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Vol.23 No.3
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ACTA AGRESTIA SINICA
2015$ 5%
May. 2015
犱狅犻:10.11733/j.issn.10070435.2015.03.020
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TANGRan,PENGXiaoqun,XIEXinming
(ColegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,GuangdongProvince510642,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Elephantgrass(犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狆狌狉狆狌狉犲狌犿)isakindoftypicalC4clonalplant,whichgrowswel
insouthChina.Itiscommonlyusedasforagegrass,greenenergygrassaswelasnonwoodfiber.Young
leafsheathsofelephantgrasswereusedformesophylprotoplastsisolationinthisstudy.5factorsofcelu
laseconcentration,macerozymeconcentration,pH,mannitolconcentration,enzymolysistimewerestud
iedtooptimizeisolationconditionsbasedonL16(45)orthogonaltest.Andtheisolatedelephantgrasspro
toplastswereusedforgenetransientexpressionassays,aimingtolaythefoundationforgenefunctionala
nalysisinelephantgrass.Theresultsshowedthattheoptimumconditionsforelephantgrassmesophyl
protoplastsisolationwereintheenzymecombinationscontaining1.5%celulase,0.75% macerozyme,0.5
mol·L-1mannitol,pH5.8.Thedigestionwasconductedinthedarkunder28℃for4hwithgentlesha
king.Undertheseconditions,theprotoplastsyieldwas5.11×106cels·gFW-1(freshweight),andthe
vitalitywas91.08%.Varianceanalysisoforthogonaltestindicatedthattheenzymolysistimeisthemost
importantfactorinfluencingbothprotoplastyieldandvitality.Twoplasmidvectors,carriedgreenandred
fluorescentproteinrespectively,werethentransformedintopurifiedmesophylprotoplastsbyPEGmedia
tedmethod.Thegreenandredfluorescentsignalweredetectedinthetransienttransformedprotoplasts,
obtainedthehighesttransformationefficiencyof77.47%,andcotransformationefficiencyof8.79%.The
isolatedprotoplastscouldbeusedforgenetransientassayinelephantgrass.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狆狌狉狆狌狉犲狌犿;Protoplast;PEGmediated;Transientexpression
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(1988),Å,«Tf§,ÊËÌÍñ,mVÏÐ*]ñ&
ÌÍ,Email:tangran@stu.scau.edu.cn;:6x×Author
forcorrespondence,Email:xiexmbs@scau.edu.cn
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Note:A:Healthy10dayoldelephantgrassseeding,redarrowsindicatetheoptimalpartforprotoplastisolation(Scalebar:3cm);
B:Cutstripsofleafsheathsareimmersedin0.6mol·L-1mannitolbeforeenzymaticdigestion;C:Enzymaticmixtureisturbidafterdigestion;
D:Microphotographofprotoplasts(×40)
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Japan),0.25% ~1% (W/V)I K £ R10
(Yakult,Japan),0.4~0.6mol·L-1IDÆfê,
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TreatmentNo.
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Celulase
R10(W/V)/%
K£R10
Macerozyme
R10(W/V)/%
pH
DÆfê
DMannitol
/mol·L-1
£Ýh
Digestion
time/h
1 1.0 0.25 5.2 0.3 2
2 1.0 0.50 5.5 0.4 4
3 1.0 0.75 5.8 0.5 6
4 1.0 1.00 6.0 0.6 8
5 1.5 0.25 5.5 0.5 8
6 1.5 0.50 5.2 0.6 6
7 1.5 0.75 6.0 0.3 4
8 1.5 1.00 5.8 0.4 2
9 2.0 0.25 5.8 0.6 4
10 2.0 0.50 6.0 0.5 2
11 2.0 0.75 5.2 0.4 8
12 2.0 1.00 5.5 0.3 6
13 2.5 0.25 6.0 0.4 6
14 2.5 0.50 5.8 0.3 8
15 2.5 0.75 5.5 0.6 2
16 2.5 1.00 5.2 0.5 4
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Table2 Theresultsoforthogonaltestonprotoplast
isolationfrom犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿leafsheaths
Ë5U
TreatmentNo.
ûñÀ2Í"
Protoplastyield/
×106cels·gFW-1
ûñÀ2!.
Protoplast
viability/%
1 0.43±0.06hH 94.90±1.71aA
2 4.09±0.10bAB 91.27±0.80abAB
3 3.44±0.47bBC 84.86±2.37bcdefBC
4 2.72±0.25cCD 81.18±3.04cdefCD
5 1.92±0.24defDEF 81.07±1.89cdefCD
6 2.50±0.42cdCDE 83.19±1.93cdefBCD
7 4.87±0.12aA 88.48±1.49abcABC
8 1.84±0.22defDEFG 87.95±1.62abcdABC
9 3.75±0.17bB 87.34±1.45bcdeABC
10 1.27±0.24efgFGH 85.91±1.98bcdefABC
11 1.51±0.12efgEFG 80.65±2.30defgCD
12 1.98±0.06deDEF 78.46±1.49fgCD
13 1.21±0.21fgFGH 79.92±4.76efgCD
14 1.18±0.34fgFGH 73.61±2.55gD
15 0.85±0.06ghGH 85.66±2.83bcdefABC
16 3.90±0.17bB 80.65±0.74defgCD
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x+ÅAü¥)ÉuhãR}Éu
(犘<0.05);æåà
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(犘<0.01)。
Note:Aldataarethemeanvalueofeachtreatment±standard
error.Differentlowercaselettersdenotesignificantdifference(犘<
0.05)ineachcolumn;Differentcapitallettersdenotehighlysignifi
cantdifference(犘<0.01)ineachcolumn.Thesameasbelow
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Table3 Intuitiveanalysesofeffectofdifferenttreatmentsonyieldandviabilityin犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿protoplasts
Éu
Level
M(¥£ R10
CelulaseR10(W/V)
K£R10
MacerozymeR10(W/V)
pH
DÆfê
DMannitol
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Digestiontime
K1/×106cels·gFW-1 2.668±0.111aA 1.827±0.070cB 2.086±0.141bA 2.118±0.065bB 1.099±0.107dC
K2/×106cels·gFW-1 2.782±0.156aA 2.261±0.069bAB 2.211±0.087abA 2.163±0.057bAB 4.152±0.085aA
K3/×106cels·gFW-1 2.131±0.032bB 2.669±0.157aA 2.553±0.056aA 2.633±0.130aAB 2.284±0.187bB
K4/×106cels·gFW-1 1.787±0.183cB 2.611±0.093aA 2.517±0.141aA 2.455±0.087abA 1.832±0.134cB
犚犽/×106cels·gFW-1 0.995 0.842 0.457 0.515 3.053
L1/% 88.052±1.206aA 85.807±0.381aA 84.847±0.660aA 83.862±1.145aA 88.605±0.374aA
L2/% 85.172±0.340abAB 83.496±1.167abA 84.115±0.383aA 84.945±0.711aA 86.932±0.727aA
L3/% 83.089±0.257bcBC 84.909±1.137abA 83.437±0.439aA 83.122±0.805aA 81.607±2.093bB
L4/% 79.957±1.978cC 82.058±0.791bA 83.872±2.775aA 84.342±1.929aA 79.127±1.331bB
犚犔/% 8.095 3.749 1.410 2.823 9.478
:K+ÅûñÀ2Í"f)ü¥Ë5ÉuIvð;L+ÅûñÀ2!.f)ü¥ÉuIvð。犚犓 j犚犔 J*+ÅÍ"j
!.I9ã
Note:Kmeanvalueofprotoplastyieldatdifferentlevelsineachfactor;Lmeanvalueofprotoplastviabilityatdifferentlevelsineachfac
tor;犚犓and犚犔representrangesofyieldandviability,respectively
<2 À.ñòÁï*ÎÑÂ/rÓoÔÕ
Fig.2 Effectsofdifferentenzymolysistimeson犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿protoplastsisolation(stainedbyevansblue)
:A:£Ý2h(Ë51,40×);B:£Ý4h(Ë52,40×);C:£Ý6h(Ë53,40×);D:£Ý6h(Ë54,40×)
Note:A:2henzymaticdigestion(TreatmentNo.1,40×);B:4henzymaticdigestion(TreatmentNo.2,40×);
C:6henzymaticdigestion(TreatmentNo.3,40×);D:8henzymaticdigestion(TreatmentNo.4,40×)
2.1.2 ½²³´Y¹@|qz{ Ý+4vÀ,
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Table4 Varianceanalysisofeffectofdifferenttreatmentsonyieldandviabilityin犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿protoplasts
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Source
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犉Value
犘ð
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7.833 3 2.611 15.324 0.000
K£
Macerozyme
5.418 3 1.806 10.598 0.000
Í" Yield pH 1.899 3 0.633 3.716 0.021
Æfê
Mannitol
2.157 3 0.719 4.220 0.013
£Ýh
Digestiontime
60.990 3 20.330 119.312 0.000
M(¥£
Celulase
419.488 3 139.829 9.120 0.000
K£
Macerozyme
97.195 3 32.398 2.113 0.118
!. Viability pH 12.563 3 4.188 0.273 0.844
Æfê
Mannitol
21.367 3 7.122 0.465 0.709
£Ýh
Digestiontime
711.176 3 237.059 15.461 0.000
2.2 PEGRoï*ÎÑÂ/)
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pUTL2mCherry(É10μg):; PEGp³}
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Table5 TransformationefficiencyofpUTL2mCherryandpAN580GFPto犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿protoplasts
2
Vector
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Thefieldof
microscope
ûñÀ2AG
Thenumberof
protoplasts/cels
ô=IûñÀ2G
Thenumberoffluorescent
protoplasts/cels
}\>æ
Transformation
efficiency/%
1 42 34
pUTL2mCherry 2 36 24 77.47±5.51aA
3 46 39
1 24 3
pAN580GFP 2 36 5 11.24±2.00bB
3 41 3
1 19 2
pUTL2mCherry+pAN580GFP 2 46 4 8.79±0.98bB
3 42 3
675
!3# p ö:XTÄ]ûñÀ2JQ2ü<+}ÌÍ
<3 狆犝犜犔2犿犆犺犲狉狉狔狆犃犖580犌犉犘Â$¶ï*ÎÑÂ/;oðñqÑ
Fig.3 TransientexpressionofpUTL2mCherryandpAN580GFPin犘.狆狌狉狆狌狉犲狌犿protoplasts
:A:pUTL2mCherryI<+};B:pAN580EGFPI<+};C:pUTL2mCherryjpAN580EGFPI+};
Cherry:ô=ëÒ6U;GFP:ñô=ëÒ6U;Bright:;Merged:ènâ.I`ú
Note:A:TransientexpressionofpUTL2mCherry;B:TransientexpressionofpAN580EGFP;
C:CoexpressionofpUTL2mCherryandpAN580EGFP;Cherry:Signalofredfluorescentprotein;
GFP:Signalofgreenfluorescentprotein;Bright:Brightfield;Merged:Overlappingofalleftphotos
<pUTL2mCherryjpAN580EGFP5W
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0.6mol·L-1[2,24],É¿0.4~0.6mol·L-1[5,10,24]。
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