全 文 ：第 18 卷 第 2 期
Vol. 18 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 3 月
Mar . 2010
2, 4D和 6BA组合配比对金达苜蓿
愈伤组织诱导与分化的影响
王晓春1, 师尚礼1 , 梁慧敏2* , 夏 阳3
( 1.甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州 730070; 2.江苏农林职业技术学院, 江苏 句容 212400;
3.山东省林业科学研究所, 山东 济南 250014)
摘要: 为了建立一个高效的金达苜蓿( Med icago sativa L. cv. Jinda)组织培养再生体系, 我们以金达苜蓿无菌苗的
胚轴上段、下段、子叶为外植体,进行了 2, 4D和 6BA不同组合配比对愈伤组织诱导和胚性愈伤组织及胚状体分
化的影响,这对其以后建立遗传转化体系具有重要的意义。结果表明:胚轴上、下段和子叶是很好的诱导愈伤组织
的外植体;在 MSO 胚状体诱导培养基上, 分化出胚性愈伤组织的最佳 2, 4D、6BA 剂量配比为 8: 0. 2, 成苗培养基
为 MSO+ 30 g / L 蔗糖+ 6 g/ L 琼脂。
关键词:金达苜蓿; 愈伤组织;胚状体; 诱导;分化
中图分类号: S541; Q943. 1 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2010) 02021904
Effect of Different Combinations and Concentrations of 2, 4D and 6BA on
Callus Induction and Differentiation of Medicago Sativa L. cv. Jinda
WANG Xiaochun1 , SH I Shangli1 , L IANG Huimin2* , XIA Yang3
( 1. C ol lege of Pratacultural Science, Gansu Agricul tu ral Un iversi ty, Lanzhou, Gansu provin ce 730070, C hina; 2. Jiangsu Polytechnic
College of Agricul tu re an d Forest ry, J urong, Jian gsu province 212400, China; 3. S handong Provincial
Acadey of Fores ry, J inan , Sh angdong province 250014, Chin a)
Abstract: T he upside and downside of hypocotyls and co ty ledon of M edicag o Sativa L. cv. Jinda w er e used
to study the effect of different concentrat ions of 2, 4D and 6BA on the callus induction and embryogenic
callus, embryoid dif ferentiat ion. T he results show ed that the upside and downside of hypocotyls, co ty le
don w ere good explants for Jinda. T he best combinat ions and concentrat ions of 2, 4D、6BA is 8/ 0. 2 in in
ducing embryo id medium M SO. T he best medium for plant development w as M SO + 30 g/ L sucrose + 6
g/ L agar . T he goal o f this research is to establish an effect ive regenerat ion sy stem of M edicag o Sativa L.
cv. Jinda. by t issue culture and it has important signif icance for establishing genet ic t ransfo rmat ion system.
Key words: M edicago Sativa L. ; Callus; Embryoid; Induct ion ; Differ ent iat ion
借助转基因技术提高苜蓿品质和抗逆性是牧草
苜蓿育种的重要途径之一, 建立一个良好的受体系
统是实现基因转化的先决条件。目前, 紫花苜蓿
(Medicago sat iv a L. )再生主要通过体胚发生途
径。研究表明, 胚状体发生与基因型有很大关系, 有
些品种再生较难, 而有些品种则较易再生[ 1 ~ 4]。体
细胞胚发生不仅具有普遍性[ 5] , 而且具有数量多、速
度快、结构完整的特点 [ 6, 7] , 是最为理想的基因转化
受体系统。
金达苜蓿(M edicago sat iv a L. cv. Jinda)是专
为公路护坡、果园绿化、葡萄园美化以及广场绿地专
门培育的一个新品种, 对土壤有较广的适应性, 在我
国西北、华北、东北、华东地区均可种植。是唯一一
种草坪型紫花苜蓿, 具有抗寒能力强,耐修剪,耐荫
性较强,叶片和紫花均一,坪观整齐美观等优点。在
绿化方向具有广阔的推广价值, 为了扩大和增加其
推广范围、价值,本实验的目的是要建立一个高效的
金达苜蓿组织培养体系, 从而为以后进行的苜蓿遗
传转化研究提供一个坚实的基础。目前尚无关于金达
苜蓿组培再生的任何报道。
收稿日期: 20090109;修回日期: 20100125
基金项目: 十一五国家科技支撑计划 ( 2006BAD01A19)、( 2006BAD04A0403)和( 2007BAD52B06)项目,农业部公益性行业(农业)科研
专项( nyhyz x07022)资助
作者简介:王晓春( 1982 ) ,女,汉族,硕士研究生,研究方向为牧草育种及种质资源。Email: xiaochun54@ 163. com; * 通讯作者 Auth or
for correspondence, Email: lian ghuimin 0218@ 126. com
草 地 学 报 第 18卷
1 材料与方法
1. 1 实验材料
金达苜蓿由百绿集团提供。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 种子消毒与接种培养 将苜蓿种子精选浸
泡约 2 h后,置于烧杯内在超净工作台上消毒,用灭
菌水冲洗。再用 70%酒精振荡消毒 40- 60 s, 灭菌
水冲洗。再用 0. 1%升汞振荡消毒 6- 8 m in, 灭菌
水多次冲洗,灭菌滤纸吸干种子表面的液体, 接种到
1/ 2M S培养基培养, 蔗糖浓度 3% , 琼脂 0. 6% ,
pH5. 8- 6. 0。
1. 2. 2 培养条件 光周期 16 h/ d, 光照强度 1000
- 2000 Ix , 昼夜温度 25 / 18 。pH5. 8- 6. 0 之
间。其中愈伤组织诱导遮光暗培, 胚状体分化弱光
培养。
1. 2. 3 愈伤组织诱导 取萌发 6- 8 d后子叶完全
展开、真叶尚未长出的种子幼苗胚轴上、下段( 2- 4
mm)和子叶(切成四周有伤口的 3- 5 mm2 小块)作
为外植体,采用改良 SH 为愈伤组织诱导基本培养
基,附加不同浓度的 2, 4D和 6BA。每种外植体接
种 22瓶, 每瓶接种 8个外植体。28 d 后在相同培养
基上继代,观察生长状态并统计计算愈伤诱导率(表1)。
表 1 不同外植体和不同激素配比影响下的愈伤组织诱导率
T able 1 The effect of different explant s, rat ios of differ ent concent rations on callus induct ion
2, 4D
mg/ L
6BA
m g/ L
接种数(块)
Inoculat ion
number
外植体的愈伤组织诱导率
Callus indu ct ion rat io of explant ( % )
胚轴上段
Th e upside of h ypocotyl
胚轴下段
T he dow nside of hypocotyl
子叶
Cotyledon
12 0. 2 176 94. 8 95. 7 86. 1
10 0. 5 176 95. 4 95. 6 87. 0
8 0. 2 176 95. 9 97. 0 87. 7
5 0. 5 176 96. 5 94. 2 89. 5
4 0. 2 176 96. 8 96. 7 85. 7
2 0. 2 176 100. 0 98. 0 91. 3
平均出愈率
Average ratios of in ducing callus ( % )
96. 6 96. 2 87. 9
愈伤诱导率( %) = 愈伤组织数/接种外植体总数 100
1. 2. 4 胚性愈伤组织与胚状体的诱导、分化 将诱
导 55- 60 d的愈伤组织分别转入不添加任何激素
的 MSO ( MS 大量、微量元素、铁盐+ B5有机) 培
养基, 30 d后转入原培养基,继续分化。
2 结果与分析
2. 1 愈伤组织的诱导
2. 1. 1 外植体对愈伤组织形成的影响 外植体的
选择是制备愈伤组织的重要环节, 实验结果反映(表
1) ,供试外植体的出愈率均在 85%以上,但不同外
植体出愈率有所差异。胚轴上、下段出愈率高于子
叶。由于外植体本身质地的不同, 胚轴上、下段在第
4 d整体开始膨大,在 15 d 之内就可以达到完全愈
伤化,但由于胚轴下段较上段粗壮且软,所以胚轴下
段更易于诱导, 且下段的愈伤组织比上段蓬松、软,
胚轴下段的平均诱导率略高于上段 0. 4%。子叶的
发育启动慢,在第 10 d才有黄色愈伤组织从四周伤
口处出现,并逐渐向中心扩展, 愈伤速度慢,愈伤化
程度不一致, 要达到完全愈伤化约需要 35 d, 但有
75%的愈伤块质量较好,其余 25%的愈伤块中心干
褐, 4周已愈伤化的可以继续分化, 不影响整个愈伤
块。另据实验观察, 子叶已完全愈伤的组织与胚轴
上、下段的愈伤组织没有区别。
2. 1. 2 2, 4D和 6BA 浓度组合配比对愈伤组织诱
导的影响 从表 1 结果反映出, 2, 4D 各浓度结合
低浓度 6BA 处理组合, 能很好促进苜蓿外植体的
脱分化,易于诱导出愈伤组织, 对胚轴上、下段出愈
率影响尤为明显。在供试激素的 6个浓度处理组合
下,第一次继代时,胚轴上、下段愈伤已发育为直径
超过 1 cm、高 0. 5 cm 的蓬松团; 第二次继代时, 愈
伤团直径已达 2 cm、高 1 cm, 颜色较第一次继代更
加亮黄。在所处理的 2, 4D 与 6BA 组合配比中,
当其剂量比值为 2/ 0. 2和 5/ 0. 5时,其愈伤速度最
快,子叶诱导率约为 90% ,高于其他组合配比,且子
叶完全愈伤化程度也高于其他组合。在所有组合诱
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第 2期 王晓春等: 2, 4D和 6BA组合配比对金达苜蓿愈伤组织诱导与分化的影响
导出的愈伤团中, 12/ 0. 2, 8/ 0. 2诱导出的愈伤团较
其他组合的黏。
2. 2 2, 4D和 6BA浓度组合配比对愈伤组织分化
的影响
2, 4D 与 6BA 组合一般不能直接诱导金达苜
蓿外植体获得胚性愈伤组织, 而是首先诱导产生非
胚性愈伤组织, 然后再分化产生胚性愈伤组织。本
实验参考 Saunders 等[ 8]的方法, 选择诱导体胚的培
养基为不添加任何激素的 MSO, 将已诱导的蓬松、
较大的愈伤块转入 MSO 培养基内进行分化培养,
供试激素各处理组合的愈伤组织在 MSO培养基内
先是继续生长, 然后逐渐软化进行分化。分化出的
愈伤组织大致可以分为 4大类型(图 1) : 亮黄色,
较软,内外有很多绿色颗粒; 黄绿色, 较硬, 紧密,
有绿色颗粒凸起; 绿色硬块; 无组织结构, 褐化
失活型。 、型都是胚性愈伤组织,均能在 MSO
培养基内分化出胚状体, 但 型愈伤组织分化时间
长,其愈伤组织在分化培养基 MSO 连续继代 6 个
月仍有胚状体分化产生。 型愈伤组织也可以连续
继代不失活,但最终无胚状体和分化苗产生。各处
理组合分化出的各类型胚性愈伤组织比率见表 2。
表 2 2, 4D和 6BA 浓度组合配比分化出的
不同愈伤组织类型的比率
Table2 The ratios of different type callus induced by
different combinations and concentr ations of 2, 4D and 6BA
2, 4D和 6BA 浓度组合配比
Different combinations and
concent rations of 2, 4D and 6BA
形成不同愈伤组织类型比率
The rat ios of different types callus(%)
!
12 0. 2 28 37 11 24
10 0. 5 33 36 3 28
8 0. 2 37 48 4 11
6 0. 2 27 34 8 31
5 0. 5 22 32 5 41
4 0. 2 29 36 11 24
2 0. 2 34 38 6 22
2. 3 2, 4D和 6BA激素浓度处理组合对胚性愈伤
组织的影响
不同 2, 4D和 6BA激素浓度组合配比形成的
愈伤组织在 MSO培养基分化产生的四种类型愈伤
组织的比例见图 2。愈伤组织在 MSO 内逐渐出现
黄色的、颗粒状结构,甚至整块都呈现颗粒状的松散
形态, 同时还伴随着绿色胚状体的出现, 归为 型,
这种愈伤组织分化期短, 再生周期也短, 一般在60
图 1 分化出的愈伤组织类型
F ig. 1 T he callus types o f differentiation
注: 1. ; 2. ; 3. ; 4.
- 70 d再生苗出现, 为最理想的愈伤组织类型。
型愈伤组织也能分化胚状体, 但分化时间较长。在
供试激素浓度组合中,愈伤组织分化成 型的比例
高于型 28%。我们以梁慧敏 [ 9] 等人得出以胚性
愈伤组织诱导率作为体细胞胚分化能力的指标是合
理的理论为依据, 将分化成 型、型愈伤组织的多
少评价各激素处理浓度组合的标准, 从图 1反映出,
2, 4D与 6BA组合配比为 8/ 0. 2时, 在 MSO培养
基上分化成 、型愈伤组织的比例明显高于其他
组合, 故得出 2, 4D与 6BA 浓度组合为 8/ 0. 2时
为最佳胚性愈伤组织诱导剂量配比。
图2 2, 4D与6BA不同浓度配比形成不同愈伤组织类型的比率
F ig . 2 T he ratio s o f different type callus induced by different
combinations and concentr ations of 2, 4D and 6BA
3 讨论
金达苜蓿种子比一般苜蓿种子小, 消毒时间过
长就会使种子致死发黑, 所以消毒时间不宜太长。
本实验所采用的消毒时间及步骤是经过长期试验总
结得出的针对金达种子最理想的消毒方法。
外源生长素和细胞分裂素是诱导离体培养细胞
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草 地 学 报 第 18卷
分化与增殖所必需的, 2, 4D 是诱导胚性愈伤组织
的重要激素[ 10]。Saunders等[ 8] 的研究表明,紫花苜
蓿愈伤组织的诱导需要高浓度的 2, 4D, 而体细胞
胚的形成则必须要降低 2, 4D浓度或将其去除, 否
则胚性愈伤组织会在生长素的持续刺激下进入脱分
化状态,不断产生愈伤组织,始终不能形成成熟的体
细胞胚或再生植株。张元新[ 11] 认为过低过高的 2,
4D浓度对体细胞胚发生率都有抑制作用, 发生率
曲线基本呈抛物线状, 有 2, 4D 浓度诱导的最适浓
度区域。本实验采用 2- 12 mg/ L 浓度范围的生长
素 2, 4D,结合低浓度的细胞分裂素 6BA诱导金达
苜蓿体细胞胚, 未发现抑制或促进胚性愈伤组织诱
导规律性的激素配比,但所设的浓度处理范围内, 分
化出胚性愈伤组织的比率均超过 53% (诱导出
型、型愈伤组织比率之和) , 尤其 2, 4D 与 6BA
处理组合为 8 mg/ L 与 0. 2 mg / L 时高达 85% , 且
均有胚体苗分化出,故2- 12 mg/ L 2, 4D浓度范围
应是金达苜蓿体胚诱导的较适宜浓度区域。舒文
化[ 12]等人报道当 2, 4D浓度高于 2 mg/ L 时, 和田
苜蓿诱导率较高,但容易出现褐化,本实验未有此现
象出现,可见苜蓿品种间存在差异。
诱导出的型、型胚性愈伤组织比例较高, 但
最终分化出胚体苗的却很少, 这是因为虽有绿色小
芽点的胚状体出现,但是这种胚状体发育方向不确
定,既可以先发育成根, 也可以先发育成芽, 先形成
根往往抑制芽的形成。诱导出的绿色胚状体多先形
成根, 之后其胚状体就失去再萌发芽的能力。而先
萌发芽的胚状体在未添加任何激素的 MSO 培养基
上就会有根、茎、叶长出, 发育成为一个完整植株。
这同杨起简[ 13] 等人报道的结论一致。故有关诱导
胚性愈伤组织及分化成胚体苗的适宜激素的选择需
要进一步探讨。
参考文献
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(责任编辑 米 佳)
更正声明
本刊 2010年 1月,第 18卷(第 1期)发表的海雀稗体细胞低温筛选获得耐寒突变体一文, 第 100
页图 2更正如下,特此声明。
图 2 0 低温下培养 75 d的愈伤组织
Fig. 2 Calli after cultur ed 75 d at 0
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