全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 01-0030-04
蒙农杂种冰草成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生
张　辉1 ,魏建华2 ,霍秀文1,徐春波1,米福贵1* ,云锦凤1*
( 1. 内蒙古农业大学, 呼和浩特 010018; 2. 北京农业生物技术研究中心,北京 100089)
摘要: 以蒙农杂种冰草成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织的诱导进行植株再生, 结果表明: 在附加甘露醇( 0. 2 mo l/ L )
和 2, 4-D( 2. 0 mg / L )的 MS 培养基中, 冰草成熟胚可诱导产生愈伤组织, 诱导率为87. 6% , 但质量较差;将其在降低2, 4-
D 浓度和添加6-BA 的继代培养基中继代改造, 可明显改善愈伤组织质量,增加胚性愈伤; 将筛选改良的愈伤组织置于分
化培养基 MS + ZT ( 3. 0 mg / L ) + NAA( 1. 0 mg / L )中, 分化率为 82% ; 分化小苗在 1/ 2 MS 培养基上可生根并得到完整
植株。本研究还建立了一套有效的以成熟胚为外植体的蒙农杂种冰草组织培养再生体系。
关键词: 蒙农杂种冰草;成熟胚; 愈伤组织;植株再生
中图分类号: Q943. 1　　　文献标识码: A
A Study on the Induction of Embryogenic Callus and Plant Regeneration
from Mature Embryos of Agropyron cristatum×
Agropyron desertorum cv. Mengnong
ZHANG Hui1, WEI Jian-hua2 , HUO Xiu-wen1, XU Chun-bo1 , M I Fu-gui1* , YU N Jin-feng 1*
( 1. Inner M ongo lia Agr icult ur e Univ ersity , Huhhot , Inner Mongo lia Autonomous Reg ion 010018, China;
2. Beijing Center of Agro-Biotechnolog y , Beijing 100089, China)
Abstract: A study using the mature embryos of wheatg rass ( A gropy ron cr istatum×A gropy ron desertorum cv .
M engnong) as t ransplants and embryogenic callus induct ion to reg enerate plants shows that the callus could be
induced from mature embryo s with a f requency of 87. 6% on the MS + mannite ( 0. 2 mo l/ L ) + 2, 4-D( 2. 0 mg /
L ) medium , though the quality of the callus is poor. Subcultured on the medium w ith r educed 2, 4-D and 6-BA
added, the quality o f the callus could be improved and the embryogenic callus increased. Taking M S+ ZT ( 3. 0
mg / L ) + NAA ( 1. 0 mg/ L ) as the medium for different iat ion, the dist inguishing rate o f improved callus reaches
82%. On the 1/ 2 MS medium free of hormone, plant lets develop r oots and become complete plants. An
effect iv e system of w heatg rass ( A . cristatum×A . d esertorum cv . M engnong ) reg enerat ion f rom mature embryos
has been developed.
Key words : Wheatg rass ( A gropy ron cristatum×A . desertorum cv. M engnong ) ; M atur e embryo; Embryogenic
callus; P lant reg enerat ion
　　冰草属( A gr opyr on Gaertn. )牧草在全世界约有
15 个种,是典型的旱生植物, 具有适应性强、抗旱耐
寒、耐风沙、根系发达、分枝能力强等特点, 是我国北
方干旱、半干旱地区改良天然草场和建立人工草地的
适宜草种。蒙农杂种冰草 ( A gr opyr on cristatum ×
A gropy ron desertorum cv. M engnong )是优质的种间
杂种。近年来,使用幼胚与幼穗为外植体的冰草组织培
养技术有了一定的发展,但冰草生育期中适合取幼穗、
幼胚的时间很短, 不同材料间存在生育期差异, 且播种
受季节限制, 冰草组织培养技术的研究和应用受到一
定的局限。与根、茎、叶相比,冰草成熟胚为较适宜的外
植体, 具有不同个体间生理状况相似、取材方便、不受
季节时间限制、可大量获得等优点,一直被科研工作者
所关心,但进展很慢[ 1～4] , 且国内的研究报道极少。本
收稿日期: 2003-12-18; 修回日期: 2004-04-15
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项资助( J-2002-B-008)
作者简介:张辉 ( 1978-) ,男,内蒙古包头市人, 硕士研究生,研究方向为牧草种质资源与育种; * 通讯作者 Author for correspondence Email:
cs grass@ public. h h. nm. cn
第 13卷　第 1期
　Vo l. 13　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　 　2005 年　3 月
　M arch 　2005
研究探索了蒙农杂种冰草成熟胚诱导、分化再生植株
的方法,初步建立了离体再生体系,为新品种选育及基
因工程奠定了基础。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
1. 1. 1　植物名称　扁穗冰草( Agr opy ron cristatum )
与沙生冰草( Agr opy ron deser tor um )种间杂交种“蒙农
杂种冰草”,来源于内蒙古农业大学牧草种质资源圃,
为贮藏 3年的种子。
1. 1. 2　外植体　成熟胚。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　培养基
愈伤组织诱导培养基: M SM 培养基 ( M SM 即
MS培养基附加 0. 2 mol/ L 甘露醇)附加不同浓度的
2, 4-D和W14[ 5]培养基附加不同浓度的 2, 4-D。
分化培养基: M S 培养基附加不同浓度的 ZT 和
NAA。
生根培养基: 1/ 2 M S 培养基附加不同浓度的
NAA。
琼脂浓度为 0. 7%, M SM 和W14 , 培养基的蔗糖
浓度分别为 3%和 10% , pH 值 5. 8。
1. 2. 2　成熟胚愈伤组织的诱导
将种子在室温下用水浸泡 4 h 后, 剥去内外稃, 再
放在湿的滤纸上吸胀 1 h。在超净工作台上用 75%酒
精消毒 30 s,无菌水冲洗数次(至少 3 次)后用 0. 2%
升汞表面消毒 5 min, 再用无菌水冲洗数次 (至少 3
次)。置于铺有湿的无菌滤纸的培养皿中, 用解剖针从
盾片处挑出成熟胚(尽量少带胚乳)。在剥取胚时适当
将胚夹破,接种在愈伤组织诱导培养基上, 26℃暗培养
10～15 d。
1. 2. 3　愈伤组织的继代改造
经过 10～15 d的暗培养,诱导出的愈伤组织转继
到降低 2, 4-D浓度并附加适量 6-BA 的 MSM 培养基
(蔗糖浓度 3% ,琼脂浓度 0. 7% ) ,继代 2次,继代间隔
为 20 d。在 26℃下 16 h 光照培养,光照强度 3000～
4000 lx。
1. 2. 4　愈伤组织的植株再生
将致密愈伤组织转入附加不同浓度 ZT 和 NAA
的分化培养基上进行分化。培养条件为26℃下 16 h 光
照培养,光照强度为 3000～4000 lx。分化小苗转入生
根培养基上, 生根后移栽到花盆中。
2　结果与分析
2. 1　供试培养基对愈伤组织诱导的影响
2. 1. 1　成熟胚接种到培养基上, 在黑暗条件下培养
4～5 d胚开始膨大, 7～12 d 形成无色透明的愈伤组
织, 20 d 左右达到出愈高峰(表 1)。成熟胚接种 15 d
后, 以 MS 或W14为基本培养基的愈伤组织诱导培养
基均能诱导出愈伤组织,但诱导率及愈伤质量各异。前
者的出愈率较高,平均为 81. 8% ;后者仅 72. 2%。前者
愈伤组织的质量优于后者。
2. 1. 2　MSM 附加不同浓度 2, 4-D 的培养基诱导的
愈伤组织相对较为紧实, W14培养基的愈伤组织结构
无定型、水质、柔软。在 MSM 培养基中, 2, 4-D 低于
2. 0 mg / L 时,愈伤诱导率均较低, 浓度在 2. 0～5. 0
mg / L 时,诱导率显著增加, 但不同浓度的 2, 4-D之间
差别明显减小, 为 87. 6%～93. 4%。虽然提高 2, 4-D
浓度有利于成熟胚脱分化与诱导愈伤组织,但高浓度
2, 4-D将抑制愈伤组织芽的分化。综合考虑愈伤诱导
与分化两个因素, 本研究确定使用 MSM 培养基附加
2, 4-D( 2. 0 mg/ L )为蒙农杂种冰草成熟胚愈伤组织诱
导培养基(表 1)。
表 1　供试培养基对成熟胚愈伤组织诱导的影响
Table 1　Effect of differ ent mediums on callus induction o f mature embryo s
培养基( mg/ L)
M edium ( mg/ L)
接种数
No. of embryo cul tu red
形成愈伤
No. of cal lus produced
愈伤组织诱导率
Fr equency of induct ion( % )
愈伤状态
S tate of cal lus
MSM + 2, 4-D( 0. 5) 102 62 60. 8 较紧实、有褶皱 Compact and w rink led
MSM + 2, 4-D( 1. 0) 106 74 69. 8 较紧实、有褶皱 Compact and w rink led
MSM + 2, 4-D( 2. 0) 105 92 87. 6 较紧实、有褶皱 Compact and w rink led
MSM + 2, 4-D( 3. 0) 110 98 89. 1 较紧实、有褶皱 Compact and w rink led
MSM + 2, 4-D( 4. 0) 111 100 90. 1 较紧实、有褶皱 Compact and w rink led
MSM + 2, 4-D( 5. 0) 107 100 93. 4 较紧实、有褶皱 Compact and w rink led
W 14+ 2, 4-D( 0. 5) 109 58 53. 2 柔软,水浸棉絮状 S og gy and sof t
W 14+ 2, 4-D( 1. 0) 115 69 60. 0 柔软,水浸棉絮状 S og gy and sof t
W 14+ 2, 4-D( 2. 0) 106 78 73. 6 柔软,水浸棉絮状 S og gy and sof t
W 14+ 2, 4-D( 3. 0) 114 85 74. 6 柔软,水浸棉絮状 S og gy and sof t
W 14+ 2, 4-D( 4. 0) 116 94 81. 0 柔软,水浸棉絮状 S og gy and sof t
W 14+ 2, 4-D( 5. 0) 108 98 90. 7 柔软,水浸棉絮状 S og gy and sof t
31第 1期 张辉等:蒙农杂种冰草成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生研究
2. 2　继代改造培养基对愈伤组织发生和分化的影响
当成熟胚经过 15 d的暗培养后,形成的愈伤组织
大多为白色透明状, 质地较柔软, 有的呈水浸棉絮状
(图 1-A ) ,这种愈伤组织在各种分化培养基中很难分
化成苗,本实验称之为初生愈伤组织。将其转继到实验
设计的 6种继代培养基上(表 2) , 经过 2 次( 20 d 一
次)继代培养,部分愈伤组织转化为淡黄色、质地致密、
颗粒状愈伤组织(图 1-B)。在分化培养基中可分化成
苗,本实验称之为胚性愈伤组织。1、2号培养基中虽然
降低了 2, 4-D 浓度,但不含 6-BA,胚性愈伤组织的发
生率较低。在此基础上向培养基中添加不同浓度的 6-
BA ,胚性愈伤组织的发生率明显提高, 6 号培养基中
改良愈伤组织的发生率为 30. 4%。
图 1　蒙农杂种冰草植株再生过程
F ig . 1　Pictur es showing A . cristatum×A . deser torum cv. M engnong during the cour se of plant r egener ation
A:在诱导培养基上接种 15 d后的初生愈伤组织; B:在继代培养基上改良的愈伤组织;
C :在分化培养基上分化形成再生植株; D :再生苗移栽
A. Th e induced primary callus on the in duct ion medium inoculated after 15 days;
B. T he improved cal lus on the su bcul ture medium; C. Regener ated plant on th e different iat ion m edium ;
D. Transplanted the reg enerated plan t in pot
表 2　继代改造培养基对胚性愈伤组织发生的影响
Table 2　Effect o f different im proved subculture media on em bryogenic callus induction
培养基编号
Medium No
2, 4-D
( mg/ L)
6-BA
(m g/ L)
初生愈伤组织数
No. of primary cal lus
胚性愈伤组织数
No. of em bryogen ic callus
胚性愈伤组织发生率
In duct ion fr equency of em bryogen ic callus ( % )
1 0. 5 0 110 6 5. 4
2 1. 0 0 125 8 6. 4
3 0. 5 0. 5 116 15 12. 9
4 0. 5 1. 0 126 24 19. 0
5 1. 0 0. 5 121 30 24. 8
6 1. 0 1. 0 102 31 30. 4
2. 3　激素配比对胚性愈伤组织分化的影响
选择改造后色泽鲜亮块状的愈伤组织置于 MS 附
加不同浓度 KT、6-BA、ZT 和 NAA 的培养基上,研究
不同组合对愈伤组织分化的影响。未经改造的冰草成
熟胚愈伤组织尽管继代多次, 使用各种激素配比的分
化培养基中只有极少数能分化出植株(数据略) ; 而改
造过的胚性愈伤组织在含有适宜浓度 ZT、6-BA、KT
和 NAA 的培养基上, 多数能分化出绿色小苗, 但以
ZT ( 3. 0 mg/ L ) + NAA( 1. 0 mg/ L )配比最为合适, 分
化率达 82%(表 3)。
表 3　6-BA、KT、ZT和 NAA 的不同配比对胚性愈伤组织分化的影响
Table 3　T he effect of differ ent combinations o f 6-BA , KT , ZT and NAA on regener ation of embryogenic callus
6-BA
( mg/ L )
KT
( mg/ L)
ZT
(m g/ L)
NAA
( mg /L )
接种的愈伤组织数
No. of inoculated
embr yog enic cal lus
分化的愈伤组织数
No. of embryogenic
callus diff erent iated
分化率(% )
Different iat ion
f requ ency( % )
1. 0 0 0 1. 0 50 14 28
2. 0 0 0 1. 0 50 18 36
3. 0 0 0 1. 0 50 28 56
5. 0 0 0 1. 0 50 35 75
0 1. 0 0 1. 0 50 35 75
0 2. 0 0 1. 0 50 19 38
0 3. 0 0 1. 0 50 30 60
0 5. 0 0 1. 0 50 36 72
0 0 1. 0 1. 0 50 19 38
0 0 2. 0 1. 0 50 28 56
0 0 3. 0 1. 0 50 41 82
0 0 5. 0 1. 0 50 41 82
32 草　地　学　报 第 13卷
2. 4　再生植株的生根和移栽
当芽长到 4 cm 时, 取健壮植株转到生根培养基
上,结果所有的植株都能正常生长并形成完整小植株,
一周后,即诱导出根, 10 d后每株可长出 3～5条根, 根
长 3～4 cm ,再培养一周则植株健壮, 叶色浓绿(图 1-
C) ,这时可移栽。移裁前先去掉封瓶膜,往瓶中加入适
量自来水,室温炼苗 2～3 d 后, 用自来水将根部所带
的培养基冲掉,移栽到灭菌的蛭石和草碳土( 1∶1)中。
在相对湿度为 60%的环境下, 蒙农杂种冰草的移栽成
活率可以保持在 96%以上(图 1-D)。
3　讨论与结论
3. 1　在成熟种子愈伤组织的诱导过程中, 对不同植物
成熟种子的处理方式不同, 如去除种皮、去胚乳等方
式,来提高愈伤诱导率,缩短诱导时间 [ 4, 6]。冰草成熟种
子在组织培养过程中会受其所带胚乳的影响。种子的
胚乳量越少, 始愈期越早, 愈伤组织的胚性越强, 分化
率越高。反之,则始愈期推迟,虽然愈伤组织的出愈速
度、早期愈伤组织生长速度加快,但后期愈伤组织的生
长速度下降越快, 受胚乳代谢残留物质的毒害越强, 愈
伤组织的分化能力越弱。本研究用解剖针从盾片处挑
出成熟胚,尽量少带胚乳, 一方面使其诱导时间缩短,
另一方面诱导率提高。
3. 2　试验结果表明,解决冰草组织培养困难的关键是
获得的高质量的胚性愈伤组织。禾本科植物的愈伤组
织质量间差异明显,根据形态主要可分为 4种类型: 第
1类生长迅速结构致密,颗粒小;第 2类生长迅速质地
疏松;第 3类生长缓慢,结构致密;第 4类松软无定型、
成果冻状或棉絮状 [ 7]。冰草的初生愈伤组织主要属第
4类, 即松软无定呈棉絮状。为了加快胚性愈伤组织形
成的速度, 必须对其状态进行调整, 使之向 1、2 型转
化。之后,经 1～2个月的继代培养才能产生致密的胚
性愈伤组织。随着继代培养次数的增加愈伤的分化率
降低。愈伤组织及其细胞的状态可通过调整培养基成
分来调控。其中生长素、还原态氮和 KCl可促进愈伤
组织生长;细胞分裂素、硝态氮则抑制愈伤组织生长,
利用不同水平的 2, 4-D、NH+4 、谷氨酰胺、水解酪蛋白、
KCl、KT、6-BA、NO -3 等进行处理,可使不适的愈伤组
织变成适宜的类型, 也可使那些生长过旺而不分化的
愈伤组织分化出植株[ 8]。本研究在成熟胚初生愈伤组
织的继代过程中, 通过降低培养基中 2, 4-D的浓度,
并加入适宜浓度的 6-BA, 创造了适合胚性愈伤组织发
生的外界培养环境, 使致密或疏松的颗粒状胚性愈伤
组织的发生率提高, 从而实现了冰草成熟胚愈伤组织
再生绿色植株。该结果与佘建明得出的结论类似[ 9]。在
继代培养中, 精心选择胚性愈伤组织也是实验成功的
关键之一。
3. 3　本研究对应用组织培养技术和基因工程进行冰
草属植物遗传育种具有一定的意义。
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生技术的研究[ J ] .草地学报, 2003, 11( 1) : 58-62
·更　正·
本刊 2004年第 4期 343页“牧草与饲料作物新品种”一文中“热研 13号柱花草”的学名由作者提出更正: 原
学名 Stylo santhes guianensis cv. Reyan No. 13,更正为 Stylosanthes sympodialis cv. Reyan No. 13。
33第 1期 张辉等:蒙农杂种冰草成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生研究