全 文 ：武汉植物学研究 2010, 28(6): 649~653
Journal of Wuhan Botanical Research


收稿日期: 2010-04-19, 修回日期: 2010-06-21。
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30821064, 30870261); 湖北省教育厅科学技术研究项目(Q20101320)。
作者简介: 徐延浩(1981−), 男, 博士, 讲师, 从事分子细胞遗传学研究(E-mail: xyh09@yangtzeu.edu.cn)。
∗通讯作者(Author for correspondence. E-mail: ljli@whu.edu.cn)。
DOI: 10.3724/SP.J.1142.2010.60649
花生 45S rDNA 和 5S rDNA 的染色体定位研究
徐延浩1, 李立家2∗
(1. 长江大学农学院, 长江中游湿地农业教育部工程中心, 湖北荆州 434025;
2. 武汉大学生命科学学院, 植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉 430072)
摘 要: 对四粒红和蜀花四号花生材料进行了核型分析, 四粒红为 2B核型, 核型公式为 2n=4x=40=38m +
2sm(4SAT); 蜀花四号为 1B核型, 核型公式为 2n=4x=40=40 m(2SAT)。利用双色荧光原位杂交技术, 对 45S
rDNA和 5S rDNA这两个材料有丝分裂中期染色体上的物理位置进行了定位分析。定位结果表明, 四粒红有
6对 45S rDNA位点, 位于 A2L、A7S、A9L、B3L、B7S、B8L(A和 B分别代表基因组 A和基因组 B, L和 S
代表长臂和短臂, 数字代表染色体序号, 下同); 2对 5S rDNA位点, 位于 A3S和 B3S; 蜀花四号有 5对 45S
rDNA位点, 位于 A2L、A9L、B3L、B7S、B9L; 2对 5S rDNA位点, 位于 A3S和 B3S。花生的 45S rDNA位
点具有可变性, 5S rDNA则相对保守。
关键词: 荧光原位杂交; rDNA; 花生; 核型
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X(2010)06-0649-05

Physical Mapping of the 45S rDNA and 5S rDNA
in the Peanut (Arachis hypogaea L.)
XU Yan-Hao1, LI Li-Jia2∗
(1. Engineering Research Center of Lowland Agriculture in the Middle Reach of The Yangtze River, Ministry of
Education, College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China; 2. Key Laboratory of the MOE for Plant
Developmental Biology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract: Karyotype analysis of two peanut cultivars, Silihong and Shuhua No. 4, was conducted.
The Silihong karyotype belonged to 2B and the karyotype formula was 2n=4x=40=38m + 2sm
(4SAT). The Shuhua No. 4 karyotype belonged to 1B and the karyotype formula was 2n=4x=
40=40m (2SAT). The 45S rDNA and 5S rDNA sequences were physically mapped by double color
fluorescent in situ hybridization (FISH) on the mitotic metaphase chromosomes of the two cultivars.
The results showed six pairs of 45S rDNA loci on A2L, A7S, A9L, B3L, B7S, and B8L (A and B stand
for genomes A and B respectively, L and S represent chromosome long and short arms, and the
numbers indicate chromosomes serial number), as well as two pairs of 5S rDNA loci on A3S and
B3S in Silihong, and five pairs of 45S rDNA loci on A2L, A9L, B3L, B7S, and B9L, as well as two
pairs of 5S rDNA loci on A3S and B3S in Shuhua No. 4. The FISH results showed that the
chromosomal locality of 5S rDNA was relatively conservative, while that of 45S rDNA was variable
in the peanut.
Key words: Fluorescence in situ hybridization (FISH); rDNA; Peanut; Karyotype
核糖体是高等真核生物合成蛋白质的场所 ,
主要由 rRNA和蛋白质构成, 编码核糖体 rRNA的
基因(rDNA)有两种, 一种是 45S rDNA, 另一种为
5S rDNA。45S rDNA编码由 18S、5.8S和 28S
rRNA串联组成的高度重复单位, 位于核仁组织区
上。5S rDNA 也是串联重复序列, 编码 5S rRNA

650 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


的重复单位。荧光原位杂交(fluorescence in situ
hybridization, FISH)是一种简单而高效的在染色
体上对 DNA序列进行物理定位的技术, 它可以将
功能基因、重复序列等目标 DNA片断直接定位在
染色体上[1]。通过荧光原位杂交技术将 rDNA在染
色体上进行物理定位, 可以为核型分析提供一个稳
定有效的细胞学可识别的标记, 而且为研究植物种
属间的进化关系、多倍体的起源提供重要信息[2−8]。
花生 (Arachis hypogaea L. 2n=4x=40)是豆
科(Leguminosae)花生属(Arachis)的一种重要经
济作物。花生由花生属(Arachis)的二倍体物种杂
交、加倍形成, 包含 AA和 BB两个基因组, 是一个
典型的异源四倍体物种。Raina 和 Mukai[7]利用
FISH技术检测到花生具 4对 45s rDNA位点和 2
对 5s rDNA位点。Seijo等[8]也通过 FISH定位发现,
花生有 5对 45s rDNA位点和 2对 5s rDNA位点。
不同的研究定位的花生染色体 rDNA位点和数目
存在差异, 并由此推测花生可能起源于 不同的二
倍体亲本。研究表明, 在大麦 [9,10]、黑麦草 [11,12]、
Astyanax scabripinnis[13]等物种中存在 rDNA 的
数目和分布的品种(或不同生态型)间多样性现象。
由此可见, 很有必要对不同的花生材料的 45S 和
5S rDNA 进行染色体定位研究, 比较它们与已发
表结果的异同, 阐明花生 45S 和 5S rDNA位点的
数目和染色体分布的特点, 为探究花生的起源和花
生 rDNA的进化提供更多的资料。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验所用花生材料为四粒红 (Arachis hy-
pogaea L. cv. Silihong)和蜀花四号 (Arachis
hypogaea L. cv. Shuhua No. 4)。
1.2 方法
1.2.1 染色体的制备
染色体制片按 Song和Gustafson[14]的方法稍
加改进。取生长旺盛的根尖, 室温用饱和α-溴萘水
溶液处理 3 h后用新鲜卡诺固定液固定。用 2%的
纤维素酶和 2%的果胶酶 28°C酶解、水洗、固定
后, 采用火焰干燥法制片, –20°C保存备用。
1.2.2 探针标记
含 有 45S 和 5S rDNA 序 列 的 质 粒 由
Arumuganatha教授惠赠。45S rDNA和 5S rDNA
序列来源于番茄。碱裂解法提取 45S和 5S rDNA
质粒。通过切口平移的方法用地高辛 -dUTP
(Digoxigenin-dUTP, Dig-dUTP)标记 45S rDNA,
用生物素-dUTP(biotin-dUTP, Bio-dUTP)标记 5S
rDNA。
1.2.3 原位杂交及检测
染色体原位杂交参照 Li等[15]的方法, 每张片子
40 μL杂交液, 含 50%的去离子甲酰胺(Sigma)和
10%的硫酸葡聚糖 (Sigma), 2×SSC, 100 ng/μL
sssDNA, 用 22 mm×22 mm的盖玻片盖片, 80°C
共变性 3 min, 于保湿皿中 37°C杂交 12~48 h。
染色体原位杂交的检测及洗脱按 Li等[15]的方法。
2×SSC在室温及 37°C各洗 10 min, 1×PBS室温
洗 1 次 , 加入抗体 , 37°C 下温育 30 min, 再用
1×PBS室温洗 3次, 每次 5 min。
1.2.4 图像检测及分析
染色体制片用 5 μL/mL DAPI(4′,6-diamidino-
2-phenylindole)复染 , 加抗淬灭剂 Vectorshield
(vector lab), 用 Olympus BX60 显微镜观察荧光
原位杂交信号 , 用 Photometrics SenSys CCD
(charge coupled device) 1400E 照相装置和
Metamorph 4.6.3(Universal Imaging Crop.)软件
俘获图像, Photoshop7.0.1软件进行图片处理。
2 结果
2.1 核型分析结果
参照李懋学和陈瑞阳 [16]的标准, 各品种选择
30个分散良好的有丝分裂中期相使用 Metamorph
软件测量染色体的相对长度和臂比。四粒红有 2
对随体, 蜀花四号有 1对随体, 随体未计入染色体
长度。核型分类按照 Stebbins[17]的核型分类标准
划分。核型分析具体结果见表 1。
2.2 45S和 5S rDNA在花生中期染色体上的定位
用 Dig-dUTP标记的 45S rDNA和 Bio-dUTP
标记 5S rDNA探针与花生中期染色体进行双色荧
光原位杂交, 绿色的信号为 45S rDNA, 红色的信
号为 5S rDNA, 蓝色为 DAPI染色的中期染色体, 荧
光原位杂交结果见图 1。根据 45S rDNA和 5S rDNA
在各花生品种中杂交信号的位置和数目, 建立了
各品种带 rDNA标记的 FISH核型模式图(图 2)。

第 6期 徐延浩等: 花生 45S rDNA和 5S rDNA的染色体定位研究 651


表 1 花生中期核型分析
Table 1 Karyotype analysis of the two peanut cultivars in this study
品种
Cultivars
核型公式
Karyotype
formula
平均臂比
Average
arm ration
最长染色体/
最短染色体
Longest / Shortest
臂比大于 2的比率
Percentage of chromosome
arm ration>2
核型不对称系数
Karyotype
asymmetry index
核型类型
Type
四粒红
Arachis hypogaea
L. cv. Silihong
2n=4x=40=38m +
2sm (4SAT) 1.25 2.35 0.05 56.22 2B
蜀花四号
A. hypogaea L. cv.
Shuhua No. 4
2n=4x=40=40m
(2SAT) 1.22 2.05 0 54.48 1B


A: 四粒红; B: 蜀花四号。绿色信号为 45S rDNA; 红色信号为 5S rDNA; 蓝色为 DAPI染色的中期染色体
A: Arachis hypogaea L. cv. Silihong; B: Arachis hypogaea L. cv. Shuhua No. 4. The signals of 45S rDNA
are green and the signals of 5S rDNA are red. Chromosomes were counterstained with DAPI (blue)
图 1 45S rDNA 和 5S rDNA 在四粒红和蜀花四号中期染色体上的定位
Fig. 1 Physical mapping of 45S rDNA and 5S rDNA on metaphase chromosomes of two peanut cultivars

A: 四粒红; B: 蜀花四号
A: Arachis hypogaea L. cv. Silihong; B: A. hypogaea L. cv. Shuhua No. 4
图 2 四粒红和蜀花四号的中期染色体 FISH 核型模式图
Fig. 2 FISH-aimed karyoidiograms on metaphase chromosomes of Silihong and Shuhua No. 4

对四粒红 100个中期分裂相杂交结果的统计
分析表明, 95%的中期分离相有 6对 45S rDNA位
点、2对 5S rDNA位点。A9L、B7S处的 45S rDNA
的杂交信号较 A2L、A7S、B3L、B8L处的杂交信
号更强(图 1：A)。A3S处 5S rDNA的杂交信号强
度强于 B3S处的杂交信号(图 1：A)。在 B3染色

652 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


体上同时存在 45S rDNA和 5S rDNA位点。A9染
色体的随体与染色体不相连, 但是通过 FISH杂交
发现, 它们之间存在相连的 45S rDNA的杂交信号。
对蜀花四号 100个中期分裂相杂交结果的统
计分析表明 , 95%的中期分裂相具有 5 对 45S
rDNA位点, 位于 A9L、B9L处的 2对信号较强, 位
于 A2L、B3L、B7S处的信号较弱(图 1：B); 5S
rDNA有 2对位点(图 1：B), 位于 A3S处的信号强
度强于 B3S 的信号。与四粒红不同, 蜀花四号在
A7染色体上无 45S rDNA位点。蜀花四号 B3染
色体上也同时存在 45S rDNA和 5S rDNA位点; A9
染色体与随体分离, FISH 检测表明它们之间也存
在 45S rDNA的杂交信号。
3 讨论
在本实验中发现, 四粒红有 6对 45S rDNA
位点, 2对 5S rDNA 位点; 蜀花四号有 5对 45S
rDNA位点, 2对 5S rDNA位点。Raina和 Mukai[7]
通过 FISH定位检测花生有 4对 45S rDNA位点和
2对 5S rDNA位点。Seijo等[8]的定位则发现花生
有 5对 45S rDNA位点, 2对 5S rDNA位点。由此
可见, 在花生不同的品种间, 45S rDNA 位点具有
可变性, 5S rDNA则相对保守。对葫芦科[2,3]多种植
物的 rDNA定位分析表明, 大部分供试物种具有 1
对 5S rDNA位点, 而 45S rDNA位点则比较多变。
Liu 等 [18]的试验也表明, 5S rDNA 在 5 种亚洲松
(Pinus tabuliformis、Pinus yunnanensis、Pinus
densata、Pinus massoniana、Pinus merkusii)染色
体上都具有 1对主要位点和 1对次要位点, 并且在
染色体上的分布模式在属内是保守的。本研究进
一步支持在植物进化过程中, 45S rDNA更容易发
生变化, 而 5S rDNA则相对比较保守。
染色体重排, 不等交换, 由转座子引起的隐蔽
rDNA拷贝数的扩增等都可能引起 45S rDNA数目
的变化[19]。Mantovani 等[13]认为 45S rDNA分布在
染色体端部的特点可能是 45S rDNA数目改变的
原因之一, 因为位于染色体端部位置的 DNA更容
易发生交换。很多研究表明, 杂交和多倍化也是导致
染色体 45S rDNA位点发生改变的原因之一[20,21]。
花生 45S rDNA位点的多样性也可能是其多倍化
过程中形成的。
Huang等[11]通过对黑麦草的细胞学研究分析
发现黑麦染色体存在脆性位点 , 随后的 45S
rDNA-FISH 结果证明脆性位点是染色体 45S
rDNA 损伤造成的。这与本实验所观察到的花生
A9 染色体与随体不相连 , 但存在较弱的 45S
rDNA 杂交信号这一现象类似。基于传统的观点,
本实验将 A9 染色体分离部分定义为随体。但从
A9 染色体随体的形态及 Huang 等的研究来看,
不排除花生 A9 染色体上存在一个明显的脆性位
点, 从而导致 A9染色体 45S rDNA位点发生高频
断裂。由脆性位点所引起的染色体断裂也可能是
45S rDNA位点发生改变的原因之一[11,22]。
异源多倍体能在不同居群中独立地重复发生
(recurrent formation), 具有多元起源 (multiple
origins)的特点[23]。目前, 对于花生在其形成过程
中是否存在多元起源的问题尚不明确。尽管本研
究所发现的花生 45S rDNA位点具有品种多样性
可能是上面所提到的一些原因造成的, 但也有可
能是花生在其形成中经历过多元起源。要回答这
个问题, 必须检测不同居群的花生二倍体亲本材
料的 rDNA位点的分布是否具有多态性。
早期植物地理学、核型分析等认为 A.
Cardenasii和A. batizocoi是当时搜集的材料中最
可能的 A和 B染色体组的供体种[24], 而 Singh和
Smartt[25]通过对不同材料的人工杂交和加倍发现
A. duranensis与 A. batizocoi杂交、加倍所产生
的后代与花生最类似。此后, 不同的研究小组依据
rDNA 在花生染色体上的分布模式, 特别是 45S
rDNA与花生近缘野生种分布模式的异同, 对花生
的起源进行了推测 , Raina 和 Mukai[7]提出 A.
villsoa和 A. ipaensis是花生最有可能的 A和 B染
色体组的供体, 而 Seijo等[8]则认为 A. duranensis
和 A. ipaensis是花生最有可能的 A和 B染色体组
的供体。但是, 这些研究没有充分考虑到花生 45S
rDNA的可变性。因此, 有必要综合多方面的资料对
花生的多倍体起源进行进一步的分析。
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(责任编辑：王豫鄂)