全 文 ：第 16 卷
第 4 期

Vo l. 16
No. 4
草
地
学
报
ACT A AGREST IA SIN ICA



2008年
7 月

Jul.

2008
岷山红三叶愈伤组织诱导和植株再生研究
厚彦明1, 2, 3, 师尚礼1, 2, 3 , 杜文华1, 2, 3, 4* , 周万海1, 2, 3
( 1.甘肃农业大学草业学院, 兰州 730070; 2.草业生态系统教育部重点实验室(甘肃农业大学) 兰州 730070;
3. 中- 美草地畜牧业可持续研究中心, 兰州 730070; 4. 干旱与草地生态教育部重点实验室(兰州大学) 兰州 730070)
摘要: 通过对岷山红三叶下胚轴和子叶再生体系建立的研究, 获得愈伤组织诱导的最佳培养基为: M S+ 2 mg/ L 2,
4- D+ 0. 5 mg/ L6-BA+ 2%蔗糖+ 0. 6%琼脂 ,胚性愈伤组织诱导培养基为: MS+ 0. 1 mg/ L IAA+ 0. 5 mg/ L 6-BA
+ 2%蔗糖+ 0. 6%琼脂, 芽诱导培养基为: B5+ 0. 06 mg/ L NAA+ 2%蔗糖+ 0. 6%琼脂, 每瓶可以长出 2~ 10 条
茎, 将茎转入生根培养基后愈伤继代可持续出芽。最佳的生根培养基为: 1/ 2 MS+ 0. 05mg/ LNAA+ 1. 5% 蔗糖+
0. 8%琼脂。建立再生植株约需 160 d。
关键词: 岷山红三叶; 愈伤组织; 植株再生
中图分类号: S812




文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2008) 04-0359-05
Studies on Callus Induction and Plant Regeneration of Minshan Red Clover
HOU Yan-ming 1, 2, 3 , SH I Shang- li1, 2, 3 , DU Wen-hua1, 2, 3, 4* , ZHOU Wan-hai1, 2, 3
(1. Pratacultural Col leg e, Gansu Agricultural U niver sity, Lanzh ou , Gan su Provin ce 730070, C hina;
2. Key Laboratory of Grassland Ecosystem ( Gan su Agricultu ral University) , M inist ry of Educat ion, Lan zhou, Gansu Province 730070;
3. Sino- US Cen ter for Grazin glan d Ecosystem Su stain abil ity, Lanzhou, Gan su Pr ovince 730070, Ch ina;
4. Key Laboratory of Arid an d Grassland Ecology ( Lan zhou University) , M inist ry of Educat ion, L anzhou, Gansu Province 730000, China)
Abstract: Tissue culture technique is the basis for plant br eeding and genet ic biodiv er sity research.
T hr ough the study in plant reg enerat ion of hypocoty l and cotyledon of Tr ifolium pratense L. cv. M inshan,
w e found that the opt imal callus induction medium was M S+ 2 mg / L 2, 4-D + 0. 5 mg/ L 6-BA+ 2% su-
cr ose+ 0. 6% agar; the best medium for embryogenic callus induct ion w as M S+ 0. 1 mg/ L IAA + 0. 5 mg/
L 6-BA+ 2% sucrose+ 0. 6% agar; bud induct ion medium was B5+ 0. 06 mg/ L N AA + 2% sucro se+
0. 6%. agar. In each bot t le, 2 to 10 stems w ere obtained and then transferred into ro ot induct ion medium,
buds could cont inually gr ow . The opt imal roo t induct ion medium was 1/ 2 M S+ 0. 05 mg/ L NAA+ 1. 5%
sucrose + 0. 8% agar. 160 d w as needed for the establishment of plant let.
Key words: Tr if ol ium p r atense L. cv. M inshan; Callus; P lant reg ener at ion


红三叶 ( T r if oloium p ratense L. )是豆科三叶
草属多年生草本植物。它原产于小亚细亚与东南
欧,广泛分布于温带及亚热带地区,是集饲用和药用
价值于一体的牧草新秀 [ 1]。其营养价值和草产量仅
次于苜蓿,且含有大量异黄酮和黄酮类物质[ 2]。组
织培养是育种和遗传多样性等研究的基础, Phi-l
lips
[ 2]和 Beach [ 3]在 20世纪 70 年代,孟玉玲等[ 4] 在
1994年对红三叶的组织培养进行了研究, 但所用品
种不详。植物不同种或品种间的再生体系具有明显
差异,在国内外尚未见岷山红三叶组培方面的研究
报道。
岷山红三叶( T . p r atense cv . M inshan)为适宜
于甘肃省高寒阴湿区种植的地方品种, 在医药生产
和保健食品业中发挥着巨大作用,其种植面积也逐
年扩大,但在长期种植过程中,该品种存在异黄酮含
量低、重度感染白粉病等缺点,对单位面积的草产量
收稿日期: 2007-10-29; 修回日期: 2008-03- 10
基金项目: 草业生态系统教育部省部共建重点实验室项目( CY-GG-2006- 17) ; 中国博士后科学基金项目
作者简介: 厚彦明( 1982- ) ,甘肃甘谷人,硕士研究生,研究方向为牧草育种及种质资源, E-mail: ym- hou@ 163. com; * 通讯作者 Author
for corresponden ce, E- mail : duw h@ gsau . edu. cn
草
地
学
报 第 16卷
和异黄酮提取量影响极大。对愈伤组织进行辐射育
种和遗传转化是改良其品质的重要途径。本文旨在
建立岷山红三叶的高频再生体系,为改良种质资源,
提高抗病性奠定基础。
1
材料和方法
1. 1
供试材料
岷山红三叶种子由甘肃省岷县草原站提供。种
子用清水浸泡 20 min后,用 70%的乙醇浸泡 20 s,
用无菌水冲洗 3~ 4次。再将种子在有效氯浓度为
9%的次氯酸钠溶液中震荡 25 m in, 然后用无菌水
冲洗 5~ 6 次, 接于 MS+ 10 g / L 蔗糖+ 0. 6%琼脂
的培养基中。取 6日龄无菌苗的下胚轴与子叶作外
植体,诱导愈伤组织。
1. 2
愈伤组织诱导
将下胚轴切成 0. 5 cm 长的小段, 子叶切成两
瓣,分别接种于 MS+ 20 g/ L 蔗糖+ 0. 6% 琼脂的
基本培养基上,激素采用单一 2, 4-D和 2, 4-D与 6-
BA组合两种处理。单一激素 2, 4-D的浓度梯度分
别设为: D1: 0. 5 mg/ L、D2: 2 mg/ L、D3: 5 mg / L ; 2,
4-D与 6-BA 组合的处理分别为: H1: M S+ 0. 5 mg/
L 6-BA+ 0. 5 mg/ L 2, 4-D, H2: MS+ 0. 5 mg/ L 6-
BA+ 2 mg / L 2, 4-D和 H3: M S+ 0. 5 mg/ L 6-BA
+ 3 mg/ L 2, 4-D。每个处理 30个培养皿。置于 25

2
温度下暗培养。15 d 之后均在 25
2
、16
h/ d、2500 Lx、50% ~ 90% RH 的光照培养箱中培
养。每隔两天观察和记录出愈和生长情况,统计不
同处理随时间的出愈动态和愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率( %) = 愈伤组织数接种外植体总数
100%
1. 3
愈伤组织的继代培养
诱导出的愈伤组织继代培养条件分别为, JI:
M S+ 0. 5 mg / L 6-BA+ 0. 1 mg / L IA A, JII: M S+
0. 5 mg/ L 6-BA+ 0. 5 mg/ L 2, 4-D, 每隔一周观察
并记录一次。
1. 4
不定芽的分化
取疏松颗粒状淡黄(绿)色愈伤组织接种于分化
培养基上,利用正交设计对岷山红三叶分化培养基
进行筛选。取三个因素: 基本培养基、KT、NAA。
每个因素设 3 个水平(表 1) , 共 9个处理。观察愈
伤组织的分化情况并统计出现的芽点数。计算各种
组合的每瓶平均芽数(该种组合的总芽数/该种组合
的瓶数)。
表 1
因素水平表
Table 1
Experimental facto rs and levels
编号 Code 培养基 Medium KT ( mg/ L) NAA( mg/ L)
1 MS 0 0
2 1/ 2MS 0. 4 0. 02
3 B5 0. 6 0. 06
1. 5
根的诱导
取长约 2~ 3 cm 的小苗接种到生根培养基上。
生根培养基分别为: G
: 1/ 2 M S+ 15 g/ L 蔗糖+
0. 8% 琼脂, G
: 1/ 2 MS + 0. 05 mg/ L NAA + 15
g/ L 蔗糖+ 0. 8% 琼脂, G
: 1/ 2 M S+ 0. 1 mg/ L
NAA+ 15 g/ L 蔗糖+ 0. 8% 琼脂。观察开始生根
时间和根的生长形态。
2
结果与分析
2. 1
愈伤组织的诱导
在只含单一激素 2, 4-D和 2, 4-D与 6-BA 组
合的 MS 培养基上,不同外植体间的出愈动态完全
相同。下胚轴在第 3 d开始膨大出愈, 第 4~ 6 d 出
愈最多, 83%的外植体在此 3 d 内出愈,第 6 d出愈
基本完成, 出愈率为 95. 2% (图 1)。子叶在第 4 d
开始出愈,第 5~ 8 d 出愈最多, 在此期间的出愈率
达到 80%,第 9 d出愈基本完成, 出愈率为 92. 3%。
下胚轴开始膨大出愈的时间较子叶早 1~ 2 d, 出愈
所用的时间比子叶少 2 d。下胚轴和子叶的出愈率
差异显著( P< 0. 05)。
图 1
不同外植体出愈动态
Fig. 1
Dynamics o f callus induction o f different explants


在单一激素 2, 4-D 的培养基 D1、D2、D3上,不
同外植体诱导出的愈伤均发生水渍化, 下胚轴诱导
的愈伤比子叶诱导的严重, 发生水渍化的愈伤组织
生长缓慢。培养基 D1的出愈相对较快, 水渍化程
度较轻。20 d后水渍化的愈伤组织生长停止, 但不
360
第 3期 厚彦明等:岷山红三叶愈伤组织诱导和植株再生研究
会发生褐化、死亡,有利于保存。发生水渍化的愈伤
组织继代在适宜的培养基上后又正常生长(表 2)。
在 2, 4-D与 6-BA 组合的培养基 H1、H2、H3上诱
导出的愈伤组织的质地明显优于单一激素 2, 4-D
(如图 3、4) , 多为疏松颗粒状、少数蜡状, 呈白色、
淡黄(绿)色、少数透明, 无水渍化现象, 培养基 H2
出愈率最高。且疏松颗粒状愈伤的比例最高, 好
于其他两种培养基。综合出愈率和愈伤质地可以
得出: 培养基 H2 为岷山红三叶诱导愈伤的最佳培
养基。
表 2
不同外植体的出愈率和愈伤质地
Table 2
Callus induction r ate and callus quality of different explants
编号
Code
2, 4-D
( mg/ L)
6-BA
( mg/ L)
外植体
Ex plan t
出愈时间( d)
Callu s induct ion time
出愈率( % )
Cal lus induct ion rate
愈伤质地
Callus qualit y
D1 0. 5 0 下胚轴 H ypocotyl 6 94 ab
子叶 Cotyledon 8 87c
D2 2 0 下胚轴 H ypocotyl 6 91b
子叶 Cotyledon 8 80c
D3 4 0 下胚轴 H ypocotyl 6 93b
子叶 Cotyledon 8 80c
大部分水渍化, 白色或无色透明。只有极
少数直接再生出芽、水渍化程度轻。
Mainly water-soaking in w hite or t ranspar-
en cy. Only few of callus b udded direct ly
w ith slight w ater-soakin g.
H1 0. 5 0. 5 下胚轴 H ypocotyl 6 98a
子叶 Cotyledon 8 84c
H2 2 0. 5 下胚轴 H ypocotyl 6 100a
子叶 Cotyledon 8 96a
H3 3 0. 5 下胚轴 H ypocotyl 6 91b
子叶 Cotyledon 8 76c
大部分疏松颗粒状,少数蜡状, 白色、淡黄
(绿)色、少数透明。极少数直接再生出芽。
Mainly loose and gran ular, a few of callus
in wax-like, w hite or light yellow ( green) .
Only few of cal lus budded dir ect ly.


注:同列中不同小写字母间差异显著( P < 0. 05)
Note: Means w ith diff er ent small let ters in th e same colum n are s ignifi can tly dif feren t at the 0. 05 level
2. 2
愈伤组织的继代
愈伤组织在继代培养基 J
和 J
上生长明显
不同(表 3)。在培养基 J
上的生长速度明显高于 J

( P< 0. 01) ,愈伤组织呈疏松颗粒状,极少数表现
为蜡质状, 颜色多为白色、淡黄色, 少数嵌有绿点。
在培养基 J
上,愈伤组织生长较缓慢, 大部分呈现
蜡质状,有的发生水渍化、褐化现象, 颜色为暗白色、
黄绿色、少数白色。不同外植体间生长速度也有差
异。下胚轴生长速度较子叶要快, 继代第一周生长
迅速,之后生长速度变慢。
表 3
激素对不同外植体愈伤组织生长速度的影响
Table 3
Effect of ho rmone on the speed of callus g rowth
继代时间
Subcul tu re t ime
培养基
Medium
外植体
Ex plan t
直径( cm)
Diameter, cm
一周后 J
下胚轴 H ypocotyl 0. 89
One w eek 子叶 Cotyledon 1. 03
J
下胚轴 H ypocotyl 1. 16
子叶 Cotyledon 0. 84
两周后 J
下胚轴 H ypocotyl 1. 18
Tw o week s 子叶 Cotyledon 1. 20
J
下胚轴 H ypocotyl 1. 77
子叶 Cotyledon 1. 04
2. 3
不定芽的分化
愈伤组织在生长良好的培养基 J
上继代两次
后,转到分化培养基中。分析表明,以平均每瓶芽数
为考察指标时, 3 种影响因素对愈伤组织分化的影
响程度依次为: 培养基> KT > NAA, 且均达显著水
平( P< 0. 05)。从分化形态观察可以看出, B5培养
基分化出的芽多, 且无毛根分化; M S 和 1/ 2M S 分
化较多毛根和不正常芽(表 4)。KT 和 NAA 对愈
伤的分化也有重要的作用, 少量的 NAA 可以诱导
愈伤分化。KT 对愈伤的分化不利, 高浓度时会产
生很多毛根,且分化出的苗都不正常,表现为茎和叶
生长矮壮,长到 0. 5 cm 后停止生长, 有点玻璃化。
总结得出: F
( B5+ 0. 06mg/ LNA A+ 蔗糖 2% +
琼脂 0. 6%)为最好的分化培养基。图 4、5、6 为分
化后的芽。
2. 4
根的诱导
诱导出的芽长到 2~ 3 cm 后, 将芽(底部带愈
伤)转到不同生根培养基(表 5)上。实验表明, 基本
培养基生根效果 1/ 2 MS 较 MS好, 在 B5培养基上
芽不能生根。高浓度蔗糖对生根不利, 低浓度蔗糖
和高浓度琼脂可以提高生根率、缩短生根时间。
NAA对发根时间有明显的抑制作用, 达到了显著
水平( P< 0. 05)。在不加 NAA 的 G
培养基上长
出的根细长、白色(图 7) , 出根时间短。但这种根在
后期移栽的时候成活率低。在 G
和 G
培养基
上,分化的根较粗、生长缓慢、颜色发黄(图 8) , 移栽
成活率高。可以看出, G
生根率高, 且根的质量
好,为最好的生根培养基。
361
草
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报 第 16卷
图 2
下胚轴诱导的愈伤组织( 20 d)
F ig . 2
Callus induced fr om hypoco tyls ( 20 d)
图 3
子叶诱导的愈伤组织( 20 d)
F ig . 3
Callus induced fr om Coty ledon ( 20 d)
图 4, 5, 6
生长不同时期的分化芽
Fig. 4, 5, 6
P lantlet differ entiated in different stages
图 7
G
培养基上诱导的根
F ig . 7
Root induced from medium G

图 8
G
培养基上诱导的根
F ig . 8
Root induced from medium G

表 4
愈伤的分化率及分化形态
Table 4
Differ ent iation r ate and morpho log y o f callus
编号
Code
培养基
Medium
KT
( mg/ L)
NAA
( mg/ L)
平均每瓶芽数(个)
Average bud no. p er bot tl e
愈伤组织的分化形态
Differ ent iation morph ologyof callus
F
MS 0 0 0 生长较慢 Grow slowly
F
MS 0. 4 0. 02 0 毛根较多,产生不正常芽点 Lots of h air root , abnormal bud
F
MS 0. 6 0. 06 0 毛根多,有不正常芽点 Lots of hair root , abnorm al bud
F
1/ 2MS 0 0. 02 2 分化较多的根,芽分化相对少 More root , l es s b ud
F
1/ 2MS 0. 4 0. 06 1 有少量毛根 A few of hair root
F
1/ 2MS 0. 6 0 0 有少量毛根 A few of hair root
F
B5 0 0. 06 6 分化较多的茎,无根的分化 Lots of b ud, n o root
F
B5 0. 4 0 0 无分化现象 No dif ferent iat ion
F
B5 0. 6 0. 02 2 少量茎,较多不正常芽点 A few of bud, lot s of ab normal b ud
362
第 3期 厚彦明等:岷山红三叶愈伤组织诱导和植株再生研究
表 5
不同培养基对生根的影响
T able 5
Effect of differ ent mediums on roo t formation
培养基
Medium
生根时间( d)
Rootage time, d
生根率( % )
Root ing rate, %
G
5~ 10 76
G
10~ 15 74
G
20 68
3
讨
论
3. 1
研究表明, 高浓度 2, 4-D对植物本身会造成
毒害作用, 但适宜浓度对愈伤组织形成有促进作
用[ 5, 6] 。培养基中仅有 2, 4-D时,诱导质量较差,同
时出现水浸状现象,或诱导的愈伤容易老化,难以分
化不定芽[ 7, 8] ,因此需要加入一些其他激素,如 KT,
6-BA 等, 在含 2, 4-D的诱导培养基中加入一定浓
度的细胞分裂素有利于胚性愈伤组织的诱导。
3. 2
在接种无菌苗外植体诱导的过程中, 从子叶柄
和下胚轴顶端剪下的外植体会直接再生出芽。而杨
丽莉等[ 9] 对白三叶子叶和下胚轴植株再生系统的研
究发现,白三叶胚轴生长点的再生能力最强,可以直
接再生出芽, 子叶和下胚轴再生能力极低。本研究
发现,红三叶除了胚轴生长点的再生能力强外, 子叶
柄处的再生能力也较强,具体的发芽能力有待进一
步研究。
3. 3
在含 2, 4-D的继代培养基上,愈伤组织生长
缓慢,且大部分水渍化或呈蜡状, 用 IAA 替代 2, 4-
D后, 培养基上继代的愈伤生长迅速, 呈疏松颗粒
状。因此,愈伤组织诱导完成后,在以后的培养基中
不能再添加 2, 4-D。
3. 4
基本培养基B5的分化效果好于 1/ 2MS和MS,
这可能与B5所含铵态氮和硝态氮的比例有关。所以
培养基中各种元素的含量和比例会影响分化。
3. 5
斯库格和米勒[ 10] 在烟草的组织培养中发现,
细胞分裂素(激动素)和生长素的相互作用控制着愈
伤组织根、芽的形成。当培养基中 CT K/ IAA 的比
值高时, 愈伤组织形成芽; 当 CTK/ IAA 的比值低
时,愈伤组织形成根。在豆科植物苜蓿的研究中,白
静仁等[ 11] 和舒文华等 [ 12]分别在野生黄花苜蓿和紫
花苜蓿的愈伤分化中的激素比例也符合这一规律。
但本实验发现, 在含有 CTK 的培养基中, 无论
CT K/ IAA 的比值如何, 愈伤组织分化出的芽大多
数不正常,只有少量正常芽,而在只加了 NAA 的培
养基中,才分化出较多正常芽。孟玉玲等[ 4] 的研究
认为: 将 6BA 降至 0. 1 mg / L , 并加入 0. 2 mg / L
IBA 愈伤组织分化苗率为 8% ~ 10%。细胞分裂素
的量( 0. 1 mg/ L )要少于细胞生长素的量( 0. 2 mg/
L) ,这与我们的研究结果相似。
3. 6
生根培养基以 1/ 2M S 最好, M S 培养基离子
浓度偏高, B5培养基不利于生根。
3. 7
植物再生体系的建立是一个连续的复杂过程,
包括愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的诱导、芽的诱
导和生根培养。每个过程都需要分梯度筛选较好的
培养基和培养条件,且有些因素的影响机理尚不清
楚。所以,再生体系的建立是一个不定因素多、周期
长的艰难过程。
4
结
论
4. 1
培养基 H2( M S+ 2 mg / L 2, 4-D+ 0. 5 mg/
L6-BA+ 2%蔗糖+ 0. 6%琼脂)诱导外植体的出愈
率高,愈伤多呈疏松颗粒状,是岷山红三叶最好的愈
伤诱导培养基;
4. 2
培养基 F
( B5+ 0. 06 mg / L NAA+ 2%蔗糖
+ 0. 6%琼脂)是岷山红三叶最佳分化培养基;
4. 3
岷山红三叶生根培养基以 G
( 1/ 2 MS+ 0. 05
mg/ L NAA+ 15 g/ L 蔗糖+ 0.8%琼脂)效果最好。
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(责任编辑
张蕴薇)
363