全 文 ：第 6 卷
V ol
.
6 N o
第 1 期
1
草 地 学 报
A CTA A(;刊澄井[A SIN CA
1卯 8 年
1卯 8
热研二号柱花草组织培养研究
蒋昌顺 黄慧德 邹冬梅
(中国热带农业科学院农牧研究所 , 海南省檐州市 5 7 17 37 )
陈守才 吴 豪
(华南热带农业大学热带作物生物技术国家重点实验室 , 海南省澹州市 57 17 3 7 )
摘要 : 研究结果表明 , 利用热研二号柱花草无菌苗的子叶为外植体 , 在 M2 培养基 (MS 基本成
分 + 0 . 8% 琼脂 + 3 . 0 % 蔗糖 + 1刀n可L 蔡乙酸 十 4 . o n娜L 激动素 , pH6 . 0) 培养可诱导分化出愈伤组
织和枝条 。 l 月龄枝条在 M7 培养基 (1/2 MS 基本成分 + 0 . 8 % 琼脂 十 1 . 0 % 蔗糖 + 0 . 5 1吸犷L 禁乙酸
十 0 . 05 % 活性炭 , pH 6 . 0) 培养可诱导生根 , 生根率 印% , 获得了具有根 、茎 、叶的完整柱花草组培植
株 。 25 和 50矛堪/ 耐浓度的卡那霉素均能完全抑制子叶形成愈伤组织和愈伤组织再分化。
关键词 : 柱花草 ; 组织培养
1 前言
柱花草 (st了los喇hes sp . ) 是一种优良的热带豆科牧草 , 自花授粉 , 原产中南美洲 , 该属有
种或亚种 4 个 以上 (stac e 等 , 19 84 ) 。 作为栽培 品种主要 有库克柱花 草 (5 . g u 砚刀亡瓜 15 cv .
Cok )
、有钩柱花草 (5 . 人d川在勿 )、格拉姆柱花草 (s . gu ~ 。15 cv
.
G 烧Ihan l)
、矮柱花草 (s . hu -
耐is ) 、西卡柱 花草 (5 . ~ ) 、头状 柱花 草 (5 . cop u诚 z )、热 研二 号柱 花草 (5 . gu 记ne ns is cv .
Re yan n )(又名 184 柱花草 )等 。 现 已在中南美洲 、大洋洲 、亚洲 、非洲的热带和亚热带国家种
植 , 主要用于放牧 、水土保持 、果园间作 、青饲料及干草粉加工 。 亚洲的中国 、越南 、泰国 、印度 、
印尼 、马来西亚 、老挝 、菲律宾等国家均有种植 (ACA IR , 19 6 )。 中国在本世纪五十年代初开始
引种柱花草 , 主要用于橡胶园覆盖 , 但现在的用途越来越广 , 仅广东省果 园种植热研二号柱花
草累计达 6 . 7 万公顷 , 成为热带亚热带地区的希望之草 , 展示出广阔的前景。 但是炭疽病严重
威胁着柱花草的进一步推广种植 (蒋昌顺 , 19 5 )。 19 5 年以国际热带农业中心 (CIA T ) 和澳大
利亚热带作物病理合作中心 (CR 耳,P )为主要成员的国际合作组织共同攻关 , 旨在通 过抗病品
种或种的原生质体融合或利用遗传工程获得抗病的转基因柱花草植株以便培育新 的抗病品
种。
国外柱花草的组织培养研究始于 19 76 年 (Sc o wr 砍 等 , 19 76 ) , 获得成功的品种有 :有钩柱花
草(M ei罗 r , 19 82 )、矮柱花草 (Me i罗r 等 , 19 8 1 )、库克柱花草(Me i罗r 等 , 19 8 3 ; Mrogi ns ki等
,
19 8 1)
、
圭亚那柱花草 (5 . 9山。ne o is ~ 邵浓工配了“is )(唐湘梧
,
19 8 9 )
、
CIA犯24 3 柱花草 (国际热带农业 中
心编号 )、c认T 13 6 柱花草 、 CIAT 101 9 柱花草 、 C认长2 大头柱花草等 (R改峭go , 1卯4 )。 但国内的
柱花草组织培养研究 尚属空 白。 热研二号柱花草是中国热带农业科学院农牧研究所选育的高
. “九五 ”农业部畜牧业重点科研专题 95 一 牧 一 02 一 02 一 14 部分内容
草 地 学 报 19 8 年
产 、优质 、耐病品种 , 在中国 目前柱花草栽培品种 中推广面积最大 。 选择热研二号柱花草进行
组织培养研究 , 旨在为下一步抗炭疽病转基因育种创造条件 , 因此具有重要的现实意义和理论
意义 。
2 材料和方法
2
.
1 热研二号柱花草种子由中国热带农业科学院热带牧草研究中心提供 。
2
.
2 试验所用培养基经高压灭菌 (见表 1) 。 所需卡那霉素在培养基灭 菌后冷到 5 ℃ 以下时
加人 。
表 1 试验用培养基成份
Tab l
e 1 Co m lx 刀iti o n Of n 祀di a in th e E x详ri n l ents
琼脂(% ) 蔗糖(% )
Su e l、x 艾,
禁乙酸
N从(n可 l)
激动素
BA(
n娜l)
活性炭(% )
Ae ti v e ehi 川〕‘川
3
.
0
3
.
0
3
.
0
4
.
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4
.
0
a一了O八气一“UO
培养基
M曰i a
MSI ’基本成份强度
欣此 n gth of bas ic MS
0
.
7
0
.
8
0
.
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.
8
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.
8
0
.
8
1
.
0
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.
0
0
.
0 1
0
.
1
0
.
05
6
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2
.
3 无菌苗培养 ( R记ri go , 19 4 ) 培养基为 M l 。 去掉种子表面的褐色种衣 , 经 80 ℃热水处理
5 分钟 , 70 %酒精灭菌 5 分钟 , 无菌水冲洗一次 , 10 % 次氯酸钠灭菌 ro 分钟 , 无菌水冲洗三次
后 ,将种子放在无菌滤纸上吸干其表面水分后 , 在超净台上接种 到含 M l 培养基的三角瓶 内
( 12 粒 / 瓶 ) 。 培养条件为 28 ℃ , 光照时间 12 小时 , 光照强度为 5 ME / 而S 。 (以下培养条件同
此 ) 。
2
.
4 愈伤组织诱导 (M ei ge r 等 , 1981 ) 培养基为 M2 。 分别以无菌苗上刚展开的子叶 、长出 2
片真叶后的子叶 、长出 4 片真叶后的子叶 、第一展叶 (真 叶 ) 、胚根 、胚轴 、幼茎为外植体进行愈
伤组织诱导培养 。 每瓶 6 片外植体 , 重复 2 个 。 研究其形成愈伤组织的难易及分化速度 。
2
.
5 愈伤组织继代培养 ( Mei ge r 等 , 19 8 3) 子叶形成的愈伤组织分别在 M3 、M4 、MS 三种培养
基上继代培养 ,研究其分化趋势 。
2
.
6 生根培养 (Mv ogi ns ki 等 , 1981 ) 被切除愈伤组织后不同成熟度的枝条 , 在 M6 、 M7 、 M S 三
种培养基上进行生根培养 , 研究适于生根的最适枝条和最佳培养基 。
2
.
7 卡那霉素抑制生长试验 (李浚明 , 192 ) 以浓度为 。
、
25
、
50
、
75
、
10 拼g / 时 的卡那霉素处
理 , 加人到 M2 培养基中 , 重复二个 。 分别培养子叶和愈伤组织 , 研究卡那霉素抑制其生长的
最低浓度 。
3 结果与分析
3
.
1 筛选出最佳外值体
试验用热研二号柱花草的 7 种外植体均可诱导出愈伤组织 , 其愈伤组织诱导率达 10 % ,
第 1期 蒋昌顺等 热研二号柱花草组织培养研究
其中刚展开的子叶和长出 2 片真叶后的子 叶分化 出芽的时间较快 , 从接种到出芽约需 ro 天 。
而以第一展叶为外植体 ,其愈伤组织先分化出根 , 而未分化 出芽 (表 2 )。 在热研二号柱花草组
织培养时 ,最好选择刚展开子叶或长出两片真叶后的子叶为外植体 。
表 2 热研二号柱花草外植体诱导愈伤组织及其分化 (1卯7 )
毛山le 2 c al us illd uc tion an d 祀(Ij且论re nti ati on 玩m di 玉二nt e x pla! lts of 5 . 邵“刁刀召璐 15 cv . Re yan n
外植体
公Plant
接种时间
In oc ul ati
o n
da t
e
分化愈伤
组织时间
Cal us ind uc ti
o n
山te
愈伤组织诱导率
Cal lus ind uc ed
.
freq
u e n e y (% )
芽分化时间
Sh 侧力ng ds te
根分化时间
R o o tjng dat
e
刚展开子叶
Co ty led
0 IE sprea di ng in tial y
5 月 23 日 5 月 30 日 6 月 12 日 未分化
Undi fe 化nti at io n
具两片真叶的子叶
Co ty l曰o ns wi th a p山 r of leafl ets
5 月 23 日 5 月 28 日 6 月 10 日 未分化
Un di fe re nti ati on
具 4 片真叶的子叶
Co tyled ons 诫 th 4 lean ets
5 月 23 日 5 月 2 6 日 6 月 28 日 未分化
Ulldi 玉re n tiati o n
真叶
T即门ets
5 月 23 日 5 月 2 8 日 未分化
U n dife re nti ati on
6 月 30 日
胚轴
H yp 祀o tyls
5 月 23 日 5 月 so 日 7 月 3 日 未分化
U n dife re nti 西o n
胚根
R 出五d es 5 月 23 日 5 月 30 日 7 月 3 日
未分化
U n dj丑毛re nti ati on
幼茎
Y。四9 shots
5 月 2 3 日 5 月 30 日 6 月 2 8 日 未分化
U rl山氏re n ti a ti o n
3. 2 愈伤组织继代培养
子叶形成的愈伤组织在繁殖培养基 M 3 上可较好地得以繁殖 , 并分化出大量枝 叶 , 但在诱
导生枝叶的培养基 M4 上则呈现黄褐化 , 不生长 。 带愈伤组织的枝条可以在诱导愈伤组织生
根的培养基 M S 上分化出根 ,但需时较长 , 约 45 一 50 天 。 作为热研二号柱花草的组织培养 , 诱
导愈伤组织分化枝叶可直接在 M 3 培养基上进行 。
3
.
3 不带愈伤组织的枝条生根培养
2 月龄稍老枝条在 M6 、 M7 培养基上培养后不生根 , 而在 M S 培养基上只有 30 % 的枝条生
根 。 1 月龄的嫩枝条在 M6 、M 7 培养基上可以生根 , 生根率分别为 30 % 、印% , 但在 MS 培养基
上则不生根 (表 3) 。 说明在诱导枝条生根时 ,选择 1月龄嫩枝条 , 采用 M 7 培养基培养 , 其生根
率高 ,且所需时间较短 。
3
.
4 卡那霉素抑制分化与再分化的浓度
在 M2 培养基 中分别加人 25 、50 、75 和 10 拜岁nil 的卡那霉素 , 结果均可抑制子叶形成愈伤
组织 , 而在不含卡那霉素的 MZ 中培养 , 7 天后便 出现愈伤组织 。 抑制植株分化所需卡那霉素
草 地 学 报 19 8 年
浓度应提高到 50 胖酬耐(表 4) 。 说明在抗性植株筛选中 , 抑制子叶形成愈伤组织和再生植株分
化所需卡那霉素浓度分别为 25 和 50 2上g / nil 。
表 3 两种类型枝条在不同培养基上的生根观察
Tal且e 3 R o ti ng of two typ 防 of sho 臼 on d ife re nt m 已山a
枝条类型
T坪es of sho ts
培养基
Me dia
接种时间
Inoc 』a ti o n da te
生根时间
R o ti ng da t
e
生根率(% )
R o t in duc ed 脉p le n ey (% )
1 月龄枝条
C的e 卿 n th ol d sho o ts
1 月龄枝条
O叭e mo
n th ol d sho ts
l月龄枝条
。n e
Ino
llth ol d sho ts
2 月龄枝条
T w o 11刃n th ol d sho o ts
2 月龄枝条
T w o n l o n d l ol d sllo ts
2 月龄枝条
T w o n l o n th ol d sho 比
M6
19 7 年 7 月 8 日 7 月 20 日
7 月 8 日 7 月 16 日
7 月 3 日
M6 7 月 8 日
7 月 8 日
未见生根
N o l飞洲〕tS
未见生根
N o r o o ts
未见生 根
No
p o o ts
7 月 3 日 7 月 20 日
表 4 不同浓度卡那舞素抑制愈伤组织形成及植株分化 ’
Tab l
e 4 庙fe 二n t e o nc e n tra tlo n of 肠划 11ye in i而 biti飞 e al us fo rn 祖 tion 田ld r以11扭王re lti ati o n
卡那霉素浓度(共留耐)
K田 1田n yc in co nC e n tl 习ti on
诱导子叶形成愈伤组织
Cal lus in d u e ti o n 加m eoty led o n
植株分化
Pl 出It 似life re nti ati o n
8 月 7 日分化出愈伤组织
Fo m 坦七o n of eal us in At lgU st 7
8 月 4 日分化出芽
Buds
’ e
me 飞e nc e in Allgt 场 t 4
8 月 6 日出现黄褐 , 以后 出现少量芽
few条
8 月 7 日出现黄褐 , 没有分化出愈伤组织
Tun
l以1 ye Uow- 1
〕ro wn in A
llgt lst 7
, 出记 no c al -
lus fo rm 以」
T明led ye now- b~bu ds de ve lol初 late r
in A u邵巧t 6 , 朋d
8 月 6 日出现黄褐 , 没有分化出愈伤组织
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, 明d n o eal -
lus fo n n ed
8 月 4 日出现黄褐 , 以后仅分化 出
芽 , 但后来死亡
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o 记y one
8 月 6 日出现黄褐 , 没有分化出愈伤组织
Tun
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, 出ld n o eal -
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8 月 4 日出现黄褐 , 以后没有分化出芽
Tum ed ye n~ bro wn in A
u邵娟 t 4 , 阴d no
bu ds d e v el甲记
1o
8 月 4 日有 1/ 3 的子叶被杀死 , 没有分化
出愈伤组织
O叭e thi rd c oty led
o ns we re 曰ed in A钩多坦t 4 ,明d no ca] lus fo rm 曰
8 月 4 日出现黄褐 , 以后没有分化出芽
Tu n led yel ow- bro wn in A切, 巧 t 4
, 阴d no
bu ds de vel 甲妇
* 1卯 7 年 7 月 30 日接种培养 Cult , st田七ng 肠n 1 )吻 30 , 19 7
4 结论
4
.
1 热研二号柱花草的组织培养 , 可选择无 菌苗的子叶在 MZ 培养基上培养 , 结果 能诱导出
第 1期 蒋昌顺等 热研二号柱花草组织培养研究
愈伤组织和枝条 。 1 月龄枝条在 M7 培养基上培养 , 有 60 % 的枝条生根 , 并获得完整的柱花草
组培植株 。 25 和 50 “群耐 的卡那霉素均能完全抑制子叶形成愈伤组织和愈伤组织再分化 。
4
.
2 热研二号柱花草组织培养与柱花草属其它品种有相似性 ,但亦有其特点 。 试验所探索的
方法和技术是可行的 , 并为下一步柱花草转基因抗炭疽病育种创造了极有利的条件 。
参 考 文 献
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