全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20( 4) : 245～250
Journal of Wuhan Botanical Research
层理鞭枝藻藻蓝蛋白 E和 F基因的克隆及序列分析

朱菁萍1　武　栋2　周　明2　周宜开1　赵开弘2


( 1.华中科技大学同济医学院公共卫生学院, 武汉　430022;
2.华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉　430074)
摘　要: 克隆并测定了层理鞭枝藻藻蓝蛋白 E 和 F 基因全序列, 通过将其氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行
比较, 表明层理鞭枝藻中 cp cE、cp cF 所编码的蛋白质是层理鞭枝藻中
-CPC 生物合成的连接酶。
关键词: 藻蓝蛋白; cp cE; cp cF
中图分类号: Q943. 2; Q949. 22　　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号: 1000-470X ( 2002) 04-0245-06
Cloning, Sequencing and Analysis of cpcE and cpcF in Phycocyanin
Operon of Mastigocladus laminosus
ZHU Jing-Ping
1
, WU Dong
2
, ZHOU M ing
2
, ZHOU Yi-Kai
1
, ZHAO Kai-Hong
2


( 1. S chool of P ubl ic H eal th, T ongj i Medical Col leg e, H uaz hong Univ ersity of S ci ence and Technology, Wuhan　430022, China;
2. Col leg e of L if e Sc ience and T echnology, H uazhong Univ ersit y of Sc ience and T echnology, Wuhan　430074, Chin a)
Abstract: The sequences of cp cE and cp cF from Mastigocladus laminosus had been cloned and se-
quenced. Through the homolo gy comparison of amino acid sequences o f CpcE and CpcF fr om se-
veral species of cy anobacteria, CpcE and CpcF from Mastigocladus laminosus is the specific en-
zyme fo r biosynthesis of
-CPC.
Key words : Phycocyanin; cp cE gene; cp cF gene
　　藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类
光合作用捕光色素蛋白,它们吸收光能并传递到光
合作用反应中心。藻胆蛋白一般由
和亚基构成,
每个亚基含 1～2个辅基色素,从而使藻胆蛋白具有
特殊的光谱吸收性质。根据这些光谱性质, 可将藻胆
蛋白分为藻红蛋白( phycoerythrin, PE)、藻红蓝蛋
白 ( phycoer ythrocyanin, PEC)、藻蓝蛋白 ( phyco-
cyanin, PC)和别藻蓝蛋白( allophycocyanin, APC)。
藻胆色素作为藻胆蛋白的辅基色素也可分为 4类:
藻尿胆素( phycour obilin, PU B)、藻红胆素( phyco-
er ybilin, PEB)、藻紫胆素( phycoviolobilin, PVB)和
藻蓝胆素( phycocyanobilin, PCB)。
藻胆蛋白是藻类光合作用捕光复合物的功能组
分, 所以研究藻胆蛋白生物合成对认识光合作用的
形成和机理非常重要。国内外关于藻胆蛋白的研究
已取得了一些进展: Zuber 实验室[ 1]对层理鞭枝藻
APC、PC、PEC 的
、亚基分析比较表明,亚基间序
列同源性在 21%～67%之间。Fairchild 等[ 2]发现
Synechococcus sp. PCC 7002 的 CPC 操纵子编码的
蛋白质 CpcE 和 CpcF 在 CPC
-亚基(简称
-CPC)
脱辅基蛋白与 PCB 的连接过程中起酶催化作用, 它
们是 Synechococcus sp. PCC 7002中
-CPC 生物合
成的连接酶。最近 Zhao 等 [ 3]发现层理鞭枝藻中
PEC 操纵子所编码的蛋白质 PecE、PecF 催化 PEC

-亚基(简称
-PEC)脱辅基蛋白与 PCB 的连接过
程,在该酶催化下PCB 异构化为 PVB,并且 PVB 与




通讯作者。
收稿日期: 2001-12-24,修回日期: 2002-07-18。
基金项目:国家自然科学基金( No. 39770175)和湖北省科技攻关项目( No. 207000331)资助。
　作者简介:朱菁萍( 1973- ) ,女,博士研究生,研究方向为生物化学和分子生物学。

-PEC 脱辅基蛋白偶联, 形成具有天然活性的
-
PEC。因此, PecE、PecF 是
-PEC 生物合成的连接
异构酶。但是 PecE、PecF 酶作用详细机理还有待进
一步的研究。为了通过比较层理鞭枝藻中 PecE、
PecF 与 CpcE、CpcF 酶结构和功能来研究 PecE、
PecF 酶作用机理, 应该进一步研究层理鞭枝藻中
CpcE、CpcF 酶结构和功能。目前,层理鞭枝藻 cp cE、
cp cF 基因的完整序列还未见报道, 所以在本工作
中,我们克隆了层理鞭枝藻中 cp cE、cp cF 基因, 并测
定了该 cp cE、cp cF 基因序列,通过与已报道的其它
蓝藻中 cp cE、cp cF 的同源性比较, 表明层理鞭枝藻
中的 cp cE、cp cF 所编码蛋白质是层理鞭枝藻中
-
CPC 生物合成的连接酶。
1　材料与方法
1. 1　材料与试剂
层理鞭枝藻(M . laminosus PCC 7603)藻 DNA
由德国慕尼黑大学 Hugo Scheer 教授惠赠,大肠杆
菌菌株 TG1由本室保存, 克隆载体 pBluescript SK
( + )为 Stratagene公司产品, DNA 回收试剂盒购自
CLONT ECH 公司, 限制性内切酶 SmaI、XhoI 和
Taq 酶、T 4 DNA 连接酶、IPTG、X-gal 为 SABC 产
品。引物P 1、P 2由中国科学院上海生物化学研究所
合成,其核苷酸序列如下。
P1: 5’T GT CCCGGGAT CGT CAAAATAGAGCC 3’
P2: 5’ACCCT CGAGTGTGCTGT T T TGCCGT TGG 3’
1. 2　cpcEF基因片段的 PCR扩增
以藻 DNA 为模板, P1、P 2为引物,按如下条件
扩增: 预变性 94℃, 300 s;然后按 94℃, 60 s; 50℃,
90 s; 72℃, 110 s循环 30次; 最后 72℃延伸 300 s。
1. 3　cpcEF基因片段的克隆与序列测定
分子克隆按文献[ 4]操作。所得的基因片段由中
国科学院上海植物生理研究所用荧光测序试剂盒进
行核苷酸序列分析。
2　结果与讨论
2. 1　cpcEF基因片段的 PCR扩增
由其他蓝藻的 CPC操纵子结构,推知层理鞭枝
藻 CPC 操纵子的结构如下:
cpcB cpcA cpcC cpcD cpcE cpcF cpcG
1,
2, 3 orf
1, 2
cp cD基因的 5端部分序列和 cp cF 基因的 3端部
分序列已有文献[ 5] 报道, 而这之间 cp cE 全序列和
cp cF 部分序列还未知。因此,我们按已知的 cp cD 5
端序列设计上游引物 P1 , 而以已知的 cp cF 的 3 端
序列设计下游引物 P2 ,同时在引物的 5端分别引入
SmaI 和 XhoI 的识别位点和 3个保护碱基。PCR 扩
增产物为 1 400 bp 左右(图 1) , 电泳后用试剂盒回
收该片段。
2. 2　cpcEF 基因片段的克隆与重组质粒的鉴定
从凝胶上回收的 PCR产物, 经 SmaI、XhoI 双
酶切, 然后与同样酶切的 pBluescript 载体连接, 构
成重组质粒pBlu-cp cEF。转化 TG1感受态细胞, 用
含有 IPTG 和 X-gal 的氨苄青霉素平板筛选重组
体,挑取白色菌落。根据质粒大小初步鉴定阳性重组
子,并用 PCR方法及限制性内切酶酶切图谱分析作
进一步鉴定(图 1)。
1. DNA 分子量标准, 从下至上依次为 1 543 bp, 994 bp,
697 bp, 515 bp; 2. PCR产物; 3. PCR 阴性对照; 4. 质粒
pBlu-cp cEF 经 SmaI、XhoI 双酶切的产物; 5.质粒 pBlu-
cp cEF。
1. DNA marker . F rom t he bott om to the top ar e: 1 543
bp, 994 bp, 697 bp, 515 bp; 2. PCR product; 3. Negativ e
contro l o f PCR; 4. The fr agments obtained from the
plasmid pBlu-cp cEF dig ested by SmaI and Xho I; 5. The
plasmid pBlu-cp cEF.
图 1　PCR 扩增及质粒 pBlu-cp cEF 的酶切电泳图谱
F ig . 1　Agarose gel elect ropho resis o f PCR product
and ident ification of t he plasmid pBlu-cp cEF
by restr iction analy sis
2. 3　核苷酸序列及氨基酸序列
测定上面已证明正确克隆的 pBlu-cp cEF 中
cp cEF 片段核苷酸序列,见图 2。通过该测定的序列
可知, cp cE 基因从 cp cD 下游第 10 个碱基开始, 全
长 714 bp,由核苷酸序列推译的氨基酸序列见图 3。
cp cF 基因从 cp cE 下游第 151 个碱基开始, 全长
633 bp,推译的氨基酸序列见图 4。
246 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　
1～39 为 cp cD 3’端序列; 40～48 为调控序列; 49～762为 cp cE 序列; 763～1 022 为调控序列; 1 023～1 655为 cp cF 序列。
1～39 is 3 por tion o f g ene cp cD; 40～48 is r egulator y sequence; 49～762 is sequence of g ene cp cE; 763～1 022 is r egulato-
r y sequence; 1 022～1 655 is sequence o f gene cp cF .
图 2　cp cEF 核苷酸序列
Fig. 2　Nucleo tide sequence o f cp cEF
2. 4　序列分析
cp cE、cp cF 序列分别与文献[ 6 8, 10] 报道的其他
藻种的 cp cE、cp cF 在氨基酸水平上有很高的同源性
(表 1) , 其中 CpcE 的同源性略高于 CpcF。由于序列
之间较高的同源性以及一致的保守区域, 说明它们
在结构上高度相似,在功能上也具有高度相似性。这
也证实由层理鞭枝藻藻 DNA 模板经 PCR 扩增得
到的片段就是我们需要的 cp cE 和 cp cF 基因。
表 1　几种蓝藻的CpcE和CpcF氨基酸序列的同源性比较a
Table 1　Homology com par ison o f amino acid sequences
o f CpcE and CpcF fr om several cyanobacter ia
pro teins 1b 2c 3d 4e 5b
CpcE 100% 69% 56% 56% 42% ( PecE)
CpcF 100% 64% 43% 42% 35% ( PecF )
注( Notes) : a. 同源性比较采用 BLASTP 2. 2. 2; b.M .
laminosus PCC 7603; c. Nostoc sp. PCC 7120; d. Syne-
chococcus sp. PCC 7002; e. Synechocy stis sp. PCC 6803.
247　第 4 期　　　　　　　　　　朱菁萍等: 层理鞭枝藻藻蓝蛋白 E 和 F 基因的克隆及序列分析
1. cp cE 基因推译的 M . laminosus PCC 7603 CpcE 氨基酸序列; 2Nostoc sp. PCC 7120 的 CpcE 氨基本序列[ 6] ; 3. Syne-
chocy stis sp. PCC 6803 的 CpcE 氨基酸序列[7] ; 4. Synechococcus sp. PCC 7002 的 Cpc氨基酸序列[ 8] ; 5.M . laminosus PCC
7603的 PecE 氨基酸序列[ 9] ; ——空位补偿。
1. CpcE from M . laminosus PCC 7603; 2. CpcE fr om Nostoc sp. PCC 7120[ 6] ; 3. CpcE fr om Synechocy stis sp. PCC 6803[ 7] ;
4. CpcE fr om Synechococcus sp. PCC 7002[ 8] ; and 5. EecE fr om M . laminosus PCC 7603 [9] ; ——The gaps.
图 3　cpcE基因推择的氨基酸序列的比较
F ig . 3　Comparison of the deduced am ino acid sequences o f cp cE
　　从图 3可看到, 与其他藻种相比,由 cp cE 核苷
酸序列推译的层理鞭枝藻 CpcE 氨基酸序列略短,
表现在 C 端少三十几个氨基酸,而其它藻种在该区
域的同源性也较差,推测可能为 CpcE 的非保守区,
对酶的活性及结构无特别作用。故在进化过程中层
理鞭枝藻丢弃了这一功能上不必需的部分,从而使
结构更为紧凑。图 4中层理鞭枝藻 CpcF 氨基酸序
列的长度和其他藻种的相似, N 端和 C 端的同源性
略差。
由表 1 可知, 层理鞭枝藻藻蓝蛋白的 cp cE、
248 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　
cp cF 基因与藻红蓝蛋白 p ecE、p ecF 基因在氨基酸
序列上的同源性分别为 42%和 35% ,这对于该 2种
藻胆蛋白连接酶结构与功能的比较研究是很有价值
的。
1. cp cF 基因推译的 M . laminosus PCC 7603 CpcF 氨基酸序列; 2. N ostoc sp. PCC 7120 的 CpcF 氨基酸序列[10] ; 3. Syne-
chococcus sp. PCC 7002 的 CpcF 氨基酸序列[ 8] ; 4. Synechocy s tis sp. PCC 6803 的 CpcF 氨基酸序列[7] ; 5. M . laminosus PCC
7603的 PecF 氨基酸序列[9] ; ——空位补偿。
1. CpcF from M . laminosus PCC 7603; 2. CpcF fo rm N ostoc sp. PCC 7120[ 10] ; 3. CpcF fr om Synechococcus sp. PCC 7002[ 8] ;
4. CpcF from Synechocy stis sp. PCC 6803[ 7] ; and 5. PecF fr om M . laminosus PCC 7603[9] ; ——The gaps.
图 4　cp cF 基因推译的氨基酸序列的比较
F ig . 4　Comparison of the deduced am ino acid sequences o f cp cE
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