全 文 ：第 18 卷
第 5 期

Vol. 18
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2010 年
9 月

Sep.

2010
苜蓿花药培养再生植株染色体倍性检测研究
耿小丽1 , 魏臻武2 , 姚喜红2, 赵
艳2
( 1. 甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州
730070; 2. 扬州大学动物科学与技术学院, 江苏 扬州
225009)
摘要 : 本试验采用流式细胞仪对苜蓿( Med icago sativa L. ) F 1 代杂种花药培养再生植株进行染色体倍性检测。旨
在建立高效的苜蓿花药培养体系,提高苜蓿单倍体的诱导效率, 寻求一种快速简便的苜蓿倍性检测方法。检测结
果为流式细胞仪矩形图上清晰地检测出二倍体、三倍体、四倍体以及二倍体加四倍体的嵌合体。50 株苜蓿花药再
生植株中有 42 株四倍体( 2n= 4x ) , 2n= 4x 与 2n= 2x 的混合体为 5 株, 二倍体( 2n= 2x)为 2 株,三倍体( 2n= 3x )为
1 株。本文还讨论了苜蓿花药培养体系的建立, 优化, 以及筛选出了适宜制作苜蓿细胞悬浮液的缓冲液 ( 15 mmol

L- 1 T ris-H Cl( pH7. 5) ; 80 mmo l
L - 1 KCl; 20 mmo l
L - 1 NaCl; 2 mmol
L - 1 EDT A-Na2 ; 15 mmol
L - 1
-
Mercapt oethano l; 0. 1% ( V/ V ) T r itonX-100; 0. 5 mmol
L- 1 Spermine
4H Cl)及其流式细胞仪检测苜蓿倍性的适
应性程序。
关键词:苜蓿花药培养; 再生植株;倍性检测; 流式细胞仪
中图分类号: S541. 9; S335. 1



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2010) 05-0714-05
Anther Culture of Medicago sativa L. and Ploidy detection.
GENG Xiao- li1 , WEI Zhen-wu2 , YA O X-i hong2 , ZHA O Yan2
( 1. College of Gras sland S cien ce, Gansu Agricu ltural U nivers ity, Lanzhou, Gan su Pr ovince 730070, Ch ina;
2. College of Animal Science & Techniqu e, Yangzh ou U nivers ity, Yan gzhou, Jiangsu Province 225009, Chin a)
Abstract: Ploidy levels o f F 1 hybrid plants, der iv ed from anther culture in M edicag o sativa L. , were deter-
m ined by f low- cytometric analy sis. Purpose of the study w as to seek a fast and r eliable method for DNA
plo idy detection to establish an ef fect iv e system of anther culture w hile improving haploid induct ion in
Med icago sativa L. Ther e w ere 42 tet raplo ids( 2n= 4x= 32) , 5 mixoploids of diploid and tet raplo id ( 2n=
4x + 2n= 2x ) , 2 diploids, 1 t riplo id in 50 regenerat ion plants o f anther culture. The opt imizat ion of both
cell suspension buffer and anther cultur e sy stem in M edicag o sat iv a L. w as also discussed in the paper.
Key words: M edicago sat iv a L. ; Anther culture; Plo idy detect ion; F low cytometry


紫花苜蓿( Med icago sativa L . )是多年生异花
授粉豆科( Legumino sae)牧草。自然状态下绝大多
数紫花苜蓿为同源四倍体( 2n= 4x= 32) , 少部分为
四倍体的变异体 [ 1]。苜蓿二倍体在植物细胞学、作
物遗传及育种上有重要作用。通过花药培养单倍体
育种技术可以使杂合体快速稳定,缩短育种年限 [ 2]。
自上世纪 60年代以来, 花药培养在烟草( N icotiana
tabacum L. )、水稻( Or y z a sativa L. )、马铃薯( So-
lanum tuberosum L. )以及十字花科的多个物种中
成功获得了单倍体植株, 但其在豆科中的研究较
少[ 3]。1980年, Xu [ 4]利用花药培养获得了紫花苜蓿
二倍体植株。1995年 Nedialka 和 Bojan 利用经低
温和射线等预处理的紫花苜蓿花药,经培养获得了
二倍体植株 [ 5]。这些研究开辟了紫花苜蓿二倍体获
得的新途径。但花药培养受花药壁等体细胞组织以
及愈伤组织的遗传变异的影响, 使花药培养的后代
为染色体倍性水平不同的混合体 [ 6] ,因此,对再生植
株倍性的检测就显得尤为重要。目前, 在苜蓿倍性
鉴定上主要使用的鉴定手段有根尖染色体记数方
法[ 7 ]、气孔和花器形态鉴定法 [ 8]、遗传标记法[ 9] 等。
本试验在苜蓿花培植株幼苗期应用流式细胞仪并结
合再生植株形态, 进行再生植株倍性鉴定。
1
材料与方法
1. 1
苜蓿花药培养与植株再生
1. 1. 1
供试材料
供试材料是自选系大叶 0510单
收稿日期: 2010-03-11;修回日期: 2010- 09-21
基金项目:国家
863
计划项目( 2008AA10Z149) ;国家自然科学基金项目( 30972136)资助
作者简介:耿小丽( 1979- ) ,女,甘肃兰州人,博士,主要从事牧草遗传育种学研究, E-m ail: gx l-i 1979@ 163. com , * 通讯作者Author for cor-
respondence, E-m ail: zh enw u_w ei@ yahoo. com. cn
第 5期 耿小丽等:苜蓿花药培养再生植株染色体倍性检测研究
株与自选系多叶 0501单株杂交的 F 1 代。F1 代于
2008年 10月种植于甘肃农业大学试验室, 2009 年
4月初开花, 5月开始采集花粉。
1. 1. 2
苜蓿花药培养与植株再生
采集花药发育
处于单核中、晚期的花蕾﹙使用醋酸洋红染色压片
观察,确定花药发育时期﹚。将花蕾放置在 4
的
冰箱内低温处理 12~ 24 h,消毒后在无菌条件下剥
出花药,接种于表 1培养基中。
表 1
苜蓿花药培养各步骤培养基的设计
T able 1
Medium of anther culture in Medicago sativ a
编号
No.
基本培基
Cul tu re medium
琼脂浓度
Agar conten t, g
L- 1
蔗糖浓度
Sucros e content , g
L- 1
激素浓度 Ph ytoh ormone content , mg
L- 1
2. 4-D NAA 6-BA KT
M1 NB 7 90 1. 0 0. 5 0. 5 2. 0
M2 M S 7 30 0. 5 3. 0
M3 1/ 2MS 6 10 0. 5


注: M 1为愈伤组织诱导培养基; M2为分化培养基; M3生根培养基
Note: M1 callus induct ion medium; M2 em bryo dif ferent iat ion medium; M3 plant con version medium
1. 2
流式细胞仪鉴定花培再生植株的倍性
1. 2. 1
设备与分析软件
采用美国 BD 公司的
FACSCalibur流式细胞仪( F low cytometric)进行倍
性检测,用 Cell Quest 软件获取数据, M odFit 软件
( Yer ity Sof tw are House 公司)分析结果。
1. 2. 2
测定程序
 将 3周龄的苜蓿花药再生植
株的叶片放在培养皿中,并将培养皿放在冰袋上,用
锋利的剃须刀片与叶片呈 90
的方向垂直下落, 将
叶片进行机械破碎, 破碎过程中放入 700~ 800
L
的缓冲液(
,
,
,
) , 并在其中处理 10 m in。
表 2
苜蓿细胞悬浮液制作所用缓冲液
Table 2
Buffer of nucleus suspensions in Med icago sativa
名称 Nam e 组成 C om posit ion, mmol
L- 1

Galbraith s b uffer 45 M gCl2; 30 Sodium cit rate; 20 MOPS; 0. 1 % ( V/ V) TritonX-100; pH 7. 0

Lysis bu ffer 15 Tris-H Cl( pH 7. 5) ; 80 KCl; 20 NaCl; 2 EDT A-Na2; 15
- Mer captoethan ol ;
0. 1% ( V/ V) TritonX- 100; 0. 5 Spermine
4H Cl

Agathans buf fer 9. 53 MgSO 4 . 7H2O; 47. 67 KCl ; 4. 77 H EPE S; 6. 48 DT T; 0. 25 % ( V/ V) T ritonX-100 ; pH 8. 0

T ris- MgCl2 buf fer 200 Tris-H Cl; 4 MgCl 2
6H 2O ; 0. 5 % ( V/ V) T ritonX-100 ; pH 7. 5


 将以上混合物用 300目尼龙网过滤, 滤液大
约含 1
105 ~ 2
105 个细胞, 将滤液离心( 2000 r

min- 1 , 5 min)。

离心后弃去上层清液, 取沉淀加缓冲液(
,

,
,
) ( 700~ 800
L)打散后用 300目尼龙网过滤。

再取滤液离心( 2000 r
min- 1 , 5 m in)。

离心后弃去上层清液, 沉淀加 50 mg
L - 1的
RNA 酶 A 溶液 1 mL 处理 10 min。

处理后离心, 弃去上层清液, 沉淀加 50 mg

L
- 1的 PI溶液 1 mL 染色 5 min。

上机检测,DNA含量分布图由仪器自动生成。
1. 2. 3
流式细胞仪的设定及软件分析
用已知的
四倍体( 2n= 4x= 32)苜蓿自选系大叶 0510单株的
叶片为对照。测定时先调整分析仪的放大倍数, 使
对照的 DNA 峰值处在 200附近。峰值处在 100 线
的被测样本即为二倍体,处在 150, 300 线的分别为
三倍体和六倍体, 其余的为嵌合体。嵌合体又根据
峰值位置确定其构成细胞的倍性。PI 染色的样品
通流式细胞仪从随机软件 Cell Q uest 获取数据, 通
过 ModFit 软件显示 DNA 含量分布图(横坐标以
DNA 相对含量反映荧光曲线的面积,坐标为细胞核
次数) ,且计算 G0 / G1 峰的变异系数( CV ( %) = 标
准差/平均值
100)。根据未知样本和标准样本直
方图中峰值的相对位置, 确定未知样本的染色体倍
性。每个样品测定 5000~ 8000个细胞核。一般 CV 值
小于 3%表示结果准确, CV 值小于 5%基本正确[ 20]。
2
结果与分析
2. 1
苜蓿花药培养与植株再生
苜蓿花药接种于 M1培养基(图 1A) , 35 d后统
计诱导的出愈率可达到 82% (出愈率= 诱导愈伤组
织数/花药数
100%) (图 1B)。转入分化培养基
M2后, 结构疏松、具有明显的颗粒状、淡黄色或黄
绿色的愈伤组织会分化出绿色的芽点(图 1C)。分
化率可达到 40%﹙分化率= 愈伤组织分化数/转移
愈伤组织数
100%) ; 而另一种结构紧密、不容易分
开、淡黄色的愈伤组织几乎分化不出胚状体。将第 2
种愈伤组织转到去除2, 4-D、附加 6-BA 的培养基上,
分化愈伤组织逐渐出现黄色的、颗粒状的松散形态结
构,会有绿色胚状体出现。没有转移的第 2种愈伤组
织有的仍然快速生长,有的几乎停止生长,逐渐褐化,
它们最后都没能产生胚状体。小苗转入生根培养基
M3中 25 d后开始生根,生根率可达到 70%(图 1D)。
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报 第 18卷
图 1
不同倍性苜蓿花药再生植株形态
Fig . 1
Morpho type of Medicago sativ a the plants regenerated from anther cultur e
注: A :接种于愈伤组织诱导培养基上的苜蓿花药; B:愈伤分化培养基上的苜蓿花药愈伤组织; C:苜蓿花药愈伤组织分化芽;
D :苜蓿花药培养再生植株; E:苜蓿花药培养四倍体植株( 2n= 4x) ; F:苜蓿花药二倍体再生植株( 2n= 2x) ;
G:苜蓿花药培养嵌合体植株( 2x+ 4x) ; H :苜蓿花药培养三倍体植株( 2n= 3x)
Note: A: An ther of anther cu lture in Med icago sati v a L. ; B: Callu s of anther cultur e in Medicag o sat i va L. ; C: Emb ryo dif feren tiat ion of
anther culture in Med icago sati v a L. ; D: Plan ts derived f rom anther culture in Medicag o sat iv a L. ; E: T he t riploid ( 2n= 4x)
of anther cu lture in Med icago sati v a L. ; F: T he t riploid ( 2n= 2 x) of anth er cultur e in Medicag o sat i va L. ; G: Th e Mixoploid
( 2x + 4x ) of anther culture in Medicag o sat iv a L . ; H : T he t riploid ( 2n = 3x ) of anther culture in Medicag o sat iv a L
2. 2
不同分离缓冲液对紫花苜蓿细胞核悬液 DNA
分辨率效应的比较
流式细胞仪分析的准确率与细胞核悬液的制作
关系非常大,当细胞悬浮液制作不过关时, 从 DNA
含量分布曲线图可以看出,样品碎片较多,而能够体
现 DNA 含量的峰也不明显。不同植物的组织结构
和化学成分存在较大差异。因此,对不同植物要用
不同的细胞核分离缓冲液,或改变缓冲液成分以获
得较高分辨率。使用以上 4种缓冲液制备的苜蓿细
胞核悬浮液,经流式细胞仪分析测定,
,
,
均可
产生非常明显
峰
, 但它们的变异系数 CV 值呈现
一定差异。缓冲液
的值最高( > 6% ) ,缓冲液
次
之( > 4. 75% ) ,缓冲液
较低( > 3. 57%)。缓冲液

没有能够显示倍性较为明显的峰, 图碎片较多,说
716
第 5期 耿小丽等:苜蓿花药培养再生植株染色体倍性检测研究
明本组试验不成功。
2. 3
再生植株的倍性检测结果
50株苜蓿花药再生植株幼苗经流式细胞仪倍
数检测, 清晰地检测出 42 株( 84% )是相同的, 它们
都是四倍体( 2n= 4x ) (图 2A)。8株( 16%)的 DNA
含量不相同。2n = 4x 与 2n = 2x 嵌合体为 5 株
( 10%) (图 2C) , 二倍体 ( 2n= 2x )为 2 株( 4%) (图
2D) ,三倍体( 2n= 3x )为 1株( 4% ) (图 2B)。流式
细胞仪非常精确的分析出二倍体的 G0 / G1 的峰值
为 100
3,四倍体的为 198
2, 混合体为 100
2和
200
1,三倍体的为 150
2。
图 2
不同倍性苜蓿花药培养再生植株 DNA含量分布图
Fig. 2
Nuclei DNA content o f Med icago sativa the plants r eg enerated f rom anther culture
注: A :四倍体( 2n= 4x) G1 / G 0 峰值在 200附近; B:三倍体( 2n= 3x ) G1 / G0 峰值在 150附近; C :嵌合体
( 2x+ 4x) G 1/ G 0 峰值在 100和 200附近; D:二倍体( 2n= 2x) G 1/ G 0 峰值在 100附近
Note: A: His togram show ing G 1/ G 0 peak ( chan nel 200) of the t riploid ( 2n= 4x) sam ples; B: H istogram show ing G1 / G0 peak
( channel 150) of the t riploid ( 2n = 3x ) sam ples; C: H istogram show ing G1 / G 0 peak ( ch ann el 100 and 200) of the
mixoploid( 2x+ 4x) sam ples . ; D: His togram sh ow ing G 1/ G 0 peak( channel 100) of th e t riploid( 2n= 2x) samples
2. 4
不同倍性再生植株形态观测
经过流式细胞仪检测的不同倍性的苜蓿花药再
生植株在外部形态上也有明显的差异。四倍体与二
倍体相比,四倍体紫花苜蓿的每个分枝明显具有更
多的叶,节间也较长。且四倍体的单叶面积比二倍
体的大很多,具有母体植株所具有的多叶特性和直
立性(图 1E)。二倍体叶形较四倍体小, 形状较窄,
且不具有锯齿状边缘, 不具有母体植株所具有的多
叶特性与直立性(图 1F)。嵌合体的叶形表现为相
嵌性,植株上多叶性状和非多叶形状都有出现(图
1G)。嵌合体生长势非常弱, 虽然在生根培养基中
有细根出现,但培养一段时间后全部死亡。
3
讨论与结论
在花药培养过程中,诱导胚性愈伤率低是目前
面临的主要问题之一。在诱导愈伤分化过程中发
现,诱导分化培养基中的 2, 4-D 和 6-BA 只有达到
一个最佳的平衡状态, 才能诱导产生胚性愈伤组织,
如果 2, 4-D在愈伤组织中过多积累就导致了细胞生
长势大于细胞分裂势, 而使非胚性细胞大量增殖;反
之 2, 4-D积累的水平不够了, 能与 6-BA 共同在愈
伤组织内产生良好的协同作用, 诱导出胚状体。徐
恒等[ 10]利用苜蓿下胚轴、嫩茎、子叶和根作外植体
最终诱导的胚性愈伤组织也都表现出同样的情况。
张万军等 [ 11]、马菊兰[ 12] 在试验中也发现, 苜蓿体细
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胞胚发生是 2, 4-D和 KT 协同作用的结果。
不同植物的组织结构和化学成分存在较大差
异。因此,在制作细胞核悬浮液时不同植物要用不
同的细胞核分离缓冲液, 或改变缓冲液的成分,以便
在流式细胞仪检测时获得较高分辨率。此外植物的
株龄和破碎方法对细胞核悬浮液的制作也有很大的
影响。大多试验都采用幼嫩的植株,破碎时使用解
剖刀切碎[ 13, 14] ,也有人采用研磨方法[ 15, 16] 或剪碎 [ 17]
方法。本试验将 3周龄再生植株的叶片放在培养皿
中并将培养皿放在冰袋上, 用锋利的剃须刀片在与
叶片呈 90
的方向垂直切下, 将叶片进行机械破碎。
这种方法能有效保持细胞核的完整性, 提高检测准
确度。细胞核分离缓冲液的组成不仅与 DNA 含量
分辨率有关,而且会影响细胞核从细胞质中释放、分
离后细胞核的完整性,以及 DNA 的染色。所以, 缓
冲液是由多种成分组成。在缓冲液中添加精胺有稳
定细胞核的染色质的作用 [ 19] , 添加葡萄糖有利于维
持细胞核的完整性并防止它们聚集。EDTA 是 1
种金属螯合剂, 用于结合作为核酸酶辅助因子的二
价阳离子[ 19, 20] ,而无机盐( KCl, NaCl)则能使缓冲液
达到一定的离子强度 [ 20, 22]。添加 Tr is, Ops, Epes
等有机物能使缓冲液 pH 值保持相对稳定。Tr-i
tonX-100是非离子去垢剂, 促进细胞核释放, 可降
低细胞核和细胞质碎片聚集。还原剂巯基乙醇能保
护染色质蛋白, 抵消酚类物质对 DNA 染色的干
扰[ 20]。本试验流式细胞仪的检测结果表明,缓冲液
Lysis buf fer 适合于制备苜蓿细胞核悬浮液,并能成
功鉴别苜蓿花培苗的染色体倍性。
花药是由花药壁和花粉等组成的复杂体, 既含
有四倍体的营养体细胞也含有单倍体的花粉细胞,
因此在花药培养过程中容易产生染色体倍性不同的
愈伤组织嵌合体进而影响花药培养再生植株染色体
的倍性。本试验得到的为染色体倍性水平不同的混
合群体,不仅有二倍体, 四倍体, 还有三倍体和嵌合
体。目前,我们主要通过控制愈伤的继代次数,改变
培养基的成分和类型,选择供试材料的种类和株龄,
提高蔗糖浓度, 减少或不用 2, 4-D [ 23]等方法来控制
花药培养过程中体细胞的干扰, 但这并没有从根本
上解决问题,所以如何有效的控制体细胞干扰,仍需
要进一步的研究 [ 18]。在组织培养过程中,同一来源
的愈伤组织分化出了不同倍性的再生植株, 说明了
愈伤组织的遗传不稳定性, 这与前人的报道相
同[ 24] , 可见通过愈伤组织的培养可以得到新的变异
类型。这为苜蓿遗传变异的研究提供了一条新思路。
流式细胞仪测定法已经被多次应用于鉴定花培
苗的倍性, 而且被证明是准确的[ 25]。Mollers [ 21] 等
尝试用流式细胞仪对绿色子叶形胚体进行早期倍数
检测,得较好结果。用流式细胞法鉴定苜蓿倍性, 具
有简单、快速、鉴定精确度高、可以进行大批量检测
的优点,染色体计数法只能对少量细胞进行检测,且
过程复杂,无法对嵌合体进行检测。
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