全 文 ：第 4 卷
V o l
.
4 N o
.
第
2
2 期 草 地 学 报
A C T A A G R E S T IA S IN ICA
1 9 9 6 年
1 9 9 6
沙打旺叶片愈伤组织诱导和植株再生的研究
张春光 刘静玲 冯江
(东北师范大学环境科学系 , 长春 1 3 0 0 2 4)
摘要 :本文对沙打旺叶片外植体愈伤组织诱导和植株再生进行初步研究 , 建立了叶片外植
体细胞无性系 , 并获得再生植株 。 试验以 M S 为基本培养基 , 附加不同浓度的 2 , 4 一D 、N A A 、
IA A
、
BA
、
K T 和 Z T 。 单独附加 2 , 4 一D 时 , 85 % 的外植体形成愈伤组织 。 2 , 4 一 D 与 Z T 或 B A 配
合使用时 , 形成愈伤组织的百分率虽降低 , 但这种愈伤组织可继代培养和诱导分化成苗 。 在
M S 培养基上附加 B A 和 N A A 时 , 则获得再生苗 。 B A 、N A A 和 2 , 4 一D 对沙打旺叶片愈伤组织
分化成苗有调节作用 。 此外 , 还探讨了蔗糖和不同培养基对愈伤组织形成的影响 。
关键词 :沙打旺叶片 ;愈伤组织 ;植株再生
1 前言
沙打旺 (A st ra g 以u : ad su r g e n s )属豆科黄蔑属 , 耐干旱和盐碱 , 适应性强 。 国内外对于 沙
打旺组织培养过程中生长调节剂作用 的研究很少 。用沙打旺上 、下胚轴研究表明(陈秀楚 、迟
静芬 , 1 9 86 ) : Z T 能诱导沙打旺上 、下胚轴产生芽 , 在 0 . 1 ~ 2 . lm g /l 的范围内 , 随着 Z T 浓度
的升高 ,诱导芽的频率反而下降 。将已分化芽的组织块移至附加 B A 2 . Om g /l , N AA 0 . 1一。
sm g /l 或 IA A 0 . 1一 0 . sm g /l 的 Ms 培养基上分化芽则能迅速扩增 。 由此可见植物促进生长
物质对植物的脱分化和再分化的影响是十分重要的 。 本文主要研究植物促进生长物质对沙
打旺叶片外植体愈伤组织的形成和植株再生的作用 。
2 材料和方法
供试种子由吉林省白城地区草原站提供 。
先将种子用 75 % 的乙醇浸泡 1 分钟后用 0 . 1%的升汞消毒 10 分钟 , 再用无菌水冲洗 4
次 , 最后将种子接种到仅含 59 八琼脂而无其它营养成份的培养基上 , 经过 15 天的培养 , 待
第一片叶完全展开后取出并切成 0 . sc m , 的小块作为外植体 。
以 M S 培养基为基础 , 附加不同浓度的 2 , 4 一D (二氯苯氧基 乙酸 ) 、 N A A (a一蔡 乙酸 ) 、
IAA (叫噪乙酸 ) 、B A (6 一节基腺嚎吟 ) 、K T (激动素 )和 Z T (玉米素 ) , 观察其对沙打旺叶片
外植体愈伤组织诱导和分化成苗的作用 。
MS 培养基配方如下 :
第 2 期 张春光等 :沙打旺叶片愈伤组织诱导和植株再生的研究 1 4 9
化合物
C o m p o u n d s
浓度 (m g / l)
C o n ee n tr a tio n
.⋯
00
bo自OCn”月任门了,矛O口月任nj11
N H ‘N O 3
K N 0
3
Ca C I :
. ZH ZO
M g SO
、 · 7H ZO
K H
3P O
4
K I
H 3 BO 3
M n S O
‘ · 4H ZO
Z n S O
; ·
7H ZO
N a ZM
o O ;
. ZH ZO
C u SO ;
·
SH ZO
COc l
Z · 6H ZO
N a ZE D T A
Fe SO
; ·
7H ZO
1 6 5 0
1 9 0 0
8 3
2 0
3 0
6 0
2 5
0
.
0 2 5
0
.
0 2 5
3 7
。
3 0
2 7
。
8 0
S k o o g
, 1 9 6 2
此外 , 选用 M S 培养基和 B S 培养基 , 并附加植物促进生长物质 , 比较不同培养基对愈伤组织
形成的影响 。 B S 培养基配方如下 :
化合物 浓度 ( m g / l)
Co n e e n t r a t io n ( m g / l)
K N O 3
C a C I :
· ZH ZO
M g SO
‘ . 7H :O
N H ; H ZPO 4
N a H ZP O
; · H oO
K I
H 3 BO 3
M
n S认 · H ZO
Z n S O
; ·
7H ZO
N a ZM
o O ;
· ZH ZO
Cu SO
; · SH ZO
C o C I :
.
6H ZO
N a ZE D T A
Fe S O
4 ·
7H ZO
2 5 0 0
l0
匕Jn”01匀叮r009口.⋯
‹UJ任0nUQdo乙产a八jLO1Q†
”胜主, .
0
.
0 2 5
0
.
0 2 5
3 7
.
3 0
2 7
.
8 0
G a m b e r g e t e
. ,
1 9 6 8
培养基 p H 调至 5 . 8 一 6 . 0 , 蔗糖为 2 . 5 % ,琼脂为 0 . 5% , 附加水解乳蛋白 2 0 m g 八。 每
组试验接种 5一 8 瓶 , 每瓶接 4 ~ 5 块 。培养温度为 23 士 1 ℃ 旧光灯照明 , 光照强度 1 8 0 0 L u x 。
1 5 0 草 地 学 报 1 9 9 6 年
3 结果与分析
3
.
1 诱导愈伤组织
3
.
1
.
1 促进生长物质的作用
将外植体接种于附加不同生长物质的 M S 培养基上 (见表 1 ) , 结果表明 , 单独附加 2 , 4 -
D Zm g /L 时 , 85 %的外植体形成愈伤组织 , 其组织表面光滑 , 但 10 天左右便停止生长 ;单独
附加其它任何生长物质均未使叶片外植体产生愈伤组织 ; 当联合使用 2 , 4 一D 和 Z T 或 B A
时 , 可使 20 % ~ 36 . 7 %的外植体形成愈伤组织 , 呈颗粒状 , 20 天后长至 Ic m 左右 , 并可继代
培养和分化成苗 。
表 1 植物生长物质对沙打旺叶片外植体愈伤组织形成的作用
T a b le 1 T h e effe e t o f pla n t g r o w th su b st a n e e o n le a f e x pla n t e a llu s fo r r na tio n o f A str a g 以us “d su r g e”场
生长物质浓度 (m g /l ) 外植体数目 愈伤组织
Pla n t g r ow th s u bs t a n ee e o n e e n t r a t io n (m g / l) N u m b e r o f C a l u s
2
,
4
一
D N A A IA A K T BA ZT e x Pla n t
数目 % 特征
N u m be
r Pe rc e n t Cha ra e te ri st ie s
0
.
5 2 0 1 0 5 0
.
5 光滑
l
。
0 2 0 1 0 5 0
.
0 光滑
2
.
0 2 0 1 7 8 5
.
0 光滑
0
.
5 2 0 +
1
.
0 2 0 +
0
.
5 20 +
1
.
0 2 0 +
0
.
5 2 0 1 1 3 6
.
7 顺粒状
1
.
0 2 0 6
、
20
. 。 顺粒状
0
.
5 20 1 0 3 3
.
3 颗粒状
1
.
0 20 8 2 6
.
7 颗粒状
0
.
2 20
0
.
5 20
0
.
5 0
.
2 2 0
1
.
0 0
.
2 2 0
2
.
0 0
.
2 3 0
2
.
0 0
.
5 3 0
2
.
0 1
.
0 3 0
2
.
0 2
.
0 3 0
0
.
5 2
.
0 2 0
1
.
0 2
.
0 2 0
0
.
5 2
.
0 2 0
1
.
0 2
。
0 2 0
0
.
5 2
.
0 2 0
1
.
0 2
.
0 2 0
注 : “ + ”表示在外植体切 口处有少量细胞增生
T h e re a r e fe w g r o w t h o f ea l u s e ells a t th e eu ttin g o f e x p la n ts
第 2 期 张春光等 : 沙打旺叶片愈伤组织诱导和植株再生的研究 1 5 1
¹ 2 , 4一D 浓度对愈伤组织形成与褐化的影响 2 , 4一D 对愈伤组织的形成有重要作用 。
不同浓度的 2 , 4一D 对愈伤组织的形成和褐化百分率的影响在 10 天后的统计结果表 明 (见表
2 )
。
2
, 4一D 浓度低于 0 . 5甲g /l 时 , 则不能诱导 出愈伤组织 。 在 o ~ 2 . Om g /l 范围内 , 增加 2 , 4一D
的浓度 ,结果愈伤组织形成的百分率从 。升至 71 . 4 % , 变化幅度较大 。 在 2 . 0 一10 . om g /l 范
围内 , 2 , 4一D 浓度增加后愈伤组织形成的百分率变化较小 , 从 71 . 4%升至7 6 . 0 % 。 愈伤组织
褐化的百分率随着 2 , 4一D 浓度的升高 , 结果从 90 %下降至 24 % , 由此推断 , 高浓度的 2 , 4 一D
对愈伤组织褐化有较强的抑制作用 。
表 2 2 , 4 一D 浓度对愈伤组织形成的影响
T a b le 2 E fle e t s o f Z
, 4 一D e o n e e n tra t io n on e a lu s for m a t io n
2 , 4一D 浓度
(m g / l)
2
, 4一D e o n e e n t r a t io n (m g /l)
外植体数
E x Pla n t
n u m b e r
数目
N u m be r
0on’八d
04.0637.L
OJ内了月任几J八j乙
01023
一U000‘9目O自O‘,习自连‘左孟‘三几0
0
.
2
0
.
5
1
.
0
2
.
0
4
.
0
5
。
0
1 0
.
0
愈伤组织 C a lu s
% 褐化数
N u m be r o f
Pe r e e n t
bro w n e
a lu s
0 0
0 0
5 0 9
5 0 1 6
7 1
.
4 14
7 1
.
4 1 0
7 6
.
0 1 0
7 6
.
0 8
º Z T 浓度的作用
表 3 结果说明 , 随着 Z T 浓度的升高 , 愈伤组织形成的百分率呈现下降趋势 , 表明 Z T 对
愈伤组织的形成有抑制作用 , 且随着 ZT 浓度的上升 , 其抑制作用则呈增强趋势 。
外植体数
E x Pla n t n u m b e r
表 3 Z T 浓度对愈伤组织形成的形响
T a ble 3 E ffe e t s o f Z T e o n e e n tra t io n o n e a lu s fo r m a t io n
生长物质 (G r o w th s u bs t a n e e ) 愈伤组织
2
, 4一D N A A
e a lu s
% Pe r e e n t
0
.
2
0
.
2
0
.
2
0
.
2
0
.
2
ZT
0
.
1
数目 N u m be r
2 6
1 l
7
5
3
65
36
.
7
17
.
5
12
.
0
7
.
5
口曰匕ŽU⋯n甘011
00连几,口月任月堵左几
3
.
1
.
2 蔗糖对叶片愈伤组织形成的影响
蔗糖浓度的改变能影响培养基的渗透压 , 且可作为碳源为植物提供有机碳 。实验结果表
明 , 蔗糖的浓度在 20 ~ 3 0 9 /l 的范围内并不能明显地影响愈伤组织的诱导频率 (表 4 ) 。 因此 ,
在以下实验中 , 蔗糖的浓度均为 2 5 9 /l 。
1 5 2 草 地 学 报 1 9 9 6 年
表 4 蔗枪不同浓度对愈伤组织形成的影响
T a ble 4 E ffee t s o f e a n e s u g a r eo n e e n tra tio n o n e a llu s fo rm
a tlo n
蔗糖浓度(g /l )
C a n e s u g e r
e o n e e n t r a tio n (g / l)
外植体数
E x Pla n t
愈伤组织 。a l u s
数目 %
n u m be r N u m be
r
Pe rc e n t
2 0
2 5
3 0
3 0
3 0
3 0
2 4
2 6
2 5
8 0
.
0
8 6
.
7
83
。
3
3
.
1
.
3 不同培养基对愈伤组织形成的影响
目前 , 至少有 15 种基本培养基用于豆科植物的组织培养 (张谦 , 1 98 6 ) 。 本实验选用 M S
和 B 、两种基本培养基 , 并附加 (l )2 , 4 一D Zm g / l ; (2 ) 2 , 4 一D Zm g / l+ z T 0 . Zm g / l, 接种 1 0 夭
后统计形成愈伤组织的数量和百分率 , 结果表明 (表 5 ) : 在相同生长物质存在的条件下 , 虽
然 M S 和 B 。在成份上差异较大 ,二者互换对愈伤组织形成的百分率却无明显影响 。
表 5 不同培养墓对愈伤组织形成的影响
T a ble 5 E ffe ets o f d iffe r e n t m e dia o n e a lu s for m
a tio n
生长物质
Pla n t g r o w th
su bs t a n e e
对照
对照
2
,
4
一
D Zm g / l
2
,
4
一
D Zm g / l
2
,
4
一
D Zm g / l
Z T o
,
Zm g / l
培养基
M
e d ia
外植体数
E x Pla n t
n u m b e r
愈伤组织 C a l u s
数目
N u m b e r
%
Pe rc e n t
特征
C ha r a e te ri s tie s
月了njn”八O
00.63
Q†R”几J八j
0265910M S 3 0
B s 3 0
M S 3 0
B s 3 0
M S 30
B S 3 0
/
/
光滑
光滑
颗粒状
颗粒状
3
.
2 植株的再生
将愈伤组织转移至分化培养基上 , 每隔 20 ~ 30 天转移一次 。 在分化培养基中愈伤组织
的颜色可分为三种类型 : 淡黄色 、绿色和褐色 。前两种经过 1 个月左右的分化培养后死亡 。褐
色愈伤组织在分化培养基上不断扩增 , 并有绿芽出现 , 随即将带有绿芽的愈伤组织移至 M S
一 1 、M S 一 2 和 Ms 一 3 三种生长物质处理的 MS 培养基中 , 结果见表 6 , 在 M S 一 1 中 , 愈伤
组织局部分化形成丛生苗 , 但基部褐化严重 , 不易诱导生根 ; 在 MS 一 2 中 , 愈伤组织局部分
化形成丛生苗 , 同时愈伤组织进一步扩增 , 而且易诱导生根 ; 在 MS 一 3 中 , 只有愈伤组织并
无分化现象 。 由此可知 , 高浓度 BA 和 N A A 即有利于苗的形成 , 又能促进愈伤组织增生 ;低
浓度的 B A 和 N A A 虽有利于苗的形成 , 却不利于愈伤组织的增生和进一步诱导 , 难以长成
正常的植株 ; 2 , 4 一D 则抑制苗的形成 。
待苗长至 sc m 左右时 ,将苗转移至生根培养基 中诱导生根 。 以下三种生长物质 N A A
0
.
2一 1 . om g /l 、 IA A 0 . 5 一 1 . sm g /l 和 B A 1 . om g /l 单独使用时均能诱导生根 , 待根长至 0 . 5
~ 1
.
oc m 时 , 将植株移至花盆中则易于成活 。
第 2 期 张春光等 : 沙打旺叶片愈伤组织诱导和植株再生的研究 1 5 3
表 6 生长物质对愈伤组织分化成苗的影响
T a ble 6 E ffe e ts o f pla n t g r o w t h s u b st a n e e o n ea llu s fo r m in g s ho t
生长物质
培养基
M
ed ia
P la n t g r o认h su b st a n e e
N A A 2
,
4
一
D
接种愈伤
组织数
N u m ha
r s
o f e a llu s
成苗愈伤
组织数
N u m be
r o f e a l u s
fo rm in g sho t
苗特点
Sh 0 O t
e h a ra e te ristie s
M S 一 1
M S 一 2
M S 一 3
0
.
7
1
.
5
2
.
0
0
.
2
0
.
7
0
.
2
丛生
丛生
/
01
1
4 讨论
4
.
1 2
,
4 一D
,对沙打旺叶片愈伤组织的诱导有重要作用 。 结果与文献中采用木豆叶片 (K u -
m a r
,
1 9 8 3 )
、用花生多种外植体 (N a r a sim h u lu , 1 9 8 3 )和菜豆子叶(S a u n d e r s , 1 9 8 7 )的研究结果
相同 , 但要从沙打旺叶片获得能进一步生长和分化的愈伤组织 , 则须将 2 , 4 一D 与 Z T 或 B A
配合使用 。
4
.
2 在 0 . 1 一 2 . om g /l 的范围内 , 随着 z T 浓度的升高 , 沙打旺叶片愈伤组织形成的频率则
呈现下降趋势 。 单独附加 Z T 的 M S 培养基不能促使沙打旺的叶片形成芽 , 却能使上 、下胚
轴产生芽 (陈秀楚等 , 1 98 6 ) , 结果说明同一生长物质 Z T 对沙打旺不同外植体的作用各异 。
4
.
3 关于愈伤组织的褐化现象 , 一般认为褐化的愈伤组织是不能用于继代和分化培养的 。
在本研究过程中观察到并非所有褐化的愈伤组织都是死的 , 部分褐化的愈伤组织能够形成
新的褐色愈伤组织 , 并且可用于继代和分化研究 。此外还发现将轻度褐化的愈伤组织及转代
(15 天左右转一代 ) , 对愈伤组织芽点的形成有着重要意义 。 然而 , 褐化现象确实能导致一些
愈伤组织的死亡 , 如何减轻和利用褐化现象则有待进一步研究 。
5 结语
5
.
1 沙打旺叶片外植体在体外培养过程中能诱导 出愈伤组织并获得再生植株 。
5
.
2 在 M S 和 B。两种基本培养基中附加 2 , 4 一D Zm g / l、 BA 2 . o m g / l或 Z T 0 . lm g / l的条件
下 , 均能诱导沙打旺叶片产生愈伤组织 。
5
.
3 2
,
4 一D 是沙打旺愈伤组织形成过程中必不可少的因素 。 BA 和 N A A 对苗的形成有调
节作用 。 当分化培养基中加 2 , 4 一D 时愈伤组织开始生长 , 但对苗的形成则有抑制作用 。 当除
去 2 , 4 一D 后 , 愈伤组织又能恢复分化成苗的能力 。
5
.
4 在愈伤组织分化成苗的培养基上有 6 块愈伤组织分化并产生丛生苗 , 当诱导生根后 ,
在 10 株植物中有 5 株成活 。
参 考 文 献
上海农科院 , 1 9 86 , 国外作物组织培养 , 1 9 : 5 ~ 61
苏盛发 , 1 985 , 沙打旺 , 农业出版社
陈秀楚 、迟静芬 , 1 986 , 沙打旺植株再生的研究 , 植物生理学通讯 , 2 : 4 一 47
张谦 , 1 986 , 豆科植物的组织培养 , 植物生理学通讯 , 5 :“一 76
裘文达 , 1 986 , 园艺植物组织培养 , 上海科技出版社 , 2 1~ 23 0
1 5 4 草 地 学 报 1 9 9 6 年
6 K u m a r
,
A
.
S
. ,
1 98 3
,
E ffe e tio n o f Z
,
4
一
D o n th e le a f o f w 以 :刁 be a n , PI. Sc i. L e tt . 3 2 : 2 7 1~ 2 7 8
7 N a r a s im h u lu
,
S
.
B
. ,
1 9 83
,
R e la tio n o f Z
,
4
一
D a n d Pla n t le t o f pe
a n u t , PI
.
Sc i
.
L et t
.
3 1 : 1 5 7 ~ 1 6 3
8 Sa
u n d e r s
,
J
.
W
. , a n d C
.
A
.
Jon
e s , 19 8 7
,
st u d y
o n re la tio n be t w e n
a u x in a n d e a llu s o f kid n e y be
a n
e o tyled o n
,
PI
.
C e l
.
R e po rt
s , 6 : 4 6 ~ 4 9
9 W
e bb
,
D
.
T
. , a n d A
.
H
.
S m ith
,
1 9 8 4
,
S tu dy o n ea l u s in d u e tio n a n d p la n tle t re g en e r a t io n fr o m L朗tuc a
“比伽 , C a n . J. 致〕t . , 6 2 : 5 8 6 ~ 5 9 0
Stu d y o n C a l1u s In d u c tio n A n d Pla n tlet R eg e n e r a tio n
Fr o m L e a f E x PIa n ts In As tra g
a lu s ad
su
rg
e n s
Z ha n g Ch u n g u a n g L iu Ji飞li飞 Fe n g Jia n g
(De p
t
.
o f E n v iro n
. 反1. , N ort he a at N o rm a lU n iv . , C ha n 罗h u n 1 3 0 0 2 4 )
A bs t
r a e t : T h is p a p er 15 a bo
u t stu dy o n the p la n tle t re 罗 n e ra tio n fro m le a f e x pla n ts of 儿忿川g al 公 ‘J‘“ r -
g邵 . Fiv e e o m p le te p la n tle t s w e r e fin a lly o b t a in e d by th e fu rt he r tra nsfe ri 鳍 sh ot s o n t o th e ro tin g m e diu m .
T h e M S m ed i
u m w a s e h o s en a d d in g to differ e n t e o n ee n tr a tio n e s o f Z
,
4
一
D
,
N A A
,
IA A
,
B A
,
K T a n d ZT
.
A
85 % h ig h f
r e q u e n t e a l u s fo rm ed f
r o m o n e MS m ed iu m
su pp le m e n ted wi th Z
,
4
一
D (Zm g / l)
,
bu t th e e a lli e o u ld
n o t g r o w fu rt h e r
,
A lo w e r fr阅u e n t ea lu s fo rm ed from M S m e diu m w ith Z , 4 一D (g / l) + Z T (0
.
lm g / l)
.
T h ese
e a l u s eo u ld g r o w fu r th e r w h ie h e o u ld be
s u
bc
u lt u re d a n d in d uc ed to form sh
o o ts
.
W h
en th e e a llu s w e re p u t o n
to th e m ed iu m (M S + 0
.
7 m g / 1 BA + 0
.
Zm g / 1 N A A )
, a lot o fsh o t
s a p碑a red a n d e a l u s d id n o t g r o w . B A ,
N A A a n d Z
,
4
一
D ha d e o n t r o le d th e e ffec t o n th e le a f o f As t
r a g 以。 心 3“r g ens , and a lso e ffe e ts o f ea n e s u g a r
a n d d iffe r e n t m ed i
a o n e a l u s fo r r n a tio n
.
K ey w o r ds
: L e a f o f A st ra g al 公 。己‘“馆郎 ; C a l u s ; Pla n tlet re g en e r at io n