积累量最少。除乙酸和乳酸之外,
其他物质积累极少,最多时不超过2%。值得注意的是
在玉米粉培养基上 pH下降非常迅速(图 2-C) , 而从占
有机酸量绝大多数的乙酸和乳酸积累量之和并不表现
随着时间的推移而显著增加,对此有待于进一步研究。
2. 3. 2. 3　三组菌系在不同培养基上的乳酸比率(乳酸
在总酸中的比率)
如图 4 所示: 在 MRS 培养基上接种后 2 h, 乳酸
比率均较低, L i6 和 Al2 菌系约为 20% , Ru2 约为
35%,乙酸远多于乳酸。随着培养,乳酸比率逐步增加,
到 24 h时三组菌的乳酸比率均达到 60%左右。而后,
L i6菌系的乳酸比率继续增加, 到 38 h 达到 76% , 而
其他两组不再增加。在苜蓿汁培养基中 Li6菌系的乳
126 草　地　学　报 第 12卷
酸比率从较低值迅速增加, 到 8h 超过 70%, 而后逐步
下降,到 38 h维持在 62%左右; Al2菌系在前 16 h 平
稳增加, 之后一直保持 60%左右; Ru2 菌系始终在
60%上下,变化不大。在玉米培养基中,培养2h 时三组
菌系的乳酸均已占优势, 比率在 50%～60%, 然后除
Li6菌系在 12 h 升高到 65% ,其后均逐渐下降。其中
Ru2的下降幅度最大, 38 h 降到 14%。
三组菌系之间比较, Li6 和 Al2菌系的乳酸比率
较 Ru2菌系高, 尤其在天然培养基上差异更大, 说明
Li6和 Al2菌系有较好的应用前景。
表 1　三组菌系在各培养基上的乙酸及乳酸积累量
Table 1　Accumulation of acetica acid and lactic acid o f three g roups of microbial community in differ ent substr ates
培养基
Subs t rate
菌种
Microbial comm unity
产物
Pr odu ct
积累量( g/ L)
Production value(g / L)
2 h 8 h 16 h 24 h 38 h
Al2 乙酸( Acet ic acid) 12. 347 12. 448 8. 971 12. 344 4. 943
乳酸( Lact ic acid) 3. 203 11. 726 14. 931 18. 182 16. 495
MRS Li6 乙酸( Acet ic acid) 14. 252 12. 880 13. 123 12. 011 12. 123
乳酸( Lact ic acid) 3. 127 11. 196 13. 154 17. 085 17. 639
Ru2 乙酸( Acet ic acid) 9. 370 13. 168 12. 285 11. 496 12. 857
乳酸( Lact ic acid) 5. 257 13. 222 15. 509 17. 526 17. 142
Al2 乙酸( Acet ic acid) 4. 499 6. 022 4. 190 6. 596 6. 121
乳酸( Lact ic acid) 3. 596 7. 916 6. 281 9. 415 9. 310
苜蓿汁 Alfalfa Li6 乙酸( Acet ic acid) 5. 179 3. 142 3. 512 5. 753 5. 493
乳酸( Lact ic acid) 3. 421 7. 783 8. 086 9. 807 9. 079
Ru2 乙酸( Acet ic acid) 1. 938 6. 886 6. 559 6. 767 6. 445
乳酸( Lact ic acid) 2. 962 8. 394 10. 135 10. 568 9. 302
Al2 乙酸( Acet ic acid) 4. 305 5. 323 5. 958 6. 199 5. 336
乳酸( Lact ic acid) 6. 593 6. 064 3. 207 4. 904 2. 143
玉米粉C or n Li6 乙酸( Acet ic acid) 4. 751 3. 756 6. 202 5. 552 5. 391
乳酸( Lact ic acid) 5. 402 6. 979 4. 687 3. 838 3. 586
Ru2 乙酸( Acet ic acid) 4. 055 7. 028 5. 330 4. 709 4. 936
乳酸( Lact ic acid) 5. 290 4. 963 1. 449 0. 997 0. 825
图 4　各菌系在 MRS( A )、苜蓿汁( B)、玉米粉( C)
培养基上乳酸比率的变化
Fig . 4　Changes o f Content of Lactic Acid of Each
M icrobial Community in M RS( A )、Alfalfa ( B)、Co rn( C)
3　讨论
3. 1　在长期的实验和生产实践中,人们发现很多生物
过程必须依靠两种或两种以上的微生物来共同完成。
随着纯培养技术的完善和对微生物间互生和共生现象
的研究, 人为的、自觉的微生物混合培养( M ix ed Cul-
cure ) 或混合发酵 ( M ix ed Fermentat ion) 已渐受重
视[ 9]。青贮菌剂多为混和菌, 如由匈牙利研制的
Silag erm 是由三种乳酸菌混合培养制成;加拿大研制
的 Silo gen是由乳酸杆菌( L actobaci llus)、嗜酸乳杆菌
( L . A cidop hilus)和米曲霉( A sp ergillus ory z ac)培养物
的干燥混和制剂[ 10]。
3. 2　Whit tenbury 早在 1961年就定义了青贮接种剂
应该满足的条件: ( 1)在青贮料中生长速度快; ( 2)同质
型发酵在最短时间内产生最大量的乳酸; ( 3)耐酸性
强; ( 4)在高干物质含量的青贮料中能够生长; ( 5)可以
加热至 50℃不失活[ 11]。植物乳杆菌 ( L actobacillus
p lantarum)是经常能够在青贮料中分离到、且符合上
述标准的单株菌,但有实验证实其作为青贮接种剂的
结果并不理想 [ 12]。在其他领域, 如在纤维素分解中, 由
127第 2期 王小芬等:苜蓿青贮接种菌系 Li6、Al2、Ru2的筛选及其发酵特性
崔宗均等通过混合培养筛选的一组由七种菌构成的稳
定的复合菌系 MC1可将滤纸在 24 h 内崩解[ 13]。本试
验筛选的复合菌系,性能稳定, 能使发酵液的 pH 值迅
速降低至 3. 8, 在苜蓿汁中乳酸含量均达到 60%～
70%,表现出复合菌的优越性,有望作为苜蓿青贮菌剂
继续研究。
3. 3　在青贮发酵过程中, pH 值的下降速度和乳酸含
量是决定青贮质量的决定因素[ 8]。研究表明,青贮窖中
pH 值的下降速度越快, 其营养的损失就越少, 由于
pH 值迅速下降,抑制了其他微生物(如梭菌)的繁殖,
从而减少了蛋白质的分解, 减少氨态氮与总氮的比
值[ 6]。L ( + )乳酸含量是衡量青贮饲料质量的重要指
标之一,发酵过程中, L ( + )乳酸含量增加, 乙酸含量
降低是优质青贮饲料的特征 [ 14]。本实验筛选的复合菌
系,性能稳定, 在连续的继代过程中, 每代均能在 20h
内将 pH 值降低到 3. 8以下, 并且产生大量的 L ( + )
乳酸。D ( - )乳酸不易被家畜利用, 由于多给精饲料,
D ( - )乳酸在瘤胃或血液中异常蓄积,致使泌乳牛频
发乳酸中毒症。而多给高含量D ( - )乳酸的青贮饲料,
也可引发此症 [ 15]。发酵液中并未检出 D ( - )乳酸, 可
能是因为实验中所用的 pora PLOT Q 型毛细管柱未
能把L ( + )乳和 D ( - )乳酸明显分开,对此有待于(用
手性柱子)进一步研究。
综上所述,筛选到的三组菌均能使培养基在 20 h
内 pH 值迅速下降到 3. 8以下,并且在 24 h 乳酸生成
量达到最大值, 均产生提高饲料营养价值的 L ( + )乳
酸。这些菌系的菌种组成和各自的作用有待进一步研
究。
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128 草　地　学　报 第 12卷