全 文 ：第 17 卷
第 2 期

Vol. 17
No . 2
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
3 月

Mar .

2009
草地早熟禾午夜 2号植株再生研究
马晖玲1, 2, 3 , 赵小强1, 2, 3 , 周万海1, 2, 3, 吴
翔1, 2, 3
( 1.甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州
730070; 2.草业生态系统教育部重点实验室, 甘肃 兰州
730070;
3.中- 美草地畜牧业可持续研究中心, 甘肃 兰州
730070)
摘要:以草地早熟禾( Poa p ratensis L . )品种午夜 2 号成熟种子为外植体,进行植株再生研究, 建立高频再生体系,
为草地早熟禾进行原生质体培养和细胞融合奠定基础。结果表明: 诱导愈伤组织的最佳培养基为 M S+ 2, 4
D( 1
mg/ L) + 6
BA( 0. 1 mg/ L ) + 3%蔗糖+ 0. 7%琼脂, 其诱导率为 52. 3% ;最佳继代培养基为 MS+ 2, 4
D( 1 mg / L ) +
6
BA( 0. 3 mg / L ) + 3%蔗糖+ 0. 7%琼脂; 最佳分化培养基为 MS+ NAA( 0. 5 mg/ L) + 6
BA( 1 mg/ L) + 3%蔗糖
+ 0. 6%琼脂、分化率为 57. 5% ;生根培养基同分化培养基, 供体材料经 100 d的培养后获得再生植株。
关键词:草地早熟禾; 愈伤组织;植株再生
中图分类号: Q943




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 02
0193
04
Study on Plant Regeneration from Midnight

MA Hui
ling 1, 2, 3 , ZHAO Xiao
qiang1, 2, 3 , ZHOU Wan
hai1, 2, 3 , WU Xiang1, 2, 3
( 1. Pratacul tu ral College, Gan su Agricultu ral University, Lan zhou, Gansu Province 730070, China;
2. Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Minist ry of E ducation , Lanzhou, Gan su Pr ovin ce 730070, Ch ina;
3. Sin o
U. S . Center for Grazingland Ecosys tem Sustainabilit y, Lanzhou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: In order to establish the basis for protoplast culture and cel l fusion of Poa p r atensi s L. , the plant
regenerat ion w as studied using the mature seeds of Midnight
as explants. Results indicate that the opt i

mal cal lus inducement medium was M S+ 1 mg/ L 2, 4
D+ 0. 1 mg/ L 6
BA + 3% sucrose+ 0. 7% agar and
the callus inducement rate w as 52. 3%; the best medium of subculture w as MS+ 1 mg/ L 2, 4
D+ 0.3 mg/ L 6
BA
+ 3% sucrose+ 0. 7% agar; the best medium of differ ent iat ion w as M S+ 0. 5 mg / L NAA + 1 mg/ L 6
BA
+ 3% sucrose+ 0. 6% agar and the callus dif ferent iat ion rate w as 57. 5% . T he ro ot ing medium was the
same as the medium of different iat ion. 100 d was needed to obtain the regenerated plant let f rom donor ma

terials.
Key words: Poa p ratensi s L. ; Callus; P lant r eg enerat ion


草地早熟禾 ( Poa p r atensis L. )是禾本科早熟
禾属的一种优质冷季型草坪草, 在我国北方地区多
作为建坪草种。但草地早熟禾有一些突出的缺点 ,
如生长缓慢、叶量少、易感病、不抗虫、耐高温性能
差、季节变换时易变黄、抗旱力不强等[ 1]。而草地早
熟禾品种午夜 2号绿期长,春季返青早、叶色呈深绿
色、生长低矮、耐低修剪、耐践踏、抗磨损、相对抗旱
力和耐寒性较强、耐热性和耐荫性极强、具有较高的
综合抗病力、节水、节肥、养护成本低,应用广泛。


本研究以草地早熟禾午夜 2号的成熟种子为试
验材料, 探索不同外源激素对愈伤组织的诱导、愈
伤的分化及其对愈伤组织在继代培养过程中再生植
株能力的影响,建立高频再生体系,为进一步应用生
物技术进行草地早熟禾品种改良奠定研究基础。
1
材料和方法
1. 1
供试材料
草地早熟禾品种午夜 2 号 ( Poa p ratensis L.
cv. Midnight
)种子由北京克劳沃集团提供。
收稿日期: 2008
04
09;修回日期: 2008
10
10
基金项目:甘肃农业大学草业学院草业科学国家级重点学科学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省部共建重点实验室资助项目
( CY
GG
2006
10) ;甘肃省教育厅项目( 0702
03)
作者简介:马晖玲( 1966
) ,女,回族,甘肃兰州人,教授,博士,主要从事草坪草、牧草育种研究, E
mail: mahl@ gsau. edu. cn
草
地
学
报 第 17卷
1. 2
研究方法
1. 2. 1
外植体处理
试验于 2007 年 7 月至 10 月
中旬进行。选取午夜 2 号成熟种子,室温下在小瓶
中先浸泡 24 h,再用清水冲走漂浮在液面上的瘪种
子。然后用纱布包裹。在超净工作台中将包裹好的
种子以 70%酒精表面消毒 2~ 3 min,用无菌水冲洗
2~ 3次,再用 0. 1%升汞溶液进一步消毒 10 m in,
同时不断震荡, 用无菌水冲洗 3~ 5次。最后用双层
无菌滤纸吸干。
1. 2. 2
愈伤组织诱导
在超净工作台中,将已灭菌
的种子接种于 MS+ 30 g / L 蔗糖+ 7% 琼脂+ 不同
激素的基本培养基上, 激素采用 2, 4
D和6
BA。2,
4
D 的浓度梯度设为: 1 mg/ L、2 mg/ L、3 mg/ L、
4 mg/ L、5 mg/ L。6
BA的浓度梯度设为: 0 mg/ L、
0. 1 mg/ L、0. 2 mg/ L、0. 3 mg/ L。每个皿中接种 50
粒种子。每个组合设定 10个重复。愈伤组织的诱
导在 25
1
黑暗条件下进行, 每隔 1 周观察和记
录愈和生长情况,统计不同激素浓度组合愈伤组织
诱导率。愈伤组织的诱导率( %) = (愈伤组织数/接
种外植体总数)
100%。
1. 2. 3
愈伤组织的继代培养
6 周后将诱导的愈
伤组织转移到继代培养基(根据诱导愈伤组织的生
长状态来选择)上进行继代,每隔 1周观察生长情况
并记录。20 d继代1次, 培养条件同诱导条件,继代
2~ 3次。
1. 2. 4
植株再生
选择胚性较好(外观呈淡黄色或
鲜黄色颗粒型,质地较紧密,细胞等径、壁薄、质浓、
分裂旺盛)的愈伤组织接种到分化培养基上进行分
化。培养基为: MS+ 30 g/ L 蔗糖+ 6%琼脂+ 不同
激素( 0. 5 mg / LNAA 和不同浓度6
BA进行正交组
合) , pH = 5. 8, 每个组合 4 个重复。6
BA 的浓度
梯度设为: 0. 1 mg/ L、0. 3 mg/ L、1 mg/ L、2 mg/ L、
3 mg/ L。观察愈伤组织的分化情况并统计出现的
芽点数。培养条件: 16 h 光照, 8 h 暗照, 光强度
2000 Lx, 温度为 25
1
。20 天后统计绿色芽点
率,绿芽率= (绿芽的愈伤数/愈伤总数)
100%。
40天后统计出苗率,出苗率= (出苗的愈伤数/愈伤
总数)
100%。并同时观察开始生根时间和根的生
长形态。生根培养基同最佳分化培养基, 待其长成
完整植株再练苗后移入花盆。
2
结果与分析
2. 1
愈伤组织的诱导
在愈伤组织诱导试验中,以 MS 为基本培养基,
经不同激素及其浓度配比的处理,诱导出的愈伤组
织在长势、质地、诱导率等方面差异较大, 但愈伤组
织出现的时间,各处理间差异不明显。
2. 1. 1
不同 2, 4
D浓度对草地早熟禾愈伤组织诱
导的影响
在培养基中只附加不同浓度的 2, 4
D。
培养 4周后,统计愈伤组织的诱导率,发现不同浓度
的 2, 4
D处理下,草地早熟禾品种午夜 2 号愈伤组
织的诱导率和愈伤组织质量存在着很大的差异(表
1)。其中当 2, 4
D的质量浓度为 3 mg / L 时,午夜2
号的愈伤组织诱导率达到最高,为 31. 2%。当 2, 4

D的质量浓度高于 3 mg / L 时, 午夜 2 号的愈伤组
织诱导率逐渐下降。由此可见, 3 mg/ L 2, 4
D 是午
夜 2号愈伤组织诱导的最佳激素处理,当 2, 4
D 浓
度高于3 mg/ L 对愈伤组织的诱导有抑制作用。
2. 1. 2
不同浓度的 2, 4
D 和 6
BA 组合对草地早
熟禾愈伤组织诱导的影响
在 MS培养基中附加不
同浓度的 2, 4
D和 6
BA,愈伤组织诱导率和质量也
有很大的差异(表 1)。从表 1可以看出,在 1 mg / L
2, 4
D和 0. 1 mg / L 6
BA 配合处理下午夜2号的愈
伤组织诱导率可达到 52. 3% ,虽在 1 mg / L 2, 4
D
+ 0. 1 mg / L 6
BA 配合处理下愈伤组织诱导率最
高,但愈伤组织的长势、质量在 1 mg/ L 2, 4
D+
0. 3 mg/ L 6
BA 处理下达到最佳状态。
2. 2
愈伤组织的继代培养
虽说愈伤组织的诱导率在 1 mg / L 2, 4
D +
0. 1 mg/ L 6
BA 组合处理下比较高, 但是其质量不
如 1 mg / L 2, 4
D+ 0. 3 mg/ L 6
BA 组合处理下好
(淡黄色、干燥、紧密、颗粒状)。所以,对午夜 2号愈
伤组织进行继代培养时可选取 1 mg/ L 2, 4
D+
0. 3 mg/ L 6
BA 组合处理,这样可以有效地改善愈
伤组织生长的条件,增强其胚性。
2. 3
愈伤组织分化出苗
愈伤组织在继代培养基上继代两次后, 转到分
化培养基中进行分化培养。20天后愈伤组织出现
绿色芽点。从表 2可以看出,在不同的分化培养基
上出苗率明显不同, 不同激素及其浓度配比可能导
致不同的愈伤组织分化率。
3
讨论与结论
3. 1
选择不同外植体的优劣评价
建立草地早熟禾体细胞胚离体培养再生体系研
究中, Van derValk[ 2] 、Shanqiang[ 3] 、马忠华 [ 1] 等人
194
第 2期 马晖玲等:草地早熟禾午夜 2号植株再生研究
表 1
不同激素及浓度组合对午夜 2号愈伤组织诱导的影响
T able 1
Effect of differ ent hormones and their concent rations on callus induction of M idnight

激素处理( mg/ L)


H ormon e


愈伤组织数
Callus no.
诱导率( % )
Callus inducement rat io
愈伤质量






Cal lus qualit y






2, 4
D ( 1. 0) 110 27. 5 疏松,乳白色 Loose, mi lky w hite
2, 4
D ( 2. 0) 122 30. 5 致密,淡黄色 Dense, primrose yellow
2, 4
D ( 3. 0) 125 31. 2 较致密,淡黄色 More den se, p rimrose yellow
2, 4
D ( 4. 0) 114 28. 4 致密,淡黄色 Dense, primrose yellow
2, 4
D ( 5. 0) 109 27. 3 疏松,乳白色 Loose, mi lky w hite
2, 4
D ( 1. 0) + 6
BA (0. 1) 209 52. 3 致密,淡黄色 Dense, primrose yellow
2, 4
D ( 1. 0) + 6
BA (0. 2) 159 39. 8 较致密,淡黄色 More den se, p rimrose yellow
2, 4
D ( 1. 0) + 6
BA (0. 3) 146 36. 5 较致密,淡黄色 More den se, p rimrose yellow
2, 4
D ( 2. 0) + 6
BA (0. 1) 99 24. 8 致密,淡黄色 Dense, primrose yellow
2, 4
D ( 2. 0) + 6
BA (0. 2) 35 8. 8 致密,淡黄色 Dense, primrose yellow
2, 4
D ( 2. 0) + 6
BA (0. 3) 122 30. 5 致密,淡黄色 Dense, primrose yellow
2, 4
D ( 3. 0) + 6
BA (0. 1) 101 25. 2 疏松,淡黄色 Loose, primrose yellow
2, 4
D ( 3. 0) + 6
BA (0. 2) 51 12. 7 疏松,乳白色 Loose, mi lky w hite
2, 4
D ( 3. 0) + 6
BA (0. 3) 93 23. 3 疏松,乳白色 Loose, mi lky w hite
2, 4
D ( 4. 0) + 6
BA (0. 1) 88 22. 0 疏松,乳白色 Loose, mi lky w hite
2, 4
D ( 4. 0) + 6
BA (0. 2) 41 10. 3 疏松,淡黄色 Loose, primrose yellow
2, 4
D ( 4. 0) + 6
BA (0. 3) 34 8. 5 较疏松,乳白色 Looser, m ilky w hite
2, 4
D ( 5. 0) + 6
BA (0. 1) 74 18. 5 疏松,淡黄色 Loose, primrose yellow
2, 4
D ( 5. 0) + 6
BA (0. 2) 44 11 疏松,淡黄色 Loose, primrose yellow
2, 4
D ( 5. 0) + 6
BA (0. 3) 45 11. 3 较疏松,乳白色 Loose, milky w hite


注:表中数据是在去除污染皿后统计所得
Note: data w ere derived after removing th e contaminated u tensil s
表 2
NAA和不同浓度 6
BA 配比对胚性愈伤组织分化的影响
T able 2
Effect of different combination o f NAA and 6
BA on regener ation o f embryogenic ca llus
NAA
mg/ L
6
BA
m g/ L
胚性愈伤组织数
Embryogenic callus n o.
分化的愈伤组织数
Dif feren tiat ion cal lus no.
愈伤组织分化率( % )
C allus diff erent iation rat io
0. 5 0. 1 40 8 20
0. 5 0. 3 40 13 32. 5
0. 5 1 40 23 57. 5
0. 5 3 39 19 48. 7
0. 5 5 38 18 47. 4
以幼穗为外植体诱导愈伤组织并获得了较高的诱导
率。虽说幼穗组织幼嫩、分生能力强,但是幼穗的取
材受季节的限制, 对试验造成一定的难度。成熟种
子诱导率比幼穗低,但它不受季节和植株发育时期
等因素的限制, 具有取材方便、操作简单等优点。因
此,被广泛的用作诱导愈伤组织首选外植体。
3. 2
不同的激素种类和浓度及其内、外源激素协同
作用对愈伤组织诱导的影响
在相关研究报道中, 对供体材料愈伤组织的诱
导多数选用 2, 4
D,并且, 2, 4
D 通常是起决定作用
的植物生长调节物质[ 4, 5]。其质量浓度为 1 ~ 5
mg/ L
[ 6] 。在本研究中, 单独使用 2, 4
D的情况与马
忠华[ 1] 的结论有较大的差异, 但与曲同宝 [ 7] 等人的
结论一致。选择不同的供体材料诱导愈伤组织时所
采用的激素种类和浓度是不同的,应根据不同的供
体材料选取适宜的激素处理条件。Vander Valk 等
人[ 2 ]的研究还表明, 采用肯塔基早熟禾成熟种子作
为外植体建立再生体系之后,作为比较试验,同时在
培养基中添加 6
BA,前者的愈伤组织诱导效果与比
较试验结果是一致的, 表明 6
BA 类物质可以提高
草地早熟禾的愈伤组织诱导率。这可能是草地早熟
禾细胞组织中含有内源细胞分裂素的原因[ 8]。因
此,在选择不同类型的供体材料进行细胞培养时,应
考虑材料本身的内源激素水平, 适当地加入外源激
素的种类和浓度, 调节至一个合适的比例,以此获得
细胞较高的分裂率和持续的分裂、生长状态。
3. 3
继代培养时间对植株再生的影响
胚性愈伤组织随着继代培养时间的延长,其植
株再生能力显著下降[ 3, 9] ,继代超过 3个月愈伤组织
丧失可植株再生能力[ 1] 。笔者选用表面干燥、致密、
颗粒状的愈伤组织进行继代培养, 愈伤组织在继代
过程中形态不发生变化,继代 1~ 2次的愈伤组织转
195
草
地
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报 第 17卷
移到分化培养基上后愈伤组织显示出较高的植株再
生能力;而继代 3~ 4次后再进行愈伤组织的分化培
养,发现愈伤组织丧失植株再生能力。而余建明
等[ 10]认为通过外源激素的调控可以长期保持愈伤
组织再生植株的能力,并且在继代培养过程中,早期
选择外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织是克服随着
着愈伤组织继代培养时间的延长植株再生能力显著
下降的一种简易、有效的方法。同时齐春晖等[ 11] 也
认为在继代时胚性愈伤组织的挑选与继代是重要的
环节。笔者在实验的过程中也添加了外源激素且在
继代时也选取了表面干燥、紧密、颗粒状愈伤组织,
但是当愈伤组织继代到第 3到第 4次时其分化能力
减弱甚至消失。这可能是由于基因型的不同或者愈
伤组织经长期的继代培养, 培养细胞丧失了分裂、再
生的能力。
图 1
午夜 2 号愈伤组织的诱导和植株再生
Fig . 1
Callus inducement and plantlet r egeneration of M idnight

A.诱导出愈伤组织
B.形成绿色芽点
C.分化出的幼苗
D.再生植株
E.再生植株的根系
F.移栽后的再生植株
A. Callus induced
B. Green shoot
bud format ion
C. Plant let dif feren tiat ion
D. Plant let regenerat ion
E. Root system of regenerated plants
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(责任编辑
才
杰)
196