免费文献传递   相关文献

Cloning of Chalcone Isomerase Gene and Bioinformation Analysis of Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.

灯盏花chi的克隆及其生物信息学分析



全 文 :武汉植物学研究 2010, 28(6): 682~690
Journal of Wuhan Botanical Research


收稿日期: 2010-02-05, 修回日期: 2010-06-09。
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30660075,40861019, 31060150); 云南省农业产业化扶持项目(2006-149); 云南科技
厅社会发展科技计划基础研究面上项目(2009CD052)。
作者简介: 刘春霞(1980−), 女, 硕士研究生, 研究方向为植物遗传学。
∗通讯作者: 张云峰(1964-), 男, 教授, 主要从事植物遗传及植物资源环境的教学、研究(Author for correspondence.
E-mail: zhyunfeng001@yahoo.cn)。
DOI: 10.3724/SP.J.1142.2010.60682
灯盏花 chi的克隆及其生物信息学分析
刘春霞1, 王 玥1, 崔明昆1,4, 严胜柒1, 谢庆华2,4, 官会林3, 张云峰1,4∗
(1. 云南师范大学生命科学学院, 昆明 650092; 2. 云南师范大学资源生物研究所, 昆明 650092;
3. 云南师范大学能源与环境科学学院, 昆明 650092; 4. 教育部生物能源持续开发利用工程中心, 昆明 650092)
摘 要: 查尔酮异构酶(CHI)是调控黄酮生物合成的关键酶, 分离和克隆这一酶的功能基因, 对利用转基因技
术进行灯盏花黄酮生物合成的调控具有重要意义。本研究采用 RT-PCR 和 RACE 技术, 获得了 chi cDNA
全序列, GenBank 登录号为 GU208823.1, 序列全长 996 bp, 开放阅读框为 594 bp, 编码 197 个氨基酸,
3-Race有一个多聚腺苷酸加尾信号。应用软件预测该基因编码蛋白分子量约为 21.6 kD, 理论等电点为 4.78。
该基因编码的蛋白无跨膜结构域, 其二级结构的主要构件为 α-螺旋和随机卷曲。对其三级结构进行了建模, 表
明其结构与苜蓿 chi的三级结构相似。同时根据灯盏花 chi N端序列变化的特征, 提出了灯盏乙素的合成可能
与 chi在细胞亚结构的定位及其与合成代谢相关酶形成复合酶的特异性有关。研究为利用基因工程定向改变
灯盏花黄酮代谢产物奠定了基础。
关键词: 灯盏花; 查尔酮异构酶(CHI); RT-PCR(Polymerase Chain Reaction); RACE (Rapid Amplification of
cDNA Ends); 序列分析
中图分类号: Q75 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X(2010)06-0682-09

Cloning of Chalcone Isomerase Gene and Bioinformation
Analysis of Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.
LIU Chun-Xia1, WANG Yue1, CUI Ming-Kun1,4, YAN Sheng-Qi1,
XIE Qing-Hua2,4, GUAN Hui-Lin3, ZHANG Yun-Feng1,4∗
(1. School of Biological Science,Yunnan Normal University, Kunming 650092, China; 2. Technological Research
Institute of Biological Resource, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China; 3. College of Energy and
Environment Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China; 4. Sustainable Exploitation
Engineering Center of Biological Energy of Education Ministry, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China)
Abstract: Chalcone isomerase is a key enzyme in flavone biosynthesis regulation of Erigeron
breviscapus (vant) Hand Mazz. Isolation and cloning of functional genes concerning flavone
biosynthesis is crucial for using gene transfer to regulate flavone metabolism in Erigeron bre-
viscapus. In this paper, the chalcone isomerase gene (CHI) was cloned from Erigeron bre-
viscapus via RT-PCR and RACE (rapid amplification of cDNA ends). The full-length cDNA of
chalcone isomerase gene is 996 bp (GenBank Accession No. GU208823), containing a 594 bp
open reading frame (ORF), encoding a 197 amino acid protein, and having a polyadenylation
signal in its 3 untranslated region. The deduced protein molecular weight of CHI was 21.6 kD and
its theoretical isoelectric point was 4.78. The CHI protein did not have trans-membrane domain
and was hydrophilic. Its secondary structures were predominantly constructed by α-helic and

第 6期 刘春霞等: 灯盏花 chi的克隆及其生物信息学分析 683


random coils were the main component. The 3D model structure of the deduced Erigeron
breviscapus protein was constructed similar to the CHI protein structure from Medicago sativa.
According to variation characteristics in the N-end of CHI, we supposed that the special synthesis
of breviscapine (scutellarin-7-O-glucuronide and apigenin-7-O-glucuronide) in Erigeron bre-
viscapus may be concerned with the position of CHI in cell sub-structure and the assembled
manner of enzymes in flavone biosynthesis. This research established the foundation for di-
rectional change in flavone biosynthsis in Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.
Key words: Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.; Chalcone isomerase; RT-PCR(Poly-
merase Chain Reaction); RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends); Sequence analysis
灯盏花 (Erigeron breviscapus (vant) Hand
Mazz.)又名灯盏细辛、短葶飞蓬 , 为菊科
(Composttiae)飞蓬属 (Erigeron)多年生草本植
物。其有效成分是以灯盏乙素为主的类黄酮和酚
类化合物[1−4], 类黄酮是植物界具有多元生物功能
和生态影响因素的一大类次生代谢产物[5−7], 其合
成是由苯丙氨酸途径及其旁路而完成[5]。植物中大
约 20%的光合产物会进入该途径, 从而形成包括
类黄酮在内的种类繁多的多酚化合物[8]。类黄酮在
植物界具有多种多样的功能, 除了几丁质作为细
胞壁的主要成分外, 黄烷酮能帮助植物抵御 UV辐
射, 花青素还是众多植物中虫媒授粉昆虫的主要
吸引物[9,10]。此外, 类黄酮及异黄酮对人体具有直
接和复杂的作用, 其生物活性主要表现在抗氧化、
抗癌、清除自由基等方面, 而且它们对肿瘤以及心
血管等疾病的治疗与预防有着重要的药用价值[9]。
查尔酮异构酶(CHI)是第一个被认识的类黄
酮物质合成相关酶, 也是调节类黄酮化合物含量
及种类的关键酶[11]。查尔酮序列家族及其三维折
叠特征曾被认为是植物的特征及物种特化的基因
标志, 但通过序列比较和折叠特征识别, 在其他较
低等的生物中也发现查尔酮异构酶的存在, 但在
真菌、细菌中缺少了黄酮代谢上游基因-查尔酮合
成酶基因, 因此, 黄酮代谢途径在物种上可能存在
较大的变异[12]。这也许就是生物中类黄酮丰富的
原因之一。目前在类黄酮生理功能、代谢途径、
生物合成以及植物演化的相关方面的研究已取得
了很大的进展[5,13−15]。利用类黄酮代谢相关基因及
其控制元件进行的转基因, 成为改变植物花色、类
黄酮成分及其含量的主要方法, 已经成功改变了
翠菊 (Callistephus chinensis)[16]、康乃馨 (Dian-
thus caryophyllus)[17]、仙客来 (Cyclamen per-
sicum)[18]、矮牵牛(Petunia hybrida )[19]等植物的
花色; 有效提高了大麦、洋葱[20]、番茄、水母雪莲[21]
中黄酮的含量。目前尚无灯盏花 chi 的相关报道。
chi 克隆在理论上有助于灯盏花黄酮类化合物的
提高, 在实践中有利于对其进行基因工程改良, 以
提高灯盏花中黄酮类化合物的含量。本研究用
RT-PCR和 RACE方法克隆了灯盏花 chi cDNA序
列, 并对其序列以及 chi 所编码的蛋白质的特性
进行了分析。
1 材料与方法
1.1 供试材料及总 RNA的提取
实验材料灯盏花(Erigeron breviscapus (vant)
Hand Mazz.)采自云南文山邱北 , 实验室编号为
E6。材料鉴定后通过组培快繁, 炼苗成活后定植
于云南师范大学生命科学学院生物园地。无病虫
害的灯盏花新鲜叶片用于总 RNA提取, RNA提取
试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 PCR扩增反应
1.2.1 反转录合成 cDNA及反应
设计引物 P1 F: 5-GAAATCCAAGGGAACT
TTGTGAAGT-3; P2 R: 5-CTATTCTCTTCACAACC
TCGCCTCT-3。cDNA的合成与 RT-PCR过程按
照 TaKaRa公司 cDNA PCR试剂盒说明进行操作。
1.2.2 灯盏花 chi 3-Race扩增
根据 RT-PCR 测序结果 , 设计引物 3-chi-
Outer: 5-TGTGTGTCGGTGTTTGGAAAGCTCA-
3; 3-chi-Inner: 5-CTATTCTCTTCACAACCTCG
CCTCT-3。按照 TaKaRa 3-Race PCR Kit操作说
明进行, 采用套式 PCR 进行扩增, PCR 扩增体系
为:cDNA 1 μL、3-chi-Outer(20 pmol/μL) 1 μL、
3-Race-Outer 1 μL、dNTPs 1 μL、10×PCR buffer

684 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


5 μL、Taq DNA polymease 1 μL、无菌水 40 μL,
于 94°C预变性 5 min, 94°C 30 s、52°C 30 s、
72°C 45 s (共 20个循环), 72°C延伸 10 min, 4°C
保存备用。
取上述产物 1 μL做模板、3-chi-Inner 1 μL、
3-Race-Inner 1 μL、dNTPs 1 μL、10×PCR buffer
5 μL、Taq DNA polymerase 1 μL、无菌水 40 μL。
于 94°C预变性 5 min, 94°C 30 s、50°C 30 s、
72°C 45 s (共 25个循环), 72°C延伸 10 min, 4°C
保存备用。
1.2.3 灯盏花 chi 5-Race扩增
根据 RT-PCR 测序结果 , 延伸设计引物
5-chi-Outer: 5-ACATTCGCAGCTTCAGGTATGG
TA-3; 5-chi-Inner: 5-AGAGGCGAGGTTGTGAA
GAGAATAG-3。按照 TaKaRa 5-Race PCR Kit 操
作说明进行。
1.2.4 灯盏花 chi cDNA全序列的获得
将得到的 chi 3-Race、chi 5-Race的质粒进
行 PCR扩增。3-Race目的条带的扩增, 按下列组
分配制 PCR 反应液(50 μL 体系):3-Race 质粒
1 μL、 3-chi-Inner primer(20 pmol/μL) 1 μL、
3-Race-Inner primer 1 μL、Master Mix 25 μL、
ddH2O 22 μL。将上述反应物离心混匀, 于 94°C
预变性 5 min, 94°C 30 s、52°C 30 s、72°C 45 s
(共 30个循环); 72°C延伸 10 min, 4°C保存备用。
PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
5-Race 目的条带的扩增 , 按下列组分配制
PCR 反应液(50 μL体系): 5-Race 质粒 1 μL、
5-chi-Inner primer(20 pmol/μL) 1 μL、5-Race-
Inner primer 1 μL、Master Mix 25 μL、ddH2O
22 μL。将上述反应物离心混匀, 于 94°C预变性
5 min, 94°C 30 s, 52°C 30 s, 72°C 45 s (共 30个
循环); 72°C延伸 10 min, 4°C保存备用。PCR产
物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
chi cDNA 全序列的获得 , 按下列组分配制
PCR反应液(50 μL体系):3-Race PCR产物 3 μL、
5-Race PCR产物 3 μL、3-chi-Inner primer 1 μL、
5-chi-Inner primer 1 μL、Master Mix 25 μL、ddH2O
17 μL。将上述反应物混匀离心, 于 94°C预变性
5 min, 94°C 30 s、52°C 30 s、72°C 60 s (共 30
个循环); 72°C延伸 10 min, 4°C保存备用。PCR
产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回
收后链接于 pGM-T4 载体(购自天根生化科技(北
京)有限公司), 挑取阳性克隆进行 PCR验证后,提
取阳性克隆的质粒送至天根生化科技公司测序。
1.3 生物信息学分析
对测序结果进行分析, 推导编码蛋白的氨基
酸序列 , 以编码蛋白的氨基酸为查询序列对
GeneBank 中的非冗余的蛋白质数据库进行
Blastp分析[22], 使用DNAman进行多序列比对, 利
用 DNAStar软件包进行编码蛋白的不同基本理化
特性分析, 蛋白质跨膜结构域、疏水性、二级结构
的预测和三维结构建模分别采用 TMHMM
Server2.0、ProtScale、EsPASy Server和 Swiss-
modeL在线软件进行。
2 结果
2.1 灯盏花 chi cDNA片段的扩增结果
采用简并引物 P1、P2进行 RT-PCR扩增得到
一条大约 170 bp的条带, 测序结果与预期的目的
片段相似。
2.2 灯盏花 chi 3-Race、5-Race的扩增结果
根据扩增片段的测序结果设计引物 ,采用
TaKaRa公司的 3-Race、5-Race Kit的方法扩增
chi的 3-Race和 5-Race。经两轮扩增分别得到大
约 450 bp、550 bp的 DNA片段(图 1), 测序后证
实为 chi 3-Race和 chi 5-Race序列。chi 3-Race、
chi 5-Race 经 PCR连接后得到大约 1000 bp的
片段(图 2)。
2.3 灯盏花 CHI与其他植物 CHI的同源性比较
用 ORF 软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

M: Master; 1,3: 5-Race PCR product; 2,4: 3-Race PCR product; CK:
Control group
图 1 3-Race、5-Race的电泳
Fig. 1 Electrophoresis results of 3-Race and 5-Race

第 6期 刘春霞等: 灯盏花 chi的克隆及其生物信息学分析 685



M: Master; 1,2: chi full-length PCR product
图 2 chi全长的电泳结果
Fig. 2 Electrophoresis results of chi full-length
gorf/)对序列进行在线分析, 其 ORF 长 594 bp,
编码 197个氨基酸, 3-Race有多聚腺苷酸加尾信
号(图 3)。以 CHI为查询序列对 GeneBank中的
非冗余蛋白质数据库进行 Blastp 分析, 该基因与
菊花(Chrysanthemum × morifolium, 登录号 :
ABY55859)、向日葵(Helianthus annuus, 登录号:
ABY73742)、辣椒(Capsicum annuum, 登录号:
ACN60401)、葡萄(Vitis vinifera, 登录号: XM_
002282108)、玉米 (Zea mays, 登录号 : NP_
0011 440 0 2 )、洋葱 ( A l l i um cepa , 登录号 :
AAU11843)的同源性分别是: 83%、77%、67%、
65%、62%、60% (图 4)。据此可认定所获得的基
因为 chi, 并在 GenBank 进行登录 , 登录号为
GU208823。
对苜蓿(Medicago sativa) chi 的克隆以及定
点突变的研究表明, 苜蓿的 chi 编码 222个氨基
酸, 其 48、113 及 190 位点是底物的结合位点,
106是其非常重要的活性位点。当 48位点由 T转
变为 A或 S; 106位点从 Y转变为 F; 113位点从
N转变为 A以及 190位点从 T转变为 A时均会降
低 CHI的反应速度[23−25]。从图 4中可以发现灯盏
花 CHI 及所引用物种在 48、113、106及 190位
点(图 4中箭头所指位点)上均非常保守, 除在 48
位点上洋葱为 C, 106位点上灯盏花为 L, 其他物
种都为 V, 但氨基酸与苜蓿都不一致。表明尽管这
些位点是 CHI 发挥功能的重要位点, 但氨基酸并
非不能发生改变, 这与 chi在代谢反应中存在的多
种形式相吻合[26,27]。Jez等[24]根据结构及定点突变
的结论认为 CHI 是通过空间锁定底物的方式, 使
反应定向达到二次方的速度 , 表明 CHI 的二、

□ 表示转录起始密码子和终止密码子 □ Denotes initiation codon and termination codon
图 3 灯盏花 chi cDNA序列和推导的氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide and putative amino acid sequences of chi full-lengthcDNA in Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.

686 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷



对比材料为:灯盏花(Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.)、菊花(Chrysanthemum × morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)、辣椒
(Capsicum annuum)、葡萄(Vitis vinifera)、洋葱(Allium cepa)、玉米(Zea mays); 颜色表示同源性, 颜色越深同源性越高, 颜色浅表示同源性
低; 箭头表示灯盏花 CHI活性位点的位置
The species used for sequence alignment as following: Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz., Chrysanthemum × morifolium, Helianthus
annuus, Capsicum annuum, Vitis vinifera, Allium cepa and Zea mays; Same colour in longitudinally row meaned the nucleotide was
homology, deeper colour meaned higher homology, lighter colour meaned lower homology; The arrow indicated the active site of CHI in
Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.
图 4 不同植物的 CHI氨基酸序列多重对比
Fig. 4 Multiple sequence alignment of different plants CHI amino acid
三级结构对 CHI完成其功能更为重要。
2.4 chi编码的蛋白质特性分析
所克隆 cDNA序列编码蛋白(CHI)长 197AA,
分子量约 21.6 kD, 其酸性氨基酸(D、E)、碱性氨
基酸(R、K)、疏水性氨基酸(A、I、W、V、L、F)
和极性氨基酸(N、C、T、Y、Q、S)含量分别为
27、19、75、49, 等电点为 4.78。疏水性预测结
果(图 5)表明, CHI在第 62位的 Leu疏水性最强
(1.644), 第 71位的 Glu亲水性最强(-1.889); 但
其平均疏水性为 0.049, 可以得出整条多肽链中
没有明显的亲水或疏水区域。对其他植物 CHI氨
基酸序列的疏水性与亲水性分析,也得到类似的
结果[28]。对灯盏花 CHI氨基酸序列的跨膜结构域
进行预测(图 6), CHI整条肽链位于细胞膜外面, 说
明 CHI没有跨膜结构域。现代分子生物学研究已
经证实, 类黄酮代谢是由内质网上的查尔酮合成
酶、查尔酮异构酶和黄烷酮醇-4-还原酶等组成
的酶复合体进行催化反应的[29], 这与预测的 CHI

图 5 灯盏花 CHI 的疏水性预测结果
Fig. 5 Hydrophobicity prediction result of CHI in
Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.
不存在跨膜结构域相符合。EsPASy Server 预测
蛋白质二级结构显示(图 7), 灯盏花CHI多肽链中,
β-转角、延伸连、随机卷曲和 α-螺旋所占的比例
分别为 5.58%、15.74%、24.87%、53.81%, 由
此得出:随机卷曲和 α-螺旋是 CHI多肽链的主要
结构元件, 延伸连散布于整个蛋白质中。三维结构
建模显示 (图 8), CHI 的整体结构与紫花苜蓿

第 6期 刘春霞等: 灯盏花 chi的克隆及其生物信息学分析 687



图 6 灯盏花 CHI 跨膜结构域的预测结果
Fig. 6 Trans-membrane domain prediction result of CHI
in Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.

α-螺旋:Alpha helix; β-转角:Beta turn; 延伸:Extended;
随机卷曲:Random coil
图 7 灯盏花 CHI二级结构预测结果
Fig. 7 Secondary structure prediction result of CHI
in Erigeron breviscapus (vant) Hand Mazz.

a. 灯盏花 CHI单体; b. 紫花苜蓿 CHI
a. Breviscpini CHI monomer; b. Medicago sativa CHI
图 8 灯盏花 CHI 单体与紫花 CHI 的空间对比
Fig. 8 Tertiary structure of CHI monomer and structural
comparison between Erigeron breviscapus (vant)
Hand Mazz. and Medicago sativa
(Medicago sativa)CHI(PDB ID为 1jx0A)CHI的空
间结构建模成功, CHI 的整体空间结构像有 β-折
叠形成的花束。一个大的 β 折叠和由 3个短的 β-
折叠链连接的一层 α-螺旋在大的 β-折叠的反面形
成一个核心结构 [24]。将预测所得二级结构(图 7)
和三级结构(图 8)与苜蓿的二、三级结构进行对比,
可以发现在活性位点上的结构是完全吻合的, 再
次表明上述认为 CHI的二、三级结构在完成其功
能中发挥重要的作用。
以拟南芥 CHI 蛋白质序列 (登录号 : NP_
201423.2)用 Swiss-modeL 在线软件建模, 结果
见图 9, 尽管拟南芥 CHI 的氨基酸序列与灯盏花
CHI 的氨基酸序列存在差异, 但是二者的空间整
体结构相似。由此表明不同物种的 CHI 与其他酶
形成不同的酶复合体, 产生不同的黄酮类化合物。

图 9 拟南芥 CHI 空间结构
Fig. 9 Tertiary structure of Arabidopsis thaliana CHI
3 讨论
查尔酮异构酶是类黄酮及异黄酮生物合成中
的必需酶 [30,31], 主要催化 2’,4’,4’-三羟基查尔酮
(2’,4’,4-trihydroxychalcone)到 4’,7-二氢黄酮
(4’,7-dihydroxy flavanone)的环化。目前已从矮牵
牛(Petunia hybrida)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、
玉米(Zea mays)、豌豆(Pisum safivum)、紫花苜蓿
(Medicago sativa)、翠菊(Callistephus chinensis)、
橙(Citrus sinensis)、水母雪莲(Saussurea medusa)、
大花美人蕉(Canna generalis)等 20余种植物中克
隆分离出 chi [21,23,32−36]。CHI在碱基组成及结构上
变化较大, Druka等[37]曾报道 chi cDNA序列的同
源性一般为 42%~65%, 不同类型的 chi即使在同
一物种间也有较大的差异, 给同源克隆 chi带来一
定的困难。本实验利用 RT-PCR和 RACE技术, 获
得了 chi克隆的灯盏花 CHI全长基因, 表明只要设
计引物合理, 同源性较低的基因也可采用同源克
隆方法获得。实验所克隆基因编码额氨基酸序列
与菊花、向日葵、辣椒、葡萄、玉米、洋葱 CHI
的同源性分别为 83%、77%、67%、65%、62%、
60%(图 4), 表明灯盏花的 chi与菊科植物 chi的同
源性较高, 与其他植物的同源性相对较低, 暗示
C HI 在物种演化的变化趋势与物种的整个演

688 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷



图 10 黄酮代谢途径及灯盏乙素生物合成的可能途径
Fig. 10 Metabolism pathway of flavonoids and biosynthetic pathway of scutellarin
化规律是一 致的。
从该基因与菊花等 6种植物 CHI氨基酸序列
进行多重对比(图 4)的结果发现, 灯盏花 CHI与其
他物种的 CHI在 C端的同源性较高, 而 N端的序
列差异较大, 表明 C-端可能是 CHI的催化部位。
结果与雷桅等[28]对洋葱 CHI分析的结果一致, N端
非催化域与蛋白质的亚细胞定位等物种特异性功
能相关。菊科飞蓬属(Erigeron)包括 200余种植物,
广布于全球, 北美尤盛, 仅我国就有 33种, 各地皆
产 (中国植物志 :74:295:http://www.plant.ac.cn/
latin/Compositae/Erigeron.htm), 但目前仅在短
葶飞蓬(灯盏花)中含有灯盏甲素和灯盏乙素, 暗
示 CHI 在亚细胞中的定位, 有可能会影响黄酮代
谢途径中的产物类型及其含量。
灯盏花的主要药用成分为灯盏乙素(野黄芩
苷 , scutellarin-7-O-glucuronide)和灯盏甲素 (芹
菜素苷, apigenin-7-O-glucuronide), 并将其混合
物称为灯盏花素(breviscapin)[38]。将灯盏花素的
结构与黄酮代谢途径中所生成物质的结构进行比
较 , 我们推测灯盏乙素的合成途径是查尔酮经
CHI 转化为槲皮素 , 槲皮素经 IFS(isoflavone
synthase)转化黄酮醇 , 黄酮醇经 FS (flavone
synthase)转化为野黄芩苷 , 再经 UDP-glucuro-
nate: baicalein 7-O-glucuronosyltransferase
(UBGAT) 而形成(图 10)。从黄酮的代谢途径看,
槲皮素经 CHI 作用转化为槲皮素, 该点是整个黄
酮的分支点, 此时, 槲皮素可形成槲皮素的系列衍
生物 ; 或通过 flavone synthase(FS)形成芹菜素
(apigenin)并通过芹菜素形成异黄酮衍生物、芹菜
素衍生物及牡荆黄素 (vitexin 衍生物 ); 或通过
flavanone 3-dioxygenase(F3H)形成二氢山奈酚
(dihydrokaempferol), 最终形成花青素(图 10)。
WinkelShirley和 Laura Jaakola均提出在黄酮合
成途径中, 相关酶以大分子的形式结合在内质网
上, 并在 CHI位点以下 3种不同的方式组合, 从而
形成不同的产物[26,27]。
本实验比较的结果在一定程度上支持了这一
结论。同时也表明, 黄酮的代谢调控过程极其复杂,
在今后的研究中, 除注重对黄酮化合物代谢关键
基因的克隆、结构特点以及表达调控模式的研究
外, 还应加强对基因序列的改造, 才能更好地进行
目标产物的定向生产。
参考文献:
[ 1 ] 张卫东, Tam H T B, 陈万生, 孔德云, 李惠庭, 王永红. 灯
盏花中新的酚酸类化合物的结构及活性研究[J]. 中国药
学杂志, 2001, 36(5): 360−363.
[ 2 ] 张卫东, 陈万生, 王永红, 刘文庸, 孔德云, 李慧庭. 灯盏

第 6期 刘春霞等: 灯盏花 chi的克隆及其生物信息学分析 689


花黄酮类化学成分的研究[J]. 中国中药杂志 , 2000(9):
24−26.
[ 3 ] 岳建民, 赵勤实, 林中文, 孙汉董. 灯盏细辛中酚类化合
物的化学研究[J]. 植物学报, 2000, 42(3):311-315.
[ 4 ] 张人伟, 张元玲, 王杰生. 灯盏花黄酮类化学成分的分离
鉴定[J]. 中草药, 1988(5):13.
[ 5 ] Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis. A colorful
model for genetics, biochemistry, cell biology, and
biotechnology[J]. Plant Physiol, 2001, 126(2): 485−493.
[ 6 ] Ralston L, Subramanian S, Matsuno M, Yu O. Partial
reconstruction of flavonoid and isoflavonoid biosyn-
thesis in yeast using soybean type I and type II
chalcone isomerases[J]. Plant Physiol, 2005, 137(4):
1375−1388.
[ 7 ] Havsteen B. Flavonoids, a class of natural products of
high pharmacological potency[J]. Biochem Pharmacol,
1983, 32(7):1141−1148.
[ 8 ] Weisshaar B, Jenkins G I. Phenylpropanoid biosyn-
thesis and its regulation[J]. Curr Opin Plant Biol, 1998,
1(3): 251−257.
[ 9 ] Dixon R A, Steele C L. Flavonoids and isoflavonoids—— A
gold mine for metabolic engineering[J]. Trends Plant
Sci, 1999, 4(10): 394−400.
[10] Dixon R A, Paiva N L. Stress-Induced Phenylpropa-
noid Metabolism[J]. Plant Cell, 1995, 7(7): 1085−1097.
[11] Muir S R, Collins G J, Robinson S, Hughes S, Bovy A,
Ric De Vos C H, van Tunen A J, Verhoeyen M E.
Overexpression of petunia chalcone isomerase in
tomato results in fruit containing increased levels of
flavonols[J]. Nat Biotechnol, 2001, 19(5): 470−474.
[12] Gensheimer M, Mushegian A. Chalcone isomerase
family and fold: No longer unique to plants[J]. Protein
Sci, 2004, 13(2): 540−544.
[13] Harborne J B, Williams C A. Advances in flavonoid
research since 1992[J]. Phytochemistry, 2000, 55(6):
481−504.
[14] Holton T A, Cornish E C. Genetics and biochemistry of
anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell, 1995, 7(7):
1071−1083.
[15] Quattrocchio F, Wing J F, Leppen H, Mol J, Koes R E.
Regulatory genes controlling anthocyanin pigmen-
tation are functionally conserved among plant species
and have distinct sets of target genes[J]. Plant Cell,
1993, 5(11):1497−1512.
[16] Forkmann G, Dangelmayr B. Genetic control of chal-
cone isomerase activity in flowers of Dianthus car-
yophyllus[J]. Biochem Genet, 1980, 18(5-6): 519−527.
[17] Kuhn B, Forkmann G, Seyffert W. Genetic control of
chalcone-flavanone isomerase activity in Callistephus
chinensis[J]. Planta, 1978, 138(199−203).
[18] Takamura T, Tomihama T, Miyajima I. Inheritance of
yellow-flowered characteristic and yellow pigments in
diploid cyclamen (Cyclamen persicum) cultivars[J].
Scientia Hort, 1995, 64: 55−63.
[19] Bednar R A, Hadcock J R. Purification and charac-
terization of chalcone isomerase from soybeans[J].
Biol Chem J, 1988, 263(20): 9582−9588.
[20] Kim S, Jones R, Yoo K S, Pike L M. Gold color in onions
(Allium cepa): A natural mutation of the chalcone
isomerase gene resulting in a premature stop codon[J].
Mol Genet Genomics, 2004, 272(4): 411−419.
[21] Li F, Jin Z, Qu W, Zhao D, Ma F. Cloning of a cDNA
encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase
and its expression in transgenic tobacco[J]. Plant
Physiol Biochem, 2006, 44(7-9): 455−461.
[22] Altschul S F, Madden T L, Schaffer A A, Zhang J, Zhang
Z, Miller W, Lipman D J. Gapped BLAST and
PSI-BLAST. A new generation of protein database
search programs[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(17):
3389−3402.
[23] McKhann H I, Hirsch A M. Isolation of chalcone
synthase and chalcone isomerase cDNAs from alfalfa
(Medicago sativa L.): highest transcript levels occur in
young roots and root tips[J]. Plant Mol Biol, 1994, 24(5):
767−777.
[24] Jez J M, Bowman M E, Dixon R A, Noel J P. Structure
and mechanism of the evolutionarily unique plant
enzyme chalcone isomerase[J]. Nat Struct Biol, 2000,
7(9): 786−791.
[25] Jez J M, Bowman M E, Noel J P. Role of hydrogen bonds
in the reaction mechanism of chalcone isomerase[J].
Biochemistry, 2002, 41(16): 5168−5176.
[26] Winkel-Shirley B. Evidence for enzyme complexes in
the phenyl-panoid and flavonoid pathways[J]. Physiol
Plant, 1999, 107: 142−149.
[27] Jaakola L, Maatta K, Pirttila AM, Torronen R, Karen-
lampi S, Hohtola A. Expression of genes involved in
anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin,
proanthocyanidin, and flavonol levels during bilberry
fruit development[J]. Plant Physiol, 2002, 130(2):

690 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


729−739.
[28] 雷桅 , 邹祥 , 向阳 , 汤绍虎 , 孙敏 . 植物查尔酮异构酶的
生物信息学分析[J]. 北方园艺, 2008(2): 193−197.
[29] Burbulis I E, Winkel-Shirley B. Interactions among
enzymes of the Arabidopsis flavonoid biosynthetic
pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(22):
12929−12934.
[30] Dixon R A, Blyden E R, Robhins M P, van Tunen A J, Mol
J N. Comparative biochemistry of chalcone iso-
merases?[J]. Phytochemistry, 1988, 27: 2801−2808.
[31] Dixon R A, Dey P M, Lamb C J. Intercellular trans-
mission of elicitation in cell suspension cultures and
hypocotyl sections of phaseolus vulgaris[J]. Plant
Physiology, 1983, 71: 1085−1097.
[32] Van Tunen A J, Koes R E, Spelt C E, van der Krol A R,
Stuitje A R, Mol J N. Cloning of the two chalcone
flavanone isomerase genes from Petunia hybrida:
coordinate, light-regulated and differential expression
of flavonoid genes[J]. EMBO J, 1988, 7(5): 1257−1263.
[33] Mehdy M C, Lamb C J. Chalcone isomerase cDNA
cloning and mRNA induction by fungal elicitor,
wounding and infection[J]. EMBO J, 1987, 6(6):
1527−1533.
[34] Blyden E R, Doerner P W, Lamb C J, Dixon R A.
Sequence analysis of a chalcone isomerase cDNA of
Phaseolus vulgaris L[J]. Plant Mol Biol, 1991, 16(1):
167−169.
[35] Grotewold E, Peterson T. Isolation and characterization
of a maize gene encoding chalcone flavonone
isomerase[J]. Mol Gen Genet, 1994, 242(1): 1−8.
[36] Wood A J, Davies E. A cDNA encoding chalcone
isomerase from aged pea epicotyls[J]. Plant Physiol,
1994, 104(4): 1465−1466.
[37] Druka A, Kudrna D, Rostoks N, Brueggeman R, von
Wettstein D, Kleinhofs A. Chalcone isomerase gene
from rice (Oryza sativa) and barley (Hordeum vulgare):
physical, genetic and mutation mapping[J]. Gene,
2003, 302(1-2): 171−178.
[38] 孙汉董, 赵勤实. 防治心脑血管疾病药物—— 灯盏细辛酚
的研究与开发[J]. 化学进展, 2009, 21(1): 77−83.
(责任编辑:张 平)