全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (6) : 405～ 408
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体D NA 的AP-PCR 分析Ξ
汪 莉　 易 平　 万翠香　朱英国ΞΞ
(武汉大学生命科学学院植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉　430072)
摘　要: 为了研究红莲型细胞质雄性不育与线粒体基因组的关系, 以水稻红莲型粤泰细胞质雄性不育系 A 和保持
系B 及杂种一代 F 1 为材料, 应用A P2PCR 分析, 用 10 个单引物对其线粒体DNA 进行扩增。实验结果表明, 不同的
引物在 3 种材料间均有不同程度的差异, 为红莲型细胞质雄性不育分子机理的研究提供了线索; 此外, 在引物 6F 1
的扩增图谱中找到一条在 YTA 和 F 1 中特异的带 TA F 6F2, Soun thern 分析 TA F 6F2不育胞质的特异性, 可能与红莲
型水稻细胞质雄性不育性状的形成有关。
关键词: 细胞质雄性不育; 线粒体DNA ; A P2PCR; 水稻
中图分类号: Q 344+ . 4; S511　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0620405204
AP-PCR Analys is for M itochondr ia D NA of CM S R ice Hongl ian Type
W AN G L i, Y I P ing, W AN Cu i2X iang, ZHU Y ing2GuoΞΞ
(T he K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology and Institu te of Genetics, Colleg e of
L if e S ciences, W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina)
Abstract: A n econom ic and eff icien t DNA po lymo rph ism assay, A P2PCR , w as adop ted to
Honglian type rice m itochondria l DNA. T he resu lt ind ica ted obviou s differences in the m t2DNA of
CM S line, m ain ta in line and its hyb rid, w h ich cou ld fu rther the research of CM S m echan ism.
T h rough the comparat ion of fingerp rin ts among the m ateria ls, a CM S line specif ic m t2DNA band
TA F 6F2 w as iso la ted. Sou thern B lo t show ed it on ly ex isted in the m t2DNA of CM S line and the
first genera t ion hyb rid. T h is band m ay be rela t ive to the fo rm at ion of CM S in Hongla in type rice.
Key words: Cytop lasm ic m ale sterility; M itochondria l DNA ; A P2PCR; R ice
　　细胞质雄性不育 (Cytop lasm ic m ale sterility,
CM S)普遍存在于高等植物中, 是受细胞核和细胞
质遗传物质双重控制的一种母性遗传性状。CM S 是
杂种优势广泛利用的基础。国内外大量的研究结果
表明, CM S 与线粒体基因组的突变有直接关系, 胞
质育性相关基因存在于线粒体 DNA (m t2DNA )
上[1 3 ]。因此, 植物线粒体基因组结构的分析对于揭
示 CM S 分子机制具有十分重要的意义。任意单引
物聚合酶链式反应 (A rb it rarily p rim ed po lym erase
chain react ion, A P2PCR ) 是一项检测DNA 片段长
度多态性的直接、快速、经济、有效的技术途径。该方
法利用 PCR 扩增的原理, 用一个寡聚核苷酸引物指
导 PCR 扩增, 获得DNA 指纹图谱, 从而提供DNA
多态性信息[4, 5 ]。本研究采用A P2PCR 技术, 通过对
红莲型水稻不育系, 保持系, 杂种一代的线粒体
DNA 进行体外扩增和A P2PCR 指纹图谱的比较,
了解其不育系与可育系线粒体DNA 的结构差异,
获得与 CM S 相关的特异扩增片段, 为深入阐明红ΞΞΞ 通讯作者 (E2m ail: zhuyg@public. w h. hb. cn)。收稿日期: 2002204219, 修回日期: 2002209205。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (3070568)。　作者简介: 汪莉 (1977- ) , 女, 硕士研究生, 主要从事水稻细胞质雄性不育的分子机理研究。朱英国, 男, 教授, 博士生导师, 主要从事植物发育遗传学和植物雄性不育及育性恢复的分子机理等方面的研究。
莲型细胞质雄性不育水稻 (HL 2CM S) 的分子机理奠
定基础。
1　材料与方法
材料: 红莲型水稻粤泰细胞质雄性不育系
(A )、保持系 (B )和杂种一代 (F 1)。
材料的培养: 上述种子经 10% 次氯酸钠表面消
毒 10 m in, 蒸馏水洗涤多次, 除去水面的空瘪粒后,
37℃浸种 2～ 3 d。发芽后置 28℃避光培养 8～ 10 d。
收获的黄化苗立即使用或- 70℃保存。
线粒体DNA 的提取: 以黄化苗为材料, 研磨匀
浆, 经差速离心和蔗糖密度梯度离心, 分离纯化无叶
绿体的线粒体。线粒体及线粒体DNA 提取的具体
操作参照M ignouna 等的方法[6 ]。
引物: 共使用 10 个单引物 (表 1)。
AP-PCR扩增: 在50 ΛL 的反应体系中, 含50 ng
表 1　AP-PCR 引物及其序列
T able 1　T he arb itrary p rim ers used in A P2PCR reaction
引物
P rim er
寡聚核苷酸片断长度
L ength of
o ligonou leo tide
序列
Sequence
6F 1 18bp 5’2cgatcacaatcatgtggt23’
6R 1 18bp 5’2caacctaattccagaccg23’
6F 2 15bp 5’2caatccttggtagag23’
6R 2 18bp 5’2taa tggcagtgggactcc23’
A F 18bp 5’2gaattctcacccagagct23’
A R 18bp 5’2agagctctgtt tccaaac23’
cobF 18bp 5’2ggaaccaacgattctctc23’
cobR 18bp 5’2cttgaactacgcacatac23’
cox F 18bp 5’2tcgctct t tgtgatgctg23’
cox R 18bp 5’2tcactgcactgaccatag23’
线粒体DNA , 2 Λmo löL 的单引物, 012 mmo löL 的
dN T P s, 2 mmo löL 的M gC l2, 510% 的甲酰胺和 2U
的 T aq 酶。扩增的步骤为: 模板DNA 在 95℃变性
5 m in, 然后开始扩增循环。先以 94℃ 1 m in、36℃
2 m in、72℃ 2 m in 进行 4 个循环; 继之以 94℃ 45 s,
42℃ 45 s, 72℃ 60 s 扩增 30 个循环。最后一个循环
结束后 72℃保持 10 m in, 以便DNA 链充分延伸, 再
放入- 20℃保存或立即取样电泳。
扩增产物的检测: 取 20 ΛL 扩增产物点样于
118% 的琼脂糖凝胶上电泳。缓冲液为 1×TA E, 分
子量标记为 ΚDNA öEcoR É öH ind Ë 双酶切片段。
电泳结束后取凝胶在UV 灯下观察, 记录电泳分离
结果。
Southern 分析: 用随机引物法标记 PCR 扩增
并纯化回收后的产物与线粒体 DNA 进行杂交。
PCR 产物回收试剂盒和随机引物标记试剂盒分别
购自C lon tech 公司和Roche 公司。
2　结果
2. 1　AP-PCR 指纹图谱的比较
在本实验所建立的扩增条件下, 运用A P2PCR
方法对红莲型水稻粤泰细胞质雄性不育系A、保持
系B 和 F 1 杂种的线粒体DNA 进行了差异比较分
析。所用的 10 个单引物的扩增产物经电泳分离均得
到了清晰的DNA 扩增图谱, 且重复性好。其中揭示
出差异的引物有 6 个, 分别为 6R 1、6F 1、6F 2、cobF、
cobR、cox F。图 1 为 6F 2 和 cobR 的扩增结果。
(a) 6F 2 的扩增结果; (b) cobR 的扩增结果。A 示不育系; B 示保持系; F 1 示红莲 1 号;M 示DL 2000 m arker
(a) Amp lication w ith p rim e 6F 2; (b) Amp lication w ith p rim e cobR. L ane A. YuetaiA ; L ane B. YuetaiB; L ane F 1.
Honglian N o. 1; L ane M. DL 2000 m arker
图 1　红莲型水稻A , B, F1 中AP-PCR 扩增结果
F ig. 1　Amp lication w ith A P2PCR in m t2DNA of HL 2CM S rice
604 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　
　　水稻线粒体的A P2PCR 扩增产物的片段大小
在 150～ 2 000 bp 之间, 其大致类型可分为 4 类, (1)
不育系A、保持系B 和 F 1 杂种中均能产生的相同的
主扩增带。在每种引物的扩增图谱中均存在该种类
型的扩增带, 它们反应了线粒体DNA 在进化上的
保守性。 (2) 不育系A 和 F 1 杂种所特有的扩增带,
该带在保持系B 中缺失。如引物 6F 2 的 2 100 bp 片
段 TA F 6F2; 引物 cobR 的 1 000 bp 片段 TA F cobR; 引
物 cox R 的 1 600 bp 片段 TA F coxR。 (3) 保持系B 所
特有的扩增带。如引物 coxR 的 1 000 bp 片段
TB coxR。 (4) F 1 杂种所特有的扩增带。如引物 6F 2 的
850 bp 片段 T F 6F2。
2. 2　Southern 分析
用片段 TA F 6F2, TA F cobR , TA F coxR , TB coxR , T F 6F2
为探针进行R FL P 分析, 图 2 为杂交分析结果。杂交
结果显示, 探针 TA F 6F2与 3 种内切酶的组合中, 粤
泰A 和 F 1 杂种有一条强杂交带, 而粤泰B 中没有
杂交信号。与 PCR 的结果相一致, 由此可见该片段
的真实性和特异性。
A 示不育系; B 示保持系; F 1 示红莲 1 号; M 示 ΚDNA ö
EcoR É öH indË m arker
A. Yuetai A ; B. Yuetai B; F 1. Honglian N o. 1; M. DNA ö
EcoR É öH indË m arker
图 2　TAF6F2的 Southern 杂交分析
F ig. 2　Southern hybridization w ith p robe TA F 6F2
3　讨论
细胞质雄性不育系的创建是采用水稻远源杂交
和核置换的方法。红莲型细胞质雄性不育系 (HL 2
CM S)是以红芒野生稻为母本, 莲塘早为父本经连
续回交而育成。粤泰A 是以原始的HL 2CM S 胞质
为材料与粤泰B 回交数代得到的, 因此不育系A、
保持系B 有相同的核背景和不同的细胞质; F 1 是不
育系A 与恢复系的杂交一代, 与不育系A 具有一致
的细胞质和部分相同的核背景。研究CM S 与线粒
体DNA 的相关性时, 往往从分析不育系A、保持系
B 的m t2DNA 多态性入手, 继而研究功能基因或差
异片段在不育系A、保持系B 中及恢复基因存在条
件下的时空表达的特点, 力求揭示该片段或功能基
因与CM S 可能的相关性。本试验对引物的选择是
以早先红莲不育体系的线粒体基因组R FL P 分析
结果为依据的[9 ] , 该结果证实线粒体基因 a tp 6、cob
及 cox 2 在不育系A、保持系B 的m t2DNA 中存在
多态性, 其中 a tp 6 的差异最为明显。笔者以 a tp 6 基
因为分析重点, 设计了两套引物, 引物的大致位置见
图 3。此外以 a tpA 为对照的同时对 cob、cox 2 进行了
扩增分析。结果表明, 10 个引物中有 6 个引物在不
育系A、保持系B、F 1 中产生了多态性带型。其中
a tp 6 引物有 3 个, 其余 3 个分别为 2 个 cob 和 1 个
cox 2 基因的引物, 该结果进一步证实了不育系A、
保持系B、F 1 的线粒体基因组的功能基因区段在
DNA 水平上存在差异。对这些基因的表达分析正在
进行中。
a tp 6
3’ 5’
→
6F 1
→
6F 2
←
6R 2
←
6R 1
图 3　a tp 6 基因引物的设计
F ig. 3　T he design of arb itrary p rim er a tp 6
A P2PCR 分析方法是 1990 年发展的一种基于
PCR 原理的分子标记的方法, 利用A P2PCR 进行物
种系谱的区别和鉴定[8 ]、克隆目的基因的启动子序
列[9 ]均已见报道。1995 年, 此方法应用于植物线粒
体基因组的分析, 拓宽了该技术的应用范围[10 ]。其
真实性和可靠性在本文中得到了验证。6F 2 引物扩
增得到的X 片段为不育胞质所特有的, Sou thern 杂
交分析进一步证实了这一点, 在 3 个酶切组合中, 不
育系A、F 1 中均存在一条大小一致的杂交带, 而保
持系B 中缺失。
CM S 相关基因是由于线粒体基因组分之间或
分子内的频繁重组而产生, 它往往由功能基因的一
部分和未知来源的序列融合而成, 且常常与功能基
因共用一个转录启动子, 形成共转录本[11 13 ]。我们
的研究结果一方面进一步证明了红莲型不育系和保
持系的线粒体基因组在 a tp 6、cob、cox 2 等基因区域
存在DNA 水平上的差异, 同时还表明在不育系A、
704　第 6 期　　　　　　　　 　汪 莉等: 红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体DNA 的A P2PCR 分析
保持系B 中, 这些功能基因区域的 5’ 端存在较高的
多态性, 对差异片段的克隆和序列分析, 将有助于
CM S 相关嵌合基因的发现。
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