全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(2)：136～139
Journal of Wuhan Botanical Research
黑暗和光照对长春花培养细胞生长和
生理生化特性的影响
郭胜娟，刘树楠，冯玲玲，周吉源
(华中师范大学生命科学学院，武汉 430079)
摘 要：以长春花(Catharanthus roseus(L¨ )G．Don)幼嫩叶片为外植体，在MS+NAA 0．5 mg／L+2，4-D 0．5 rag／
L+6 BA 2．0 mg／L培养基上诱导形成愈伤组织，愈伤组织置于不同条件下培养。结果表明，黑暗和光照下 ，培养细
胞的生长周期为 27 d；过氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性均出现 2个峰值。对长春花总生物碱
含量和总产量亦做了研究，结果发现最佳的收获时期为第27 d。
关键词 ：愈伤组织；细胞生长；过氧化物酶；超氧化物歧化酶 ；生物碱；长春花
中图分类号 ：Q945 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)02-0136-04
The Effects of Dark and Light on Growth and Physiological and Biochemical
Characteristics in Cell Culture of C口f 口r口，：f roseus(L．)G．Don
GUO Sheng—Juan，LIU Shu—Nan，FENG Ling-Ling，ZHOU ji—Yuan‘
(College of Life Sciences，Central China Normal University，Wuhan 430079，China)
Abstract：Based on young leaves of Catharanthus roseus(L．)G．Don，callus iS induced on the
solid medium of MS+NAA 0．5 mg／L+2，4-D 0．5 mg／L+6 BA 2．0 mg／L．Two groups of cal-
lUS are cultured in the dark and light，respectively．The influeces of light on the cell growth and
physiological and biochemical characteristics are studied．The results show that：both the cell
growth curves are like“S”．and their growth circles are about 27 days．Activities of peroxides
(POD)and superoxide dismutase(SOD)show two peaks．W e also find that the alkaloid produc—
tion increased during the growth circles and can get
Key words：Callus；Cell growth；Peroxides(POD
Catharanthus roseu$(L．)G．Do n
长春花(Catharanthus roseu$(L．)G．Don)，又
名雁来红、四时春、三万花，夹竹桃科长春花属植物。
目前 ，已从中分离出 9O多种生物碱，并且 已证实其
中的长春碱等 4种二聚吲哚生物碱具有抗癌活性，
有些 已在临床上广泛应用[1]，但其在植株中的含量
非常低——仅仅只有十万分之几到百万分之几，化
学合成和半合成也不太理想[2]。目前我国市场上的
纯长春碱主要靠进口，价格昂贵。因此，用细胞培养
the most production at the 27th day．
)；Superoxide dismutase (SOD)}Alkaloid；
的方法生产长春花生物碱有很大的市场潜力。
笔者以长春花幼嫩叶片为外植体进行离体培
养，测定了愈伤组织培养增殖过程中的生长动态，并
测定了其中过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性
的变化，以及长春花总生物碱含量的变化。目的是探
讨长春花细胞培养过程中这些大分子物质与生物碱
积累之间的关系，同时为长春花的开发利用提供理
论依据。
收稿日期：2003—09—29，修回日期：2003—12—27。
作者简介 ：郭胜娟(1979年一)，女，硕士研究生，主要从事发育植物学与植物细胞工程研究。
通讯作者。
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第 2期 郭胜娟等：黑暗和光照对长春花培养细胞生长和生理生化特性的影响 137
1 材料与方法 来计算长春花总生物碱的产量。
1．1 长春花愈伤组织的诱导
长春花幼嫩植株取 自中国科学院武汉植物园，
由华中师范大学生命科学学院温室盆栽。实验时，取
幼嫩叶片，自来水冲洗后滤纸吸干，70 酒精浸泡
30 S，再用0．1 升汞消毒 5～8 min，无菌水冲洗3
～ 5遍，切成 0．5 cm×0．5 cm的小块，接种于 MS+
NAA 0．5 mg／L+2，4-D 0．5 mg／L+6BA 2．0 mg／
L固体培养基上(pH5．8，高压灭菌)，在光照条件下
诱导形成愈伤组织，培养温度为(25±2)℃，光强
40“mol·m一。·s一 。
1．2 愈伤组织的培养
诱导出的愈伤组织经过 2次继代后，接种于含
50 mL固体培养基的 150 mL的三角瓶中，每瓶接
种量为1 g，分别置于黑暗和光照(光强40／~mol·
m _z · s一
，12～14 h／d)条件下培养，培养温度为
(25±2)℃ 。
1．3 生长动态的测定
接种后每隔 2 d取不同条件下培养的愈伤组
织，用滤纸除去附在其上的培养基后称重，所称的重
量减去接种量，计算出生长量，绘出增殖生长曲线。
实验重复 3次，取其平均值。
1．4 生理生化指标的测定
接种后每隔 2 d取材一次，按 1：2(W／V)加预
冷的双蒸水，4℃下冰浴匀浆，低温离心(13 000 r／
min)20 min，取上清液供分析用。
过氧化物酶活性的测定采用愈创木酚法[3]测
定。将培养细胞的酶粗提取液适当稀释后，与愈创木
酚一过氧化氢试剂反应，在分光光度计上准确记录
下反应前 5 min的吸光度变化，波长 470 nm。单位
为 △A470min ·g-1Fw 。
超氧化物歧化酶活性的测定采用 Beauchanp
(1971)、Beuley(1979)等改进的方法[ ]进行。以抑制
氮蓝四唑(NBT)光还原反应达 5O 为一个超氧化
物 歧化酶活力单位(U’g Fw)。反应液的组成：
14．5 mmol／L蛋氨酸 54 mL，3 tmol／L乙二胺四乙
酸二钠(EDTA)2 mL，2．25 mmol／L的氮蓝四唑
(NBT)2 mL，60 tmol／L核黄素 2 mL，临用前按比
例配 制并 分装 成 3 mL／管。注 意：反 应液 是 用
50 mmol／L磷酸缓冲液(pH 7．8)配制。
长春花总生物碱含量按照涂桂洪的方法[5]测
定 ，单位为／~g／g·Fw ，然后根据愈伤组织的鲜重
2 结果与讨论
2．1 不同培养条件下愈伤组织的生长变化
黑暗和光照培养下愈伤组织的生长曲线见图1。
由图1可见，愈伤组织生长曲线均呈“S”型，即
按逻辑生长模型(1ogical growth mode1)进行增殖生
长，并明显地分为 3个时期：延迟生长期、指数生长
期和静止期。在延迟期(0～9 d)内，培养物增重缓
慢，这可能是由于刚接种的愈伤组织经过切割 尚未
完全适应新的环境，不能很好的吸收营养物质的结
果；在指数生长期(9～24 d)内，培养物鲜重急剧增
加；而到了静止期(24～27 d)，鲜重稍有下降，这可
能是因为培养基中养分几乎消耗殆尽，不能提供增
殖所需的营养物质。
2O
l 5
l0
5
0
0 3 6 9 l2 l 5 l8 2l 24 27 30
Cultivation time(d)
图 1 长春花愈伤组织的生长曲线
Fig．1 The changes of cel yield during callus culture
从图 1还可看出，两种条件下培养的愈伤组织
的生长周期均为27 d，但光照条件下，细胞生长速度
较快 。郑光植、梁峥[ ]在三分三愈伤组织生长和生物
碱含量的影响研究中发现，光照能促进三分三愈伤
组织生长，而黑暗相对抑制细胞生长。也有报道光抑
制日本黄连培养细胞的生长和小檗碱的合成[7]。这
可能是因为不同植物生长和发育受光的调节作用不
同引起的。另外，光对植物组织培养物的生长和发育
的效应又受培养基成分的影响。
2．2 过氧化物酶(POD)活性的测定
POD广泛存在于植物 中，它参与呼吸代谢并
在植物细胞生长和分化 中起重要的作用。Ishida
等认为 POD的水平与生长有关，Elstner、Mader
等认为高等植物中 POD与木质素聚合有关[8]。因
此，POD活性的变化是植物生理生化研究中常用的
重要指标。不同条件下培养细胞中POD活性的变化
如图 2
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武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
O 3 6 9 l2 l 5 l8 2l 24 27
Cultivation time(d)
图 2 过氧化物酶(POD)活性的变化
Fig．2 The changes of POD activities
由图 3可见，在不同培养条件下，POD活性变
化曲线相似，均出现 2个峰值，而且光照可以提高
POD的活性。在愈伤组织生长初期(O～3 d)，POD
活性上升，出现第一个峰，这可能是由于接种引起的
损伤反应 ，Galston等人[9]认为损伤使 POD合成抑
制物渗露，导致酶活性的增强。从第 6 d开始酶活力
呈逐渐上升的趋势，到第 15 d达最大，比较此时的
细胞形态，认为可能是分化状态细胞中酶活性较高
的缘故。
2．3 超氧化物歧化酶(SoD)活性的测定
SOD普遍存在于动植物体内，被认为与植物叶
片衰老、种子老化以及植物抗老化、抗盐、抗 SO。、O。
等均有一定的关系，SOD在控制脂质过氧化、减轻
膜系统的伤害上起保护作用[1。。不同培养条件下细
胞中SOD的活性变化见图3。
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Cultivation time(d)
图 3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化
Fig．3 The changes of SOD activitms
本实验中黑暗和光照条件下的 SOD活性的变
化相似。愈伤组织在开始继代时(O～3 d)酶活力下
降，但在愈伤组织适应新的培养基后酶活力呈上升
趋势。在光照条件下，酶活性的高峰出现在第 12 d
和第 24 d，而黑暗条件下，酶活性的第一个高峰出现
于第 15 d，滞后于光照条件下。实验结果表明：第 1
个峰的出现与愈伤组织大量增殖有关 ，这与何梦
玲[1妇在喜树细胞培养中的结果相似。第 2个峰的出
现与培养基中营养物质消耗殆尽导致的细胞老化有
关，是由于成熟、衰老过程中氧 自由基活动加强而产
生的一种适应现象，即 SOD的抗衰老作用。
2．4 长春花总生物碱含量的变化
不同培养条件下长春花总生物碱含量的变化及
生长周期中总生物碱的产量分别见图 4和图 5。
250
． _ 200
言参 1 50
u
鼍 100
日 ∞
一 5O
O
0 3 6 9 l2 l 5 l8 2l 24 27
Cultivation time(d)
图 4 生长周期中长春花总生物碱含量的变化
Fig．4 The changes of alkaloids content during
the growth circle
O 3 6 9 l2 l 5 l8 2l 24 27
Cultivation time(d)
图 5 培井周期中长春花总生物碱的产量变化
Fig．5 The changes of alkaloids proeuction during
the growth circle
由图 4可见，黑暗和光照时碱含量的变化不尽
相同，但第 12 d均出现一个峰值，并且从第 18 d起
碱的含量呈上升趋势。从总产量来看，随着天数的增
加碱的产量也在增加，其变化曲线类似于生长曲线。
在培养的延迟期和指数生长期 ，培养基中营养物质
丰富，细胞的初级代谢活跃，可能次级代谢受到抑
制，因而次生物质的积累较少。在指数生长期末期 ，
一 些营养物质被逐渐消耗而减少，初级代谢受到抑
制，大部分细胞停止分裂，细胞内源激素水平发生改
变，导致了次生代谢物的合成增强，在第 27 d产量
达到最大值，因此收获的最佳时期为第27 d。最终，
黑暗条件下碱的产量稍高。
据报道[1引，光影响酶的活性和次生代谢产物的
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第 2期 郭胜娟等：黑暗和光照对长春花培养细胞生长和生理生化特性的影响 139
积累，照光处理得当，可收到显著的效果。当对芸香
悬浮细胞进行照光处理时，发现香豆素的产量 比暗
培养提高几倍。戴均贵[1。3在银杏愈伤组织的研究中
发现，光照和黑暗条件下次生物的含量没有显著差
异。而王东口]报道 ，光抑制日本黄连培养细胞小檗碱
的合成。这些研究表明，光因子对次生物质积累的影
响各异。这一方面可能与培养的细胞系及其他培养
条件有关，另一方面与我们所要获得的终产物有关。
植物细胞培养的过程可以看作是一系列基因在
时间、空间依次顺序表达的过程，蛋白质、酶及次生
物质(如生物碱、有机酸、色素、香料等)就是基因表
达的产物。这些大分子物质的变化，是由于一定条件
下基因依次顺序表达的引发与阻抑的结果。了解这
些规律性的变化，对了解细胞生理生化特征和指明
进一步研究代谢调控的途径和方法都有重要的意
义。在工业化生产过程中，为了获得更大的经济效
益，需要进一步提高细胞中代谢产物的含量，如何进
一 步调整外源条件以开启合成长春花碱的基因从而
提高产量是我们进一步研究的方向。
参考文献：
[1] 季宇彬．中药有效成分药理与应用[M]．哈尔滨：黑龙
江科学技术出版社，1995．
[2] 陈敏，廖志华，孙敏，罗学．生物技术在长春花 中的应
用[J]．中草药，2001，32(1)：78—81．
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[1O]
[11]
[12]
[13]
张志良．植物生理学实验指导(第 2版)[M]．北京：高
等教育出版社 ，1991．
上海市植物生理学会，中国科学院上海植物生理研究
所．现代植物生理学实验指南[M]．北京：科学出版
社 ，1999．
涂桂洪，李宝健．长春花生物碱高 产细胞株的筛选
[J]．细胞生物学杂志．1984，6(4)：164—168．
郑光植，梁峥．三分三愈伤组织细胞的悬浮培养[J]．
云南植物研究，1982，4(2)；203—206．
王东，李启任．培养细胞中小檗碱的产生及其生物合
成眼就概况[J]．中草药 ，1998，29(2)；128—131．
侯篙生，李新明，尚廷兰 ，吴玉兰，李洪林．九连小檗悬
浮 培养细 胞生理生化 研究[J]．武汉 植物学 研究，
1988，6(2)：129— 132．
Galston A W ，Davis J P．Hormonal regulation in
higher plants[J]．Science，1969，163：1 288—1 297．
Lee E H ．Bennett L H．Superoxide dismutase—A pos—
sible protective enzyme against ozone injury in snap
beans (Phasealus vulgaris L)[J]．Plant physiol，
1982，69：1 444— 1 449．
何梦玲，周吉源．不同光照对喜树细胞生长的影响
[J]．华中师范大学学报，2002，36(4)：489—493．
倪德祥。光在植物组织培养 中的调控作用D]．自然杂
志，1987，9(3)：193—198．
戴均贵．银杏组织与细胞培养及银杏内酯产生的研究
[D]．北京：中国医科学院药物研究所，1999．6．
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