全 文 ：第 16 卷 第 1 期
Vol. 16 No . 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 1 月
Jan. 2008
酶解对苜蓿子叶原生质体分离效果的影响
赵红娟, 张 博* , 陈爱萍, 李培英, 肖 燕
(新疆农业大学草业工程学院, 新疆草地资源与生态自治区重点实验室 , 新疆乌鲁木齐 830052)
摘 要: 以新牧 1 号杂花苜蓿( Med icago v ar ia Martyn cv. Xinmu No. 1)无菌苗子叶为材料, 研究酶液组合、酶解
时间、酶液渗透压及酶液 pH 值对其原生质体的分离效果。结果表明:获得有活力原生质体最佳的酶液组合、酶解
时间、酶液渗透压和酶液 pH 值, 分别为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶、10 h、0. 55 mol/ L 和 5. 6。
关键词: 苜蓿; 原生质体; 酶解条件
中图分类号: S551. 7; Q242 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 01-0050-04
Effects of Different Enzymolysis Conditions on the Cotyledons
Protoplast Isolation of Alfalfa
ZHAO Hong- juan, ZH ANG Bo* , CHEN A-i ping, LI Pe-i y ing, XIAO Yan
( Xinj iang Key Laboratory of Gras sland Resources and Ecology, College of Pratacul tu ral Engineering, Xinjiang Agricul tu ral U nivers ity,
Urumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Region 830052, Chin a)
Abstract: The Effects of different enzyme combinat ion, mannitol concentrat ion, enzymolysis t ime, and pH
on pr otoplast iso lat ion w ere investig ated using the aseptic seedling co ty ledons of Medicago v ar ia Martyn
cv. Xinmu No . 1 as tested materials. The results show that the optimum condit ions for high y ield of viable
pro toplast w ere as fo llow s: enzyme combination containing 2% cel lulo se onozuka R-10+ 0. 5% pect inase+
0. 3% macerozyme R-10, mannitol concentrat ion at 0. 55 mol/ L , enzymoly sis time o f 10 h, and pH= 5. 6.
Key words: M edicago varia Martyn; Protoplast ; Enzymo lysis condit ions
苜蓿(Medicago sat iv a L. )是最具经济价值和
营养价值的豆科牧草之一, 具有高产、优质、适应性
强、改土固氮等优点,被誉为/牧草之王0 [ 1]。现在的
苜蓿育种多采用传统的选择育种和杂交育种, 但远
缘杂交的不亲和性阻碍了这些技术在苜蓿育种中的
应用。以原生质体融合为基础的体细胞杂交技术可
以克服远缘杂交的前述困难, 实现不同植物间部分
基因组或特异染色体的转移, 在转基因育种应用中
还可以把外源目的基因导入原生质体, 创造出新的
种质资源。
本研究以在新牧 1号杂花苜蓿( Med icago var-
ia Martyn cv. Xinmu No. 1)为研究对象, 利用体细
胞杂交技术,培育优质、高产、抗逆性强的苜蓿新品
种。原生质体游离与培养是体细胞杂交的基础, 因
此开展豆科牧草原生质体游离与培养的研究对豆科
牧草生物技术育种有重要意义。研究表明制备苜蓿
原生质体所用酶液的成分、浓度、酶解时间和渗透压
有较大差异 [ 2~ 8] , 新牧 1 号杂花苜蓿是新疆地区的
主栽品种,目前以它为材料进行原生质体的研究尚
未见报道。
1 材料与方法
1. 1 供试材料为新牧 1号杂花苜蓿原种(由新疆农
业大学草业工程学院牧草与草坪教研室提供)。将种
子在 70%乙醇中浸泡30 s,再用 0. 1% HgCl2 消毒 10
min,无菌水清洗 3 ~ 5 次, 接种到不含激素的 1/ 2
MS[ 9]固体培养基, 在 25 e , 12 h光照下培养 5- 7 d。
收稿日期: 2006-12-22; 修回日期: 2007-11-19
基金项目: 新疆草地资源与生态自治区重点实验室开放课题( XJDX0201-2004-04) ;新疆自治区科技厅高新技术项目( 200511102)
作者简介: 赵红娟( 1979-) ,女,宁夏人,硕士研究生,研究方向为牧草生物技术育种, E-mail: xjzhaohj@ yahoo. com. cn ; * 通讯作者 Auth or
for corr espondence, E-mail: xjauzb@ 126. com
第 1期 赵红娟等: 酶解对苜蓿子叶原生质体分离效果的影响
1. 2 将 2-( N-吗啡啉) 乙磺酸 ( M ES ) 溶解在
CPW
[ 4]和甘露醇( M annitol )混合溶液中, 将不同浓
度的纤维素酶 ( Cellulase Onozuka R-10)、果胶酶
( Pect inase )、离析酶 ( M acerozyme R-10 ) 与 50
mmo lL- 1 CaCl2 # 2H 2O、0. 62 mmolL - 1 KH 2PO4 #
H 2O溶解其中制成混合酶液, 待酶完全溶解后, 调
节 pH 值, 然后以直径 0. 45 Lm 的微孔滤膜过滤灭
菌后备用。
1. 3 将展开的子叶切成 0. 5~ 1 mm 宽的小条, 置
于盛有 10 mL 混合酶液的培养皿(直径6 cm )中, 在
26 ? 1 e 的摇床中于黑暗条件下进行酶解,摇床转速
为 50 r/ m in,酶解 4~ 14 h。在酶解过程中,每隔 2
h取样在显微镜下观察 1 次, 当原生质体平均密度
较前 2 h 不再增加时为最适酶解时间。酶解充分
后,用 400目镍网过滤酶解分离的原生质体,以 500
r/ min离心 5 min, 去掉上清液, 再用 CPW-9M (含
9%甘露醇)溶液洗涤 2~ 3 次, 将原生质体悬浮于
CPW-9 M 溶液中,在 CPW-21S(含 21%蔗糖)液面
上缓缓加入上述原生质体悬浮液, 再以 500 r/ m in
离心5 min, 在 2个液面间出现一条绿色原生质体
带,用吸管小心地吸出漂浮于溶液界面间的原生质
体。最后用原生质体培养液清洗 1~ 2次,即可获得
纯化的新牧 1号苜蓿子叶原生质体。
1. 4 取少量原生质体悬浮液滴加在血球计数板上,
当原生质体充满计数室后,在显微镜下计数, 计算 4
个角和中央格内的原生质体数,各测定 3次, 取其平
均值。计算公式如下:
原生质体密度(个/ mL) = 5个中格内总原生质
体数/ 80 @ 400 @ 104 @ 原生质体稀释倍数;
原生质体产量(个/ g ) = (原生质体密度 @ 稀释
后体积) /子叶质量;
存活率( %) = (未染色原生质体数/原生质体总
数) @ 100;
有活力原生质体产量= 原生质体产量@存活率。
1. 5 数据处理
以影响原生质体分离效果的因子为变量,设置
不同处理,各设 3 次重复, 数据采用 DPS 数据处理
系统 3. 01进行分析。
2 结果与分析
2. 1 酶液浓度对原生质体分离效果的影响
当酶液 pH 5. 6、甘露醇浓度为 0. 55 mol/ L 时,
采用不同浓度配比的纤维素酶、果胶酶和离析酶分
离5- 7日龄新牧 1 号苜蓿子叶原生质体 10 h。结
果表明(表 1) : 随着离析酶浓度的增加,有活力的原
生质体产量逐步提高。当酶液组合为 2%纤维素酶
+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶时, 有活力的原生质
体产量为 2. 73 @ 106 个 # g - 1 ,细胞碎片少。增加纤
维素酶浓度,有活力的原生质体产量虽在提高, 但出
现较多破碎的原生质体。当酶液组合为 3%纤维素
酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶时, 有活力的原生
质体产量为 3. 23 @ 106 个 # g- 1 , 细胞碎片很多, 为
以后的培养增加了难度。适宜酶组合是 2%纤维素
酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶。
表 1 酶液浓度对子叶原生质体分离效果的影响
T able 1 Effects of different enzyme combinations on co tyledon pro toplast iso lat ion
纤维素酶
Cellulas e ( %)
果胶酶
Pectinas e ( % )
离析酶
M acerozyme ( % )
有活力原生质体产量
Viable protoplas t yield( @ 106 # g- 1 )
细胞碎片
Cell breakages
1. 0 0. 5 0. 1 0. 87 很少 Few
1. 0 0. 5 0. 3 1. 12 很少 Few
1. 0 0. 5 0. 5 1. 69 少 A lit t le
2. 0 0. 5 0. 1 1. 78 少 A lit t le
2. 0 0. 5 0. 3 2. 73 少 A lit t le
2. 0 0. 5 0. 5 2. 86 多 Many
3. 0 0. 5 0. 1 2. 98 多 Many
3. 0 0. 5 0. 3 3. 23 很多 A lot
3. 0 0. 5 0. 5 3. 41 很多 A lot
注:酶解时间 10 h,甘露醇浓度为 0. 55 mol/ L , pH 5. 6
Note: En zymolysis t ime: 10 h; Mannitol concent rat ion: 0. 55 m ol/ L; pH = 5. 6
2. 2 酶解时间对原生质体分离效果的影响
酶解时间过短, 原生质体产量太低,时间过长则
导致较早游离出来的原生质体破裂。酶解 4 h仅有
少量原生质体游离出来,随着时间的延长,原生质体
的产量逐渐增加, 但细胞碎片增多。酶解 10 h 后有
活力的原生质体产量为 2. 66 @ 106 个 # g - 1 , 12 h和
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草 地 学 报 第 16卷
14 h原生质体产量增加不明显, 并且细胞碎片急剧
增多,因此酶解时间以 10 h 最佳, 此时应及时收集
与纯化原生质体(表 2)。
表 2 酶解时间对子叶原生质体分离的影响
Table 2 Effects of enzymolysis time on co tyledon
protoplast isolation
酶解时间
Enzym olysis t ime
( h)
原生质体产量
Protoplast yield
( @ 106 # g- 1 )
存活率
Viabilit y
( % )
细胞碎片
Cel l
breakages
4 0. 22 90. 6 很少 Few
6 0. 96 88. 5 很少 Few
8 1. 45 86. 7 少 A lit t le
10 2. 66 86. 2 少 A lit t le
12 2. 73 70. 3 多 M any
14 2. 86 61. 4 很多 A lot
注:酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶,甘
露醇浓度为 0. 55 mol/ L, pH 5. 6
Note: enzyme combinat ion : 2% Cellulos e on ozuka R-10+ 0. 5%
pect inase+ 0. 3% maceroz yme R-10; mannitol concent rat ion: 0. 55
m ol/ L; pH= 5. 6
2. 3 混合酶液中甘露醇浓度对原生质体分离效果
的影响
去除细胞壁后如果溶液中的渗透压和细胞内的
渗透压不同,原生质体有可能涨破或收缩。试验表
明甘露醇浓度太低或太高时, 原生质体产量和活力
都不高。当浓度为 0. 55 mo l/ L 时,原生质体的产量
和存活率最高,分别是2. 33 @ 106 个# g- 1和 90. 2%,
并且获得的原生质体形状、大小基本一致, 边缘清
晰, 内含物多, 碎片少。当浓度为 0. 40 和 0. 65
mol/ L 时, 原生质体产量和存活率都很低,细胞碎片
很多, 给原生质体的培养带来困难。故甘露醇浓度
为0. 55 mol/ L时,制备新牧 1 号苜蓿子叶原生质体
较适宜(表 3)。
表 3 甘露醇浓度对子叶原生质体分离的影响
Table 3 Effects of mannito l concentr ation on cot yledon
protoplast isolation
甘露醇
Mannitol
( mol/ L)
原生质体产量
Pr otoplast yield
( @ 106 # g- 1)
存活率
Viabilit y
( % )
细胞碎片
Cel l
breakages
0. 40 0. 62 72. 3 很多 More
0. 45 1. 14 80. 4 多 Many
0. 50 1. 58 86. 1 少 Few
0. 55 2. 33 90. 2 很少 Few er
0. 60 1. 73 82. 4 少 Few
0. 65 1. 07 70. 8 多 Many
注:酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶,酶
解时间 10 h, pH 5. 6
Note: enzyme combinat ion: 2% cellulose onozuka R-10+ 0. 5%
pect inase+ 0. 3% macerozyme R-10; enzymolysis time: 10h; pH = 5. 6
2. 4 酶液 pH 值对游离原生质体效果的影响
当 pH 为 4. 4时, 有活力的原生质体产量较低,
细胞碎片很多,随着 pH 值的逐渐升高,产量逐步增
加,原生质体状态较好;当 pH 为 5. 6时, 产量最高
( 2. 32 @ 106 个 # g - 1 ) , 细胞碎片很少; 当 pH 为6. 4
时,产量很低,细胞碎片少。因此游离新牧 1号苜蓿
子叶原生质体最佳的酶液 pH 值应为 5. 6(表 4)。
表 4 pH值对子叶原生质体分离的影响
T able 4 Effects of pH on cot yledon pro toplast iso lation
pH 值
pH value
有活力原生质体产量
Viable protoplast yield ( @ 106 # g- 1 )
细胞碎片
Cell br eakages
4. 4 0. 13 很多 A lot
4. 8 0. 61 多 Many
5. 2 1. 44 少 A li tt le
5. 6 2. 32 很少 Few
6. 0 1. 98 多 Many
6. 4 0. 36 少 A li tt le
注:酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶, 酶
解时间 10 h ,甘露醇浓度为 0. 55 mol/ L
Note: enz yme combinat ion: 2% cellulose onozu ka R-10+ 0. 5%
pect inase+ 0. 3% macerozym e R-10; enz ymolysis t ime: 10 h; m an-
nitol concent rat ion: 0. 55 m ol/ L
3 讨论与结论
3. 1 建立稳定高效的原生质体分离体系,必须考虑
原生质体的产量与活力。本试验以/有活力的原生
质体产量0作为建立原生质体分离体系的指标, 可以
较客观地反映新牧 1号苜蓿子叶原生质体的分离效
果。
3. 2 游离原生质体时,适宜的酶液组合和酶解时间
因植物的种类不同有很大差异 [ 6~ 8]。本试验中, 酶
液组成以 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析
酶为最佳,在黑暗条件下解离 10 h 后,获得了大量
有活力的原生质体, 而且试验重复性好。王海波
等[ 5 ]以紫花苜蓿的叶片为材料游离原生质体,最佳
酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶, 酶解时间
为 8 h,两个试验各种最佳酶液组合可能是试验材
料的不同所致。在酶液和洗涤液中, 广泛使用的渗
透压调节剂浓度约在 0. 40~ 0. 80 mol/ L。本试验
结果表明,甘露醇浓度为 0. 55 mol/ L 有利于新牧 1
号苜蓿子叶原生质体渗透压的稳定。当用非金属离
子作渗透压稳定剂时, 常在酶液中加入一定量的盐,
例如,加入 CaCl2 可明显提高细胞膜的稳定性, 加入
KH 2PO4 可以提高原生质体的稳定性和活力[ 10]。
酶液的 pH 对原生质体的产量有很大的影响, 本试
验中酶液最适 pH 为5. 6, 太低或过高时, 产量都不
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第 1期 赵红娟等: 酶解对苜蓿子叶原生质体分离效果的影响
高。其原因是绝大部分酶的活力受 pH 的影响, 纤
维素酶的最适 pH 是 5. 5~ 6. 0[ 11] , 离析酶有效作用
的 pH 是 3. 0~ 7. 0 [ 12]。分离蒜味草( T ulbaghia vi-
olacea Harv. ) 花粉原生质体酶液最适 pH 值为
5. 8[ 13] ,白羽扇豆( L up inus albus L. ) 的子叶则以
5. 6为最佳 [ 14]。pH 值还对细胞膜及细胞保护系统
有很大的影响, 当 pH 值小于 5 或大于 8 时, 油菜
( Br assica camp estr i s L. )幼苗细胞膜脂质过氧化水
平升高,细胞结构损伤, 使细胞膜透性增大 [ 15]。从
上述两方面综合确定酶液的 pH 值, 可以获得大量
有活力的原生质体。
图 1 苜蓿子叶原生质体
F ig . 1 Co tyledon pro toplasts of alfalfa
图 2 存活率检测
Fig. 2 Viability examination of pro toplasts
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(责任编辑 孟昭仪 梁艳萍)
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