全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (3) : 187～ 192
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
采用 GUS 标记技术研究钙调素在转基因烟草中的分布
陶文菁, 梁述平, 吕应堂Ξ
(武汉大学发育生物学研究中心, 武汉　430072)
摘　要: 为了监测钙调素 (CaM ) 在植物细胞内的分布并探索其生物学功能, 将水稻CaM 和GU S融合基因 (camõ
g us)分别置于35S启动子和花粉特异启动子LA T 5227控制下, 构建出载体pM D öCaMõGU S和pB IöLA TõCaMõGU S,
转化烟草 (N icotiana tobacum cv. SR É ) , GU S 染色结果显示, CaMõGU S 融合蛋白广泛分布于植物根、茎、叶等组
织, 根尖生长点细胞、根毛细胞、表皮毛细胞、气孔保卫细胞、维管束细胞的细胞质中融合蛋白含量较多。花粉粒中
也分布着CaM , 并在萌发沟处表现出较高的浓度。保卫细胞和表皮毛细胞中CaM 分布在相邻细胞连接处细胞模内
侧, 呈现出极性分布。研究结果表明, 细胞内 CaM 的不均匀分布可能与细胞功能相关。
关键词: GU S; 钙调素; 转基因烟草
中图分类号: Q 942　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0320187206
Calm odul in D istr ibution in the Tran sgen ic Tobacco
Using GUS Reporter Gene
TAO W en2J ing, L IAN G Shu2P ing, LU·· Y ing2T angΞ
(K ey labora tory of the M in istry of E d uca tion f or P lan t D evelopm en ta l B iology , W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina)
Abstract: In o rder to study the localiza t ion of calmodu lin in the p lan t cell and it’s b io logica l func2
t ion, gene con structs con ta in ing the fu sion gene (camõg us) under the con tro l of the 35S CaM V
p romo ter o r the po llen specif ic p romo ter LA T 5227 from tom ato , w ere in troduced in to N icotiana
tobacum cv. SR I by leaf d isc t ran sfo rm at ion respect ively. GU S react ion show that in the tran sgen ic
line pM D öCaM õGU S, the fu sion p ro tein CaM õGU S w as w idely ob served in roo ts, stem s and
leaves. A nd it had a h igher levels th roughou t the cyto sa l of roo t m eristem region, qu iescence cen2
ter cell, roo t hair cells, ep iderm al cells, and vascu lar cells. CaM w as also detected in po lar d ist ribu2
t ion style under the m em b rane of the jo in t site betw een 2 guard cells. In pB IöLA TõCaM õGU S
tran sgen ic line, CaM on ly localized in the cytop last of po llen gra in s, and a h igher exp ression of
CaM w as detected at germ inat ion zones. O u r resu lts show that CaM exh ib its asymm etric d ist ribu2
t ion the p lan t cells,w h ich has a very t igh t rela t ion sh ip w ith cell b io logica l funct ion.
Key words: GU S; CaM ; T ran sgen ic tobacco
　　钙调素 (Calmodu lin, CaM ) 是细胞内 Ca2+ 信号
系统中的主要受体[1 ]。CaM 自身没有催化活性, 但
当它与 Ca2+ 结合后能改变一系列下游靶蛋白的活
性, 参与植物生长发育、胁迫反应等众多生理生化过
程[2 ]。动物中, CaM 在细胞学上的定位和功能进行
了较多的研究。L i 等[3 ]研究表明, CaM 定位在H eL a
细胞的细胞质中和细胞核上, 但有丝分裂时集中在
有丝分裂器上, 在中心粒周围和细胞浆移动所形成Ξ 收稿日期: 2002209230, 修回日期: 2003203203。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30070078)。作者简介: 陶文菁 (1975- ) , 女, 生物学博士研究生, 从事发育生物学研究。通讯作者 (A utho r fo r co rrespondence. E2m ail: yingtlu@w hu. edu. cn)。
的细胞质沟中分布较多。纤维原细胞的血清学实验
表明, 胞内大多数钙调素是游离存在的, 但加入血清
后则不能移动[4 ]。未经刺激的平滑肌细胞实验显示
在低浓度 Ca2+ 下, CaM 以非依赖于 Ca2+ 形式与蛋
白结合, 但随着Ca2+ 浓度升高, CaM 表现出复杂的
细胞学定位, 包括明显的由细胞质到细胞核的再分
配[5 ]。
对CaM 细胞内的分布和功能研究, 一般采用免
疫组织化学方法和RNA 原位杂交技术, 或将细胞
裂解后研究CaM 分布及活性的变化。在这些研究方
法中, CaM 可能在细胞固定过程中会从细胞内释放
出来或重新分布, 因此CaM 分布会由于这些非正常
的细胞生理环境而产生人为的假象。相比于以上方
法, GU S (Β2葡萄糖苷酶 (Β2glucu ron idase) ) 染色利
用酶和底物反应, 对蛋白质进行组织细胞内的原位
定位, 减小了原有方法在处理材料过程中存在的不
利因素, 尽可能的消除假阳性。另外, GU S 染色由于
具有检测方便、灵敏、快速等优点, 现已广泛用于植
物分子生物学和基因工程研究, 并发挥着越来越重
要的作用。
我们构建了分别带有CaM 35S 启动子 (花椰菜
花叶病毒的启动子)和花粉特异启动子LA T 5227 的
CaM ·GU S 融合基因载体, 并通过农杆菌叶盘转化
法将融合基因转入烟草 (N icotiana tobacum cv. SR
I)中, 经过逐步抗性筛选, 得到稳定转基因体系。通
过 GU S 染色反应, 观察CaM 在根、茎、叶和花粉中
的分布特点。
1　材料和方法
1. 1　载体的构建
所有用于转化的载体都在pB I10111, pM D 21 和
pBSöLA T 5227 的基础上构建而成。CaM 由吕应堂
教授从水稻基因组文库中调出。pB I10111 上带有
g us 基因但无启动子, pM D 21 带有 35S 启动子和多
克隆位点, pBSöLA T 5227 上克隆有来源于番茄的花
粉特异启动子LA T 5227。经N co I和 EcoR I消化后
的 pB I10111 小片段, 插入到同样双酶切后的 pBS
(p lasm id b luescrip t ) 载体上得到中间载体 pBSö
GU S。将 CaM 基因片段插入到 N co I 单酶切的
pBSöGU S, 得到中间载体 pBSöCaM ·GU S。Sal I
和 EcoR I 双酶切 pBSöCaM ·GU S, 并将片段CaM
·GU S 插入到经 Sal I 和 EcoR I 双酶切后的pM D 2
1 中, 构建到转化载体 pM D öCaM ·GU S。N co I 和
EcoR I 消化后的pBSöGU S 小片段插入到经同样双
酶切后的质粒 pBSöLA T 5227 中得到 pBSöLA T ·
GU S。将带有N co I粘性末端的CaM 基因片段插入
到经N co I 单酶切后的 pBSöLA T ·GU S 中, 得到
中间载体 pBSöLA T·CaM ·GU S。Sal I 和 EcoR I
双酶切 pBSöLA T ·CaM ·GU S, 并将产物连入到
同样双酶切后的 pM D 21 上, 构建出载体 pB IöLA T
·CaM ·GU S。用于作为融合基因CaM ·GU S 对
照的转化载体 pB I121, 仅带有 35S 启动子和其下游
控制的 g us 基因。冻融法将 3 种质粒转入农杆
菌 LBA 4404 ( A grobacterium tum efacien s st ra in
pB I121　　　　　　　　　— 35S p romo to r GU S coding region NO S —
pM D öCaM ·GU S　　 — 35S p romo to r CaM coding region GU S coding region NO S —
pB IöLA T·CaM ·GU S　　—LA T 5227 p romo to r CaM coding region GU S coding region NO S —
图 1　用于转化的载体结构
F ig. 1　Constructs used in transfo rm ation
LBA 4404)。用于转化的 3 种载体结构如图 1 所示。
1. 2　植物转化和组织培养
烟草 (N icotiana tobacum cv. SR É ) 种子于 70%
乙醇灭菌015 m in后, 换至4% N aC lO 中处理20 m in,
无菌水清洗后将种子铺于培养基上 (1ö2 M S培养
基, 013% 蔗糖, 016%～ 017% 琼脂粉, pH 517～
518) , (25±1)℃生长, 光周期为14 h光照, 10 h黑
暗, 4～ 5周后得到用于转化的烟草无菌苗。依照梁
述平等[6 ] 的叶盘转化法 , 于生芽培养基 (M S培养
基, 011 m göL BA P, 110 m göL NAA , 500 m göL Carben icillin , 300 m göL Kanam ycin, 3% 蔗糖,　016%～ 017% 琼脂粉, pH 517～ 518) , 生根培养基(M S 培养基, 含 200 m göL Carben icillin, 100 m göLKanam ycin, 110% 蔗糖, 016%～ 017% 琼脂粉, pH517～ 518)上筛选得到第一代转基因烟草 (T 0 代植株)。将所有小苗移栽至蛭石中进行 1～ 2 周的过渡生长后, 移栽至土壤中在自然条件下生长。分单株收获 T 0 代转基因烟草的种子, 并在含有 300 Λmo löLKan 的M s 培养基中进行筛选, 得到有 Kan 抗性的T 1 代转基因植株。通过 GU S 染色反应挑选出融合
881 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
蛋白表达量高的植株移至土壤, 植株开花成熟后收
获种子, 继续在 Kan 平板上筛选得到纯合的 T 2 代
转基因烟草。组织培养、过渡生长和种子筛选条件均
同于无菌苗生长条件。BA P、NAA、Carben icillin 及
Kanam ycin 都从 Gibco 公司购得。
1. 3　GUS 组织化学检测
GU S 组织化学分析按照 Jefferson (1987) [7 ]所
述方法进行, 所进行的实验都以T 2 代纯合转基因烟
草为实验材料。撕取烟草叶片下表皮, 浸入 GU S 染
色 反应缓冲液中 ( 510 mmo löL PBS (pH 710 ) ,
510 mmo löL K2fericyan ide, 510 mmo löL K2ferro2
cyan ide, 微量 T riton X2100, 011% X2glucu ron ide) ,
37℃孵育 24 h, 挑取下表皮平铺在滴有无 X2glu2
cu ron ide 的缓冲液的载玻片上, 压片观察。采用徒手
切片得到 015 mm 厚的茎横切片, 进行同样的 GU S
反应并镜检观察。对于花粉 GU S 观察, 则取开花当
天的花药于含有 15% 蔗糖的BK 培养基中挤出花
粉, 800～ 1 000 röm in 离心收集花粉。在BK 培养基
中清洗花粉 2 次, 将花粉悬浮于GU S 染色反应缓冲
液中, 37℃孵育 24 h, 吸取花粉悬浮液, 压片观察。
以上所有细胞学观察都在O lympu s IX70 倒置荧光
显微镜上进行, 小苗的检测在O lympu s SZX12 体式
荧光显微镜下进行。
2　结果
pM D öCaM ·GU S 转基因烟草和 pB I121 转基
因烟草在根、茎、叶组织中能检测到 GU S 靛蓝色反
应, 而 pB IöLA T ·CaM ·GU S 转基因烟草的根、
茎、叶都未检测到 GU S 靛蓝色反应。开花后 pB Iö
LA T ·CaM ·GU S 转基因烟草的花粉被检测到有
GU S 靛蓝色反应, 而其他组织并未检测到 GU S 靛
蓝色反应; 所有 pM D öCaM ·GU S 转基因烟草和
pB I121 转基因烟草的花粉都没有 GU S 靛蓝色反
应, 结果说明了LA T 5227 启动子花粉表达的特异
性。
茎表皮 GU S 染色结果显示, pM D öCaM ·
GU S 转化植株茎表皮细胞的 GU S 靛蓝色反应多发
生在茎表皮细胞边缘 (图版É: A ) , pB I121 转化植株
茎表皮细胞被染成靛蓝色 (图版É: B )。pM D öCaM ·
GU S 转化植株茎表皮毛细胞的着色明显强于
pB I121 转化植株, 并且在前者的表皮毛细胞内
GU S 染色呈现出极性分布, 即相邻 2 个表皮毛细胞
连接处的细胞膜内侧染色最深, 而pB I121 转化植株
的表皮毛细胞染色浅, 且比较均匀。转基因烟草
pB I121 维管组织和疏导组织未被染成靛蓝色 (图版É: H ) , 而 pM D öCaM ·GU S 转化植株维管组织和
疏导组织都有较深的 GU S 靛蓝色反应 (图版É: H )。
叶片下表皮 GU S 染色结果显示, pM D öCaM õ
GU S 和 pB I121 转化植株的叶片表皮细胞和气孔保
卫细胞都被染成靛蓝色 (图版É: C,D )。pM D öCaMõ
GU S 转化植株保卫细胞着色比表皮细胞深, 而
pB I121 转化植株保卫细胞着色与表皮细胞深浅一
致或更浅。pM D öCaM ·GU S 转化植株保卫细胞内
靛蓝色出现不均匀分布, 组成一个气孔的两个保卫
细胞连接处染色较深, 细胞内其它区域染色较浅 (图
版É: C) , 而 pB I121 转化植株的保卫细胞内靛蓝色
分布比较均匀。
根的GU S 染色结果显示pB I121 转化植株的根
尖、维管束都被染成明显的靛蓝色 (图版É: H 右边
植株) ; pM D öCaM ·GU S 转化植株的根冠最外层
细胞、静止中心细胞、分生区域细胞、根毛细胞都被
染成靛蓝色 (图版É: G) , 而根冠内层细胞未被染成
靛蓝色。其中静止中心细胞、分生区域细胞及根毛细
胞着色最深, 并且根毛细胞内呈现出不连续的靛蓝
色分布, 根冠最外层细胞内分布着靛蓝色颗粒状物
质。维管组织仅在纵向相邻的两个细胞连接边缘呈
现靛蓝色。
普通光学显微镜下可见 3 种转基因烟草的花粉
粒呈圆球形, 3 条萌发沟贯穿于花粉粒两极。花粉的
GU S 染色检测结果表明, pB IöLA T ·CaM ·GU S
转化植株的整个花粉粒都有被染成靛蓝色 (图版É:
E ) , 高倍镜下可观察到花粉粒中的细微颗粒, 花粉
粒中央区域着色较浅, 周围部位着色较深, 萌发沟处
靛蓝色更深一些。花粉粒染色较浅的中央区域, 而
pB I121 (图版É: F ) 和 pM D öCaM ·GU S (图片未展
示) 2 个转化株系的花粉粒 GU S 染色检测无靛蓝
色反应。
3　分析和讨论
CaM 是细胞内结合Ca2+ 的保守蛋白, 参与调节
生物的生长发育和新陈代谢, 在钙信号系统中发挥
着极为重要的作用[2 ]。CaM 的亚细胞定位直接与其
调控功能相关。CaM 一般分布于细胞质中, 有些与
细胞膜相连[8, 9 ] , 有的则定位于细胞核[10 ]。将 CaM
基因置于 35S 启动子或花粉特异启动子LA T 5227
控制下转入烟草中, 对于研究 CaM 在细胞内的定
位, 分布变化及其在信号转导途径中的调控功能具
有非常重要的意义。
981　第 3 期　　　　　　　　　　陶文菁等: 采用 GU S 标记技术研究钙调素在转基因烟草中的分布
植物CaM 在细胞内的不均匀分布与CaM 的生
物学功能是密切相关[2, 11, 12 ]。GU S 蛋白在对照转基
因烟草 pB I121 保卫细胞内均匀分布, 而在转基因烟
草 pM D öCaM ·GU S 中融合蛋白CaM ·GU S 却集
中在细胞两端, 并且 CaM ·GU S 在转基因烟草
pB IöLA T ·CaM ·GU S 花粉粒图片中也分布于细
胞质中。pB I121 和pM D öCaM ·GU S 两个转基因株
系中, 细胞内颜色分布差异说明本实验选用的CaM
可能是非亲核性或非核定位性的, 它主要在细胞质
中发挥着调控功能。
表皮毛细胞分泌粘液和水分, 保护茎叶; 同时能
敏锐感受外界环境变化并迅速作出反应。pM D ö
CaM ·GU S 转化植株表皮毛细胞内, CaM 主要分
布在相邻两个表皮毛细胞连接处的细胞膜内侧。
CaM 的这种极性分布说明, CaM 可能参与了表皮
毛细胞与环境之间、细胞与细胞之间的信号转导过
程。保卫细胞的运动调节着气孔的开闭, 以防止不必
要的水分蒸发, 同时使植物保持较高的光合效率。已
有研究表明, ABA 诱导气孔保卫细胞胞质 Ca2+ 浓
度的升高导致了气孔关闭[13 ]。pM D öCaM ·GU S 转
化植株保卫细胞内CaM 主要分布在两个保卫细胞
连接处, 这说明CaM 可能参与了保卫细胞间的信号
传递过程。当外界环境发生变化时, 通过Ca2+ öCaM
信号转导途径使保卫细胞协调性做出反应, 调节气
孔开闭。植物的茎主要负责物质纵向运输, CaM 主
要分布在维管组织, 说明CaM 可能与纵向上的物质
运输或信号转导相关。
根是植物吸收水分和营养的主要器官。CaM 在
根冠细胞和根毛细胞中大量分布, 说明CaM 可能参
与了细胞与外界、细胞与细胞之间的信号传递过程,
满足根冠细胞和根毛细胞敏锐感受外界环境变化的
需要, 使植物迅速有效地对外界刺激作出反应。根冠
最外层细胞直接与土壤或培养基接触具有较强的分
泌功能, 能分泌一种高度水合的多糖保护根尖并使
根尖易于在土壤中推进, 这层细胞着色较深, 表明
CaM 可能与分泌途径相关。CaM 在分裂中心细胞
内分布较多, 可能因为分裂中心的细胞保持着旺盛
的分裂能力, 细胞内需要大量信号分子来完成生理
生化反应。已有研究表明CaM 参与了细胞周期活
动[3 ] , 并且与CaM 相关的激酶在根冠和生长点也存
在着类似分布[14, 15 ]。
花粉的 GU S 染色表明整个花粉粒都染成靛蓝
色, 而花粉粒萌发沟处靛蓝色更深, 可能因为Ca2+
和CaM 在花粉粒水合及花粉管生长过程中会逐渐
向萌发孔集中, 从而呈现出极性分布, 这种特殊分布
说明 CaM 可能参与了花粉管萌发, CaM 介导的
Ca2+ 信号转导途径与植物有性生殖以及物质运输过
程密切相关[16, 17 ]。陈绍荣等[18, 19 ]RNA 原位杂交和
免疫组织化学的实验结果, 证明了CaM mRNA 和
CaM 在花药发育过程中主要分布于花粉萌发孔中,
并且有明显的时空变化。
我们的研究表明, CaM 主要分布在生长活跃、
代谢旺盛的组织细胞中, 细胞内CaM 的极性分布与
细胞的生理生化功能密切相关。CaM 在植物的生长
发育和对外界环境变化作出的应激反应中, 起着非
常重要的作用。
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图 版 说 明
图版É: CaM 在转基因烟草的细胞学定位。A , C. pM D öCaMõGU S 转基因烟草的表皮毛细胞、保卫细胞; E. pB IöLA TõCaM õ
GU S 转基因烟草花粉粒, 箭头所示为萌发孔 (GP) ; B ,D , F. pB I121 转基因烟草的表皮毛细胞、保卫细胞、花粉粒。箭头所示为
萌发孔 (GP) ; G. pM D öCaMõGU S 转基因烟草根尖。箭头所示分别为根冠最外层 (RCO , roo t cap )和根顶端分生区域 (RAM );
H. pM D öCaM õGU S 转基因烟草和 pB I121 转基因烟草幼苗时期 GU S 染色图片, 左边为 pB I121 转基因烟草, 右边为 pM D ö
CaMõGU S 转基因烟草。A ,B 放大倍数 105×; C 放大倍数为 420×; D , E, F, G 放大倍数为 210×; H 在O lympus SZX12 体式
荧光显微镜下拍摄, 放大倍数为 5. 2×
Explana tion of pla te
Plate É: Cellu lar distribu tion of CaM in transgen ic tobacco. A , C. Ep iderm al cell and guard cell of pM D öCaMõGU S transgen ic
tobacco; E. Po llen grain from pB IöLA TõCaMõGU S transgen ic tobacco. Germ ination po re is arrow ed out; G. Roo t t ip of pM D ö
CaMõGU S transgen ic tobacco. A rrow heads to roo t cap and roo t ap ical m eristem ; B ,D , F. Ep iderm al cell, guard cell and po llen
grain of pB I121 transgen ic tobacco. Germ ination po re is arrow ed out; H. Seedling of pM D öCaMõGU S transgen ic tobacco and
pB I121 transgen ic tobacco. L eft one is pB I121 transgen ic tobacco, righ t one is pM D öCaMõGU S transgen ic tobacco. M agnifica2
t ion: A , B 105×; C 420×; D , E, F, G 210×; H w as taken under the fluo rescence O lympus SZX 12 stereom icro scope system ,
512×
191　第 3 期　　　　　　　　　　陶文菁等: 采用 GU S 标记技术研究钙调素在转基因烟草中的分布
　　　　陶文菁等: 图版É TAO W en2J ing et a l. : P la te É 　　　　
291 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷