全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(4)：371～376
Journal of Wuhan Botanical Research
琼脂固体培养基培养蜜环菌菌索总 DNA的提取
邓艳芹 ，李作洲 ，王传华。，黄宏文
(1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074；2．中国科学院研究生院，北京 100039；
3．三峡大学化学与生命科学学院，湖北宜昌 443002)
摘 要：野外采集的蜜环菌[Armilaria mellea(Vah1．ex Fr．)Que1]在提取DNA前需要分离获得纯化的菌丝体。常
规液体培养获得菌丝团的方法感杂率较高，采集固体培养基表面 ceHophane膜上形成的菌丝则难以获得足量的
DNA提取材料。蜜环菌细胞内含有大量多醣类物质，也使得蜜环菌高质量DNA的提取存在一定的困难。本研究
通过改进试验，提供一个直接从琼脂固体培养基培养的蜜环菌菌索中提取高质量 DNA的方法。其中样品的预先
冻融处理方法可以促使蜜环菌菌索与琼脂分离；而在裂解提取缓冲液裂解材料细胞后加入 1．25 mol／L KAc溶液，
则有利于除去蜜环菌细胞内的多醣类物质以及残留的少量琼脂。通过琼脂糖电泳、紫外分光光度计对 DNA浓度
及OD值的测定、ISSR引物的PCR扩增以及酶切产物的PCR扩增等方法的检测，结果均表明该方法提取的DNA
质量较好，符合进一步进行分子生物学研究的要求。
关键词：蜜环菌；菌索；DNA提取；琼脂固体培养基；多醣
中图分类号：Q523 文献标识码：A 文章编号：1000·470X(2007)04-0371-06
DNA Extraction from Rhizomorph of Armillaria mellea
Cultured by Solid Agar M edium
DENG Yan．Qin ， ，LI Zuo．Zhou ，WANG Chuan．Hua ，HUANG Hong．Wen
(1．Wuhan Botanical Garden。The Chinese Academy ofSciences，Wuhan 430074。China；2．Graduate School ofthe Chinese
AcademyofSciences。Beijing 100039，China；3．Colege ofChina Three Gorges University，Yichang，Hubei 43002，China)
Abstract：To obtain pure mycelia before DNA extraction。Armillaria melea(Vah1．ex Fr．)Quel colected
from the field need to be isolated．Traditional liquid culture purifying method has the disadvantage of lOW
efficiency．Ahhough pure mycelia can be colected from cellophane film on solid medium．it iS dificult to
obtain SUfficient materials for DNA extraction．We therefore put forward a modifed method that iS
extracting DNA from rhizomorph of A．mellea cultured by solid agar medium．The results show that agar
around the rhizomorph materials can be mostly removed when samples were pretreated via freezing．
melting．DNA extraction bu r mixed with KAC solution f 1．25 mol／L)can efectively eliminate agar and
other polysaccharid residuals．The quality of extracted DNA was then tested by a series of measures．
including ultraviolet absorption test，agarose gel electrophoresis，amplification by using ISSR primers and
digestion by restriction endonuclease Mse I．The results confirmed that the quality of extracted DNA using
this modified method iS very high．and proven to be suitable for further molecular analysis．
Key words：Armillaria mellea；Rhizomorph；DNA extraction；Solid agar culture；Polysaccharid
蜜环菌J Armilaria mellea(Vah1．ex Fr．)Que1]
属于伞菌 目口蘑科 (Tricholomataceae)蜜环菌属
[Armilaria(Fr．)Staude]，是一个包含多个生物种
(bio-species)的真菌类群，常称为蜜环菌复合种
(A．melea complexes)u-3]。蜜环菌属真菌子实体形
态变异较大，寄主广泛，具有根状菌索是其区别于其
它属真菌的典型特征 J。不同于其它担子菌类真
菌的双核菌丝，蜜环菌属真菌在营养体阶段呈现单
核双倍体化，可能有利于其高度分化的菌索的功能
发挥 J，使得其成为世界温带和寒温带森林林木根
腐病或干基腐病的重要病原菌，造成大量林木死亡
腐烂，带来了重大经济损失，引起了病理学家的关
注，对蜜环菌的综合防治和有效生物控制是亟待解
决的问题 。蜜环菌具有一定的药效【7 J，具有重要
经济价值，同时蜜环菌还是著名中药天麻和猪苓的
共生菌和营养源 J，蜜环菌与天麻、猪苓间的共生
收稿 日期：2006 12—12，修回日期：2007—02．12。
基金项目：国家 自然科学基金资助项目(30370145)。
作者简介：邓艳芹(1980一)，女。硕士，从事植物共生真菌分子生态学研究。
通讯作者(Authorfor corespondence．E-mail：hongwen@wbgcas．cn；lizz@Yo$e．whiob．ac．cn)。
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372 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
协同进化关系也引起了学者的关注，如天麻表皮细
胞与蜜环菌真菌相互作用的光学显微结构或电子显
微结构及放射自显影观察 ，但其协同进化的遗传
分子机理研究较缺乏。相关研究的开展需获取大量
的野外共生菌株样本进行遗传多样性和遗传分化分
析，但样本菌株的分离纯化，并获得高质量的蜜环菌
DNA是必备的前提。
目前多采用从蜜环菌子实体中刮取孢子接种在
固体培养基上或 SR液体培养基中振荡培养，获得
蜜环菌菌落或菌丝团后提取蜜环菌 DNA_3，∞，”]。但
是子实体只在特定季节发生，采集困难，而且与共生
天麻一一对应采样时，只能采集共生菌索或就近感
染同一蜜环菌菌株的树根来培养分离。我们的前期
研究改进了蜜环菌菌索分离培养的方法 ¨，提高了
分离培养效率。但是由于其培养基含玉米和黄豆等
植物材料 ¨，而且往往与蜜环菌菌索或菌丝紧密结
合在一起，所提取的DNA将包含玉米等植物材料的
DNA。解决这个问题的办法是将分离纯化后的蜜环
菌菌索或菌丝转接进行液体培养或转接到琼脂固体
培养基培养。由于蜜环菌菌丝或菌索易受霉菌或细
菌寄生感染_】 ，不适于在常规条件下大量接种液体
培养来提取 DNA。采用琼脂培养基培养蜜环菌方
法可以避免外源 DNA干扰，同时利用蜜环菌向培养
基内部生长的特性可以避免霉菌和细菌的二次感
染，可在常规培养条件下高效培养。但琼脂和菌索
粘在一起，会干扰 DNA的提取，同时蜜环菌自身细
胞内含有较多多醣类和其他次生代谢物质_】引，也使
得采用常规 DNA提取方法难以从蜜环菌中提取出
质量较好的 DNA。为了获得高质量的蜜环菌 DNA
用于相关研究，本研究对琼脂培养基培养蜜环菌菌
索或菌丝团的 DNA提取方法进行了探讨，旨在寻求
一 种以野外采集蜜环菌菌索为原始材料分离纯化后
提取高质量 DNA的方法，为进一步开展蜜环菌分子
生态学、植物一真菌协同进化等研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
以采 自野 外野 生 蜜环 菌 [Armilaria melea
(Vah1．ex Fr．)Que1]菌索作为试材，采用玉米一黄豆
培养基对其进行初步分离纯化后_】 ，通过琼脂固体
培养基或液体培养基对其进行纯培养，培养到一定
量的菌索或菌丝团再用于 DNA提取。以液体培养
材料提取的DNA作为对照。
1．2 方法
1．2．1 蜜环菌的纯培养
培养基配方：琼脂固体培养基参照杨新美的配
方 ¨将琼脂量减为0．8％，即：蛋白胨 2 g，硫酸镁
0．5 g，葡 萄糖 20 g，琼 脂 8 g，KH2PO4 0．46 g，
K2HPO 1 g，水 1000 mL。液体培养基在以上配方中
减去琼脂即可。
接种培养：在无菌条件下，用 70％的酒精将分
离纯化后的试管菌株的试管表面进行消毒，用无菌
小锤击碎试管底部，再用无菌接种针挑取约 1 mm
的蜜环菌菌索或菌丝组织，转接至三角瓶琼脂固体
培养基或液体培养基中，置于培养箱中20～3O℃避
光培养，相对湿度约 30％左右，液体培养置于95～
115 r／min的摇床避光培养，培养7～14 d，蜜环菌菌
索或菌丝球的生长量即可达到提取 DNA所需样品
量。将带琼脂的菌索从三角瓶中用小刀划割后，用
镊子取出包裹在琼脂中生长 良好的浅色菌索，装入
保鲜膜中，4℃保存。
1．2．2 DNA的提取
提取液体培养蜜环菌菌丝团 DNA：采用常规的
提取微生物 DNA的 SDS—CTAB方法 ¨，并在秦国
夫等方法 ，】 的基础上稍加改进，记作方法 A。
具体操作为：①将适量纯化培养的蜜环菌菌球或菌
丝团用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸轻轻挤压吸干水
分后放人研钵，在液氮下迅速研磨成粉末；②将粉末
转移到预先加有 800 L 2％ SDS裂解缓冲液(含
5％o巯基 乙醇)的 2 mL离心管中，65℃温浴 30～
40 min；③13000 r／min离心 10 min，取上清液转入
新离心管中，加入 1．25 mol／L NaC1溶液和 1／10体
积的 10％ CTAB缓 冲液，摇 匀，置 65℃ 恒温浴
15 min；④13000 r／min离心10 min，取上清液至新离
心管中，冰浴5 min后，加入等体积的酚 ：氯仿 ：异
戊醇(25：24：1)，轻摇30 rain充分混匀；⑤13000 r／
rain离心 10 min，取上清液转入新离心管，加入等体
积的氯仿 ：异戊醇(24：1)，轻轻摇匀，13000 r／rain
离心 10 rain，取上清，重复抽提 2次至界面清晰；
⑥加入 2．5倍体积预冷无水乙醇，轻轻颠倒摇匀，置
一 20~C 30 rain，沉淀 DNA；⑦ 4℃条件下 12000 r／
rain离心 15 rain，去上清液；⑧将 DNA沉淀用含
70％乙醇的脱盐洗液洗2遍，除去盐等可溶性小分
子杂质，于室温下晾干；⑨用 100 L×TE溶液溶
解。按 Ausubel等的方法_】 ，采用 RNase A消化除
去 RNA。
琼脂固体培养基培养菌索DNA：为了去除菌索
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第4期 邓艳芹等：琼脂固体培养基培养蜜环菌菌索总 DNA的提取 375
(图1，表 1)。借鉴王利明和唐建国 ¨在琼脂糖凝
胶中采用冰冻融解法获得回收 DNA的经验，对样品
预先进行冻融处理，通过冷热交替膨胀收缩产生的
机械力破坏琼脂胶的结构，使其与菌索或菌丝分离，
减少蜜环菌材料中残余琼脂的含量，使得所提取
DNA的质量得以明显提高(图1，表 1)，但与高质量
DNA的要求依然存在差距。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)为阳离子去污
剂，在高盐浓度下与蛋白质和非酸性多聚醣形成复
合物沉淀，与 DNA形成复合物在溶液中保持稳定而
不沉淀；在低盐浓度下，则沉淀 DNA和酸性多醣，将
蛋白质和中性多醣留于溶液中。因而常规 CTAB方
法难以将 DNA与酸性多醣分开。蜜环菌含有大量
酸性多醣 ，同时琼脂中的琼脂胶也为酸性多醣，
因此采用原先的 SDS与 CTAB联合的方法
难以从琼脂固体培养基培养的蜜环菌材料中提取高
质量的 DNA(图 1，表 1)。
有研究表明加人高浓度的醋酸盐有利于除去
DNA提取过程中的多醣成分，对于含较高多醣成分
材料 DNA的提取有较好的效果 J，因此在加人
2％ SDS裂解缓冲液温浴后，离心去残渣前，加人
1．25 mol／L KAc溶液对原方法进行了改进。实验
结果表明，该改进使得从蜜环菌材料(未经预冻融
处理以及经过冻融处理的样品)中提取的 DNA质
量有明显的提高。样品预冻融与加人KAc溶液相结
合处理后 DNA提取的效果更好(图 1，表 1)。其原
因可能是由于添加了KAc溶液后，一是大幅提升了
游离阳离子的量，可以通过影响多醣分子内和分子
间的相互作用而改变多醣分子的行 为 (Axelos，
1998)[24j，可能更有利于多醣与 DNA分离；二是
KAc水解后呈碱性，可以与酸性多醣作用使其成为
中性，使其在 CTAB的作用下不再与 DNA共溶解或
共沉淀，而与 DNA分离开来，获得高质量的 DNA。
冻融处理可以除去大量的残余琼脂，减少了提取液
中多醣 总量和酸性 多醣 的含量，有利于 KAc和
CTAB的效率提升，使提取的 DNA质量更高。
秦国夫的原方法[4,1o07]将 SDS裂解缓冲液和
CTAB提取缓冲液分两步进行，耗时较长，我们对其
作了改进：同时加人 SDS裂解液和 CTAB提取缓冲
液，并适当延长温浴时间。由于 SDS(十二烷基硫
酸钠)为阴离子去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，
使核蛋白解聚，DNA得以游离出来，因此延长温浴
时间可使细胞裂解更为完全，CTAB与 DNA分子更
早地形成复合物，有利于 DNA的稳定，所提取的
DNA质量进一步提高(表 1，图1)。
本研究中，蜜环菌材料的老嫩程度对DNA的质
量有一定影响，表现为幼嫩的初生菌索所提取 DNA
的质量较好，老化的菌索由于外围革质化且细胞内
次生代谢物质增多，不利于 DNA的提取。另外，菌
索表面残留的少量琼脂和蜜环菌细胞内多醣类物质
等在高盐条件下会形成白色的沉淀，在吸取上清液
时应避免吸人，以保证提取高质量 DNA。
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376 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
《西北农林科技大学学报(自然科学版)~2008年
征 订 启 事
《西北农林科技大学学报(自然科学版)》是国内外公开发行的综合性农业科学学术期刊，创刊
于 1936年，是西北地区创办最早的农业学术期刊，其前身是《西北农业大学学报》。本刊立足学
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新性或适用性的学术论文、研究简报、文献综述以及反映最新科研成果的快报。读者对象为国内外
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数据库核心期刊和中国科技核心期刊，论文被国内外多家权威性数据库和文摘期刊固定转载和收
录。1994年以来，本刊连续进入“被引频次最高的中国科技期刊300名排行表”，在全国和陕西省
科技期刊综合质量评比中，先后 2O余次获奖，其中 1997年获第二届全国优秀科技期刊二等奖，
1999年获全国优秀自然科学学报及教育部优秀科技期刊一等奖、陕西省高校“十佳学报”及陕西省
科技期刊“十佳期刊”，2001年人选“中国期刊方阵”，2004年获第四届全国优秀农业期刊一等奖，
2006年获“百种中国杰出学术期刊”和“首届中国高校优秀科技期刊”。在促进学术交流、发展学
科理论、推动科技进步等方面做出了较大贡献。
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