全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (4) : 361～ 364
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
两种细胞分裂素对大白菜子叶再生的影响
卢永恩1, 李汉霞1, 叶志彪2Ξ
(1. 华中农业大学园艺林学学院, 武汉　430070; 2. 作物遗传改良国家重点实验室, 武汉　430070)
摘　要: 以华阳三号 (H Y)和鲁白六号 (LB )大白菜具柄子叶为外植体, 建立了高频率不定芽再生体系, 并比较了所
使用的 2 种细胞分裂素作用的异同。M S+ 0125 m göL TD Z+ 015 m göL NAA + 5 m göL A gNO 3 组合中, H Y 的再生
频率达到 98. 8% , 在M S+ 2 m göL BA + 015 m göL NAA + 5 m göL A gNO 3 组合中, H Y 和LB 的再生频率分别为
9218% 和 8214%。TD Z 具有比BA 高的细胞分裂活性, 含有 TD Z 的培养基中, 子叶再生频率高、出芽迅速、芽点多。
子叶再生过程中, 硝酸银的作用必不可少。
关键词: 大白菜; 细胞分裂素; 子叶; 植株再生
　　中图分类号: S634. 1　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0420361204
Effects of Two K inds of Cytok in in s on Shoot Regenera tion
from Cotyledonary Explan ts of Ch inese Cabbage
LU Yong2En1, L I H an2X ia1, YE Zh i2B iao 2Ξ
(1. Colleg e of H orticu ltu re and F orestry , H uaz hong A g ricu ltu ra l U n iversity , W uhan　430070, Ch ina;
2. N ationa l K ey L abora tory of C rop Genetic Imp rovem en t, W uhan　430070, Ch ina)
Abstract: H igh eff icien t shoo t regenera t ion system s w ere estab lished u sing co tyledonary exp lan ts
of tw o Ch inese cabbage (B rassica cam p estris L. ssp. p ek inensis) cu lt ivars. Effects of tw o k inds of
cytok in in s u sed in th is experim en t on shoo t regenera t ion w ere compared. T he regenera t ion fre2
quency of H Y and LB w ere 92. 8% and 8214% respect ively in the m edium of M S+ 2 m göL BA +
015 m göL NAA + 5 m göL A gNO 3, and the regenera t ion frequency of H Y in m edium of M S +
0125 m göL TD Z+ 015 m göL NAA + 5 m göL A gNO 3 w as up to 9818%. A s a k ind of cytok in in s,
TD Z w as mo re act ive than BA. In the m edium supp lem en ted w ith TD Z, it w as mo re eff icien t and
rap id fo r shoo t regenera t ion, there w ere mo re buds on the exp lan ts than in the m edia w ith BA.
A gNO 3 w as indispen sab le fo r the shoo t regenera t ion.
Key words: Ch inese cabbage; Cytok in in s; Co tyledon; P lan t regenera t ion
　　大白菜 (B rassica cam p estris L. ssp. p ek inensis)
是原产于我国的重要蔬菜作物, 对我国北方蔬菜的
周年生产和度淡补缺起着重要作用。近年来, 随着各
种病虫害的加剧, 每年造成的损失不断增大, 传统育
种方法已经显露出明显的滞后性。通过基因工程技
术改良作物品种直接、快速、更具针对性。然而, 大白
菜属于十字花科AA 基因组作物, 曾被认为是最难
以转化的作物种类[1 3 ] , 该技术应用于大白菜的研
究较少, 而且不成熟。近年来, 随着科学工作者的不
断努力, 国内外陆续出现了一些成功的报道[1, 2 ]。不
过, 多数报道转化频率较低, 材料专一性强, 重复性
较差, 不易推广。良好的再生体系是农杆菌介导的遗Ξ 收稿日期: 2002210231, 修回日期: 2003204216。基金项目: 教育部骨干教师计划项目; 华中农业大学科技创新基金 (522042000007)资助。作者简介: 卢永恩 (1974- ) , 男, 硕士, 讲师, 从事植物基因工程研究。通讯作者 (A utho r fo r co rrespondence. E2m ail: zbye@m ail. hzau. edu. cn)。
传转化的基础, 因此, 转化困难的原因之一可能就在
于没有找到适合的再生体系。本研究以大白菜子叶
为外植体, 通过 2 种不同细胞分裂素分别建立了不
同的高效再生体系, 并比较了 2 种再生体系的异同,
为基因工程改良大白菜品种奠定了基础。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
华阳三号 (H Y) 和鲁白六号 (LB ) 大白菜市售种
子, 取其无菌实生苗子叶为外植体。
1. 2　无菌苗培养
将种子用自来水洗净, 去除杂质, 70% 酒精浸泡
1 m in, 再用 0. 1% H gC l2 溶液表面灭菌 30～ 40 m in,
灭菌蒸馏水冲洗 3～ 4 次, 接种于 1ö2M S 培养基上,
于 (25±2)℃、光照强度 1 800 lx, 16 h 光ö8 h 暗的
光周期培养无菌苗。4～ 5 d 苗龄即可使用。
1. 3　外植体培养
近生长点处, 用锋利的刀片切取大白菜无菌苗的
具柄子叶为外植体, 进行如下处理。取H Y 子叶外植
体, 接种于含 TD Z ( 0125、015、110、210 m göL )、
NAA (0、015、110 m göL ) 各组合的M S 基本培养基
中。取 H Y 和LB 子叶外植体, 接种于含BA (1、2、
4 m göL )、NAA (0、015、1、0 m göL ) 各组合的M S 基
本培养基中。各培养基附加 5 m göL A gNO 3 (过滤灭
菌)、蔗糖 3%、琼脂粉 710 göL , pH 518。同时在组合
0125 m göL TD Z+ 015 m göL NAA 与组合 2 m göL
BA + 015 m göL NAA 中设置不加A gNO 3 的处理。
每个组合分装到 3 个直径 9 cm 的培养皿中设成重
复。子叶柄插入培养基中, 每皿约 30 个外植体, 培养
条件同无菌苗生长条件。观察比较其再生情况, 每
10 d 转移至新鲜培养基中, 4 周后统计再生频率。
1. 4　再生苗生根与移栽
待再生芽长到 1 cm 左右时切下, 转移到含
012 m göL NAA 和 015 göL 活性炭的M S 培养基中
继续生长并诱导生根, 2～ 3 周后即可形成根系, 开
瓶练苗 2～ 3 d, 洗去附着的培养基, 移栽入装有灭菌
沙土的花盆中, 塑料薄膜覆盖保湿 2～ 3 d, 之后按实
生苗植株管理即可成活。
2　结果与分析
2. 1　子叶外植体在含 TD Z 培养基中的再生
大白菜子叶在含有 TD Z 的培养基中再生频率
很高, 有的组合可达 100% (表 1)。NAA 对再生频率
的影响较大, 不含NAA 的组合较含NAA 的组合再
生频率低, 不过随着 TD Z 浓度的增加, 再生频率呈
现增高的趋势。TD Z 与NAA 所有组合, 再生频率
均可达到 90% 以上。NAA 的 2 种浓度 (015 m göL、
110 m göL ) 对再生频率影响不大, 但较高浓度的
NAA 含量导致了较多的毛状根, 不利于外植体的
继代培养操作。
子叶在含 TD Z 的培养基中再生更为迅速, 外植
体置于培养基中 4 d 即可见到子叶柄处开始膨大,
8～ 10 d出现多个芽点, TD Z 浓度高的组合出芽也
迅速。整个再生过程中没有产生稀疏愈伤组织。
0125 m göL TD Z+ 015 m göL NAA 组合中, 再
生频率为 9818% , 再生芽也很正常 (图 1: A )。TD Z
浓度提高, 再生频率基本保持不变, 单个外植体的着
生芽增多, 但畸形芽的比例也随之增加, 有的芽点只
能发育成 1 片叶子, TD Z 浓度越大, 畸形越明显, 畸
变频率越高。综合比较, 组合 0125 m göL TD Z+
015 m göL NAA 是最适宜大白菜子叶的再生体系。
表 1　子叶在含 TD Z 不同激素组合培养基上的再生
T able 1　R egeneration of co tyledonary exp lan ts in
differen t m edia supp lem ented w ith TD Z
激素配比 (m göL )
Com bination of ho rmones
TD Z NAA
H Y再生频率 (% )
R egeneration
frequency
H Y
0. 25 0　 36. 6 d
0. 25 0. 5 98. 8 a
0. 25 1. 0 96. 7 a
0. 5 0 37. 7 d
0. 5 0. 5 98. 0 a
0. 5 1. 0 93. 4 a
1. 0 0 66. 1 b
1. 0 0. 5 92. 5 a
1. 0 1. 0 100 a
2. 0 0 56. 4 c
2. 0 0. 5 100 a
2. 0 1. 0 100 a
　　注: 邓肯氏差异显著性测验, Α0. 05水平显著。
N o te: D uncan’s m ult ip le range test a t 0. 05 level.
2. 2　子叶外植体在含BA 培养基中的再生
2 个品种的子叶在各种培养基中均能直接再生
成芽 (表 2) , 最佳激素组合为 2 m göL BA + 015 m gö
L NAA , H Y 与LB 的再生频率分别达到 9218% 和
8214%。实验中发现, 随着BA 浓度升高, 产生的愈
伤组织增多, 且疏松, 难以分化出芽, NAA 浓度升
高, 产生大量不定根, 芽分化有所减少。证明两者的
配比对子叶不定芽分化有较大影响。在最佳激素组
合培养基上, 形成的愈伤很少, 只是子叶柄处膨大,
263 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
继而有 4～ 5 个绿色芽点从内部突出, 逐渐分化成
芽。整个再生过程周期很短, 两周左右即可见到分化
的小芽, 继而发育为正常植株, 很少有畸形芽产生。
表 2　子叶在含 BA 不同激素组合培养基上的再生
T able 2　R egeneration of co tyledonary exp lan ts in
differen t m edia supp lem ented w ith BA
激素配比 (m göL )
Com bination of ho rmones
BA NAA
再生频率 (% )
R egeneration frequency
H Y LB
1 　0 54. 8 e 46. 0 f
1 0. 5 76. 5 cd 58. 4 de
1 1. 0 78. 3 bc 47. 0 f
2 0 72. 3 cd 71. 7 bc
2 0. 5 92. 8 a 82. 4 a
2 1. 0 87. 2 ab 80. 5 ab
4 0 67. 2 d 54. 2 ef
4 0. 5 75. 6 cd 61. 4 de
4 1. 0 72. 1 cd 65. 5 cd
　　注: 邓肯氏差异显著性测验, Α0. 05水平显著。
N o te: D uncan’s m ult ip le range test a t 0. 05 level.
综合比较, TD Z 和BA 2 种细胞分裂素都能够
很好地促进子叶外植体再生。含有 TD Z 的培养基
中, 0125 m göL TD Z+ 015 m göL NAA 组合最优,
而含有BA 的培养基中, 2 m göL BA + 015 m göL
NAA 组合最优, 前者再生频率高, 再生周期更短,
单个外植体再生芽更多。表明 TD Z 较BA 具有更强
的细胞分裂活性, 较低浓度 (0125 m göL ) 足以促进
细胞旺盛分裂和分化。高浓度的TD Z 虽然增加芽点
数, 同时也导致大量的畸形芽产生, 再生芽生长缓
慢, 实际再生频率反而下降, 不利于成苗。以BA 为
细胞分裂素的培养基的再生苗没有发现明显的芽畸
变现象。
2. 3　AgNO 3 对子叶再生的影响
A gNO 3 对子叶再生的影响极大, 几乎有决定性
作用, 添加A gNO 3 与不添加A gNO 3 相比较, 两者
之间差异极显著 (表 3) (图 1: A , B )。在 2 m göL
BA + 015 m göL NAA 组合中, H Y 和LB 再生频率
分别由 9218% 和 8214% 降低到 419% 和 613%。在
0125 m göL TD Z+ 015 m göL NAA 组合中, H Y 再
生频率也大幅度降低, 从 9818% 到 16%。同样在缺
乏A gNO 3 情况下, TD Z 组合再生频率高于BA 组
合, 表明 TD Z 组合对大白菜子叶再生的促进能力
强, 受A gNO 3 影响较小。
表 3　AgNO 3 对子叶再生的影响
T able 3　Effects of A gNO 3 on shoo t regenerat ion from
co tyledon of Ch inese cabbage
培养基
M edia
再生频率 (% )
R egeneration frequency
H Y LB
2 m göL BA +
0. 5 m göL NAA
0. 25 m göL TD Z+
0. 5 m göL NAA + A gNO 3 92. 8 a 82. 4 a- A gNO 3 4. 9 b 6. 3 b+ A gNO 3 98. 8 a NA
- A gNO 3 16 b NA
　　注: 1. NA 2无实验数据; 2. 邓肯氏差异显著性测验,Α0. 05水平显著。
N o tes: NA. D ata no t availab le; D uncan’s m ult ip le range
test a t 0. 05 level.
A. 不含A gNO 3; B. 含有A gNO 3
A. W ith A gNO 3; B. W ithou t A gNO 3
图 1　含 TD Z 培养基中 HY 大白菜子叶植株再生
F ig11　P lan t regenerat ion from co tyledonary exp lan ts of Ch inese cabbage H Y in TD Z contained m edia
363　第 4 期　　　　　　　　　　　　卢永恩等: 两种细胞分裂素对大白菜子叶再生的影响
　　再生过程中还发现, 不添加A gNO 3 时, 不仅芽
再生频率低, 芽点少, 而且周期长, 往往达 3～ 4 周以
上。切口处产生的愈伤组织多, 尤其是含 TD Z 的组
合更明显, 其愈伤较疏松。再生芽明显可以看出是从
外部愈伤分化而来, 而且表现正常 (图 1: A ,B )。
2. 4　生根与移栽
不同激素组合的再生芽长到 1 cm 左右时切下,
转移到生根培养基中诱导生根, 2～ 3 周后形成根
系, 开瓶练苗 2～ 3 d 后, 洗去附着的培养基, 移入装
有灭菌沙土的花盆中, 塑料薄膜覆盖保湿 2～ 3 d 之
后按实生植株管理, 大部分苗成活, 生长正常。
3　结论与讨论
激素是影响外植体再生的最主要因素之一, 不
同细胞分裂素对大白菜子叶再生的促进作用表现不
同。建立大白菜不定芽再生体系的报道中, BA 与
NAA 组合较多[1, 4, 5 ] , 而利用 TD Z 的报道较少。
TD Z 是一种高活性细胞分裂素, 活性相当于BA、
ZT 的 10 倍以上, 促进芽增殖[6 ] , 本文的研究结果与
之相符合。实验中 0125 m göL 的 TD Z 促进作用较
2 m göL BA 还要好, 再生频率高、芽点多、出芽迅
速。TD Z 浓度过高反而不利于子叶的有效再生, 产
生畸形芽。高浓度BA 也不利于再生, 这表明, 对于
特定基因型的特定外植体, 对不同的细胞分裂素的
要求都在一定浓度范围之内, 浓度过高和过低都影
响再生。另外, 细胞分裂素必需与一定浓度的生长素
配合, 生长素浓度过高和过低不利于植株再生, 本实
验中要求NAA 浓度为 015 m göL。2 种再生体系的
建立为成功实现遗传转化作好了前期准备工作。
组织培养过程中可产生乙烯, 不利于不定芽再
生。A gNO 3 可竞争性地作用于乙烯的受体蛋白 (一
般认为在细胞膜上) , 从而阻止或降低乙烯的毒害作
用。A gNO 3 作为乙烯抑制剂促进AA 基因组作物再
生的报道较多[4, 5, 7 10 ] , 它几乎成为与细胞分裂素同
等重要的添加成分。本实验中, 不添加A gNO 3 的情
况下, 尤其是含有BA 的组合, 再生频率从 9218%
骤然下降到 613%。A gNO 3 也可以通过影响子叶的
再生方式发挥作用, 张鹏等[9 ]以菜心子叶进行再生
研究表明: 不含A gNO 3 的培养基, 植株再生是通过
愈伤组织分化实现的; 含有A gNO 3 时, 愈伤组织生
长受到抑制, 植株是由子叶柄维管束薄壁细胞分裂
形成分生细胞团, 再由分生细胞团分化产生。本实验
的初步观察结果与之相符。M ukhopadhyay 等[3 ]认
为后一种再生方式不利于农杆菌介导的遗传转化,
这一观点可能有助于对AA 基因组作物难于转化的
理解, 寻求适宜的基因型和建立不含A gNO 3 的高
效再生体系, 可能是解决大白菜遗传转化的有效途
径。
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