全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(5)：
Journal of Wuhan Botanical
484～489
四种前体对胀果甘草细胞悬浮培养生产
杨英
甘草黄酮的调控效果评价
， 何峰，季家兴，雷晶，陈雪红，余龙江
(华中科技大学生命科学与技术学院 资源生物学与生物技术研究所，武汉 430074)
摘 要：在胀果甘草细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠来研究前体对甘草细胞生产甘草黄酮
的影响。结果显示，4种前体在合适的浓度下对细胞的生长没有明显的抑制作用，而且均能促进细胞内甘草黄酮的
生物合成，但高浓度的肉桂酸对细胞的生长有一定的抑制作用。苯丙氨酸的最佳添加浓度为 20 mg／L，酪氨酸、肉
桂酸、乙酸钠的最佳添加浓度都是5 mg／L。此时，均可使培养体系的甘草黄酮产量高达100 mg／L以上，其中酪氨
酸的添加使得产量高达对照的1．43倍。苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠3种前体的添加时间均以第 10天为宜，酪氨酸
添加时间以第 5天为最佳。而且 ，在添加苯丙氨酸和乙酸钠后的第 3天收获细胞 ，此时细胞的生物量和甘草黄酮
产量最大。此外 ，苯丙氨酸、乙酸钠的添加可以增加黄酮合成的关键酶之一 ——苯丙氨酸裂解酶的活性。酪氨酸
对苯丙氨酸裂解酶影响不大，而肉桂酸的添加却导致其活性显著降低。
关键词：胀果甘草；甘草黄酮；前体；细胞悬浮培养；黄酮生物合成
中图分类号：Q945．12 文献标识码：A 文章编号：1000．470x(2007)o5．0484．06
The Efect of Precursor Feeding on Flavonoids Biosynthesis in Cell
Suspension Cultures of Glycyrrhiza inflata Bat．
YANG Ying，HE Feng，JI Jia-Xing，LEI Jing，CHEN Xue—Hong，YU Long—Jiang
(Insthute ofResource Biology and Biotechnology，Colege of Science and Technology，Huazhong
University ofScience and Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：The effects of four precursors on flavonoids biosynthesis in cell suspension cultures of
Glycyrrhiza ata Bat．were studied．111e results showed that all of these precursors with the appropriate
concentrations not only affected the cel growth，but also promoted the flavonoids biosynthesis．Moreover，
the flavonoids productions were all beyond 100 mr=／L when the best addition concentrations of
phenylalanine，tyrosine，cinnamic acid and NaOAc were 20，5，5 and 5 mg／L，respectively．The optimum
time for tyrosine addition was the 5th day during the cell culture．while it was the 10th day for the other
three kinds of precursors．Among the four precursors．tyrosine was the most effective in which the
maximum flavonoids production reached l1 3．0 mg／L．1．43 times as山at of the contro1．Additionally，the
addition of phenylalanine and NaOAc enhanced the activity of phenylalanine ammonialyase，one of the key
enzymes of the flavonoids biosynthesis，while the addition of cinnamic acid deduced it．
Key words：Glycyrhiza inflata Bat．；Licorice flavonoid；Precursor；Cel suspension culture；Flavonoids
甘草(1icorice)是我国重要的传统药材，号称
“国老”、“中药之王”，有“十方九草”之说。其主要
成分之一 ——甘草黄酮，具有美白、抗氧化、抗炎、抗
病毒、抗肿瘤等多种药理作用 J。这些药用价值决
定了甘草是其它产品不可替代的资源。近年来，甘
草市场需求急剧增加，但是长期的乱挖滥采导致甘
草资源极度匮乏。甘草细胞和甘草植株一样，具有
植株的全部遗传信息，能够合成植株所具有的有效
成分。因此采用细胞大规模培养来生产甘草的有效
成分迫在眉睫。目前，关于甘草细胞培养生产黄酮
方面的报道很少，只有少数学者研究了甘草愈伤组
织培养及其有效成分含量分析，如梁玉玲等 进行
了胀果甘草(Glycyrhiza inflata Bat．)愈伤组织培养
生产甘草酸的研究；陈巍 J、杨世海等 研究了乌拉
收稿13期：2007-02-12，修回13期 ：2007-08·06。
作者简介 ：杨英(1977～)，女，博士，讲师，研究方向为植物生物技术。
通讯作者(E-mail：yulj@mail．hust．edu．cn)。
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第5期 杨 英等：四种前体对胀果甘草细胞悬浮培养生产甘草黄酮的调控效果评价
尔甘草(Glycyrhiza uralensis Fisch)愈伤组织的培养
条件；杜曼等 建立了乌拉尔甘草毛状根培养体
系。但有关甘草细胞培养生产总黄酮的调控方面的
研究几乎是空白。为此，我们进行了胀果甘草细胞
培养生产甘草黄酮的调控研究，从甘草黄酮的合成
途径出发，探讨如何提高甘草细胞中甘草黄酮产量。
提高次生代谢物产量的有效途径之一是在细胞
培养体系中加入目的化合物合成的前体，这在许多
培养细胞中都取得了很好的效果L6 J。如余龙江
等 在红豆杉(Taxus chinensis)细胞悬浮培养中，
添加前体苯丙氨酸能够显著增加紫杉醇的含量。李
雄彪等 报道在黄酮的生物合成过程中，苯丙氨酸
经苯丙氨酸裂解酶(PAL)催化生成肉桂酸，肉桂酸
又经多步催化 ，其产物与乙酸的衍生物结合生成查
耳酮，在此基础上又合成其它黄酮。因此，本文评价
了黄酮生物合成的4个前体苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂
酸和乙酸钠对胀果甘草悬浮培养细胞合成甘草黄酮
的调控效果，为甘草细胞大规模培养工业化生产黄
酮类化合物提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
采用由本实验室保存的高产甘草黄酮的胀果甘
草(Glycyrhiza inflata Bat．)细胞系。
1．2 方法
1．2．1 甘草细胞的培养
高产甘草黄酮细胞系悬浮培养的培养基为 MS
+NAA(0．5 mg／L)+6-BA(0．5 mg／L)+2，4一D
(0．5 mg／L)，蔗糖浓度 3％，高压灭菌前 pH调至
5．8。在 1 500 lx光照条件下振荡培养，光暗周期为
12：12。摇床转速为120 r／rain，培养温度为(25±
1)cC，细胞每 20 d继代一次，接种量为 5％，实验采
用250 mL三角瓶，每瓶装80 mL培养基。所有实验
至少3个重复。
1．2．2 前体的添加
不同浓度的苯丙氨酸(phenylalanine)、酪氨酸
(tyrosine)、肉 桂 酸 (cinnamic acid)和 乙 酸 钠
(NaOAc)经过滤灭菌后，在细胞培养的不同阶段，添
加到悬浮培养体系中。
1．2．3 甘草细胞生物量的测定
细胞培养一个周期(共20 d)后，将培养物经沙
芯漏斗过滤，然后用蒸馏水将残留的培养液冲洗干
净，再次抽滤，然后将所得细胞置于 50~C烘箱干燥
至恒重，冷却后得到细胞干重(DW)，作为细胞生长
的依据。
1．2．4 甘草细胞中甘草黄酮的提取及含量测定
准确称取一定量干燥至恒重的甘草细胞粉末，
过 100目筛，加入 3O倍量 80％乙醇溶液超声提取
1 h，提取液减压浓缩，用等量乙酸乙酯萃取 3次，合
并萃取液，然后用 95％乙醇提取，离心后上清液为
甘草黄酮分析液。甘草黄酮含量的测定采用比色
法 ¨，即用甲醇稀释分析液，再加 10％KOH溶液
0．5 mL，充分摇匀显色 5 min后，用甲醇定容至
10 mL，摇匀，用 Unico紫外可见分光光度计[Unico
wfz UV-2100，尤尼柯(上海)仪器有限公司]测定其
在410 nm处的吸收值，以芦丁为标准品。
1．2．5 苯丙氨酸裂解酶(PAL)的测定
取0．5 g鲜细胞，加 7 mL含 5 mmol／L的巯基
乙醇硼酸缓冲液、0．5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、少
量石英砂在研钵中研磨。10 000 r／min离心 15 min
后，上清液为酶粗提液。上述操作在 0—4~C下进
行。1 mL酶液加 1 mL 0．02 mol／L苯丙氨酸，2 mL
蒸馏水，总体积为4 mL，对照为不加底物，多加 1 mL
蒸馏水。反应液置30~C水浴中保温 30 min，用紫外
分光光度计在290 nm处测定吸光度。以每分钟吸
光度变化0．01所需酶量为一个单位(相当每毫升
反应混合物形成 1 Ixg肉桂酸)。
2 结果与分析
2．1 前体添加浓度对细胞生长和甘草黄酮合成的
影响
次生产物是通过一系列代谢过程产生的，其代
谢过程中的中间产物加入培养基后，往往能促进终
产物的生成，但许多外源前体的加入又会抑制植物
细胞的生长，从而最终影响终产物的产量。因此，前
体的最佳添加浓度非常重要。在本实验中，把黄酮
合成的前体苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠在细
胞培养的对数期(第 1O天)分别加入到胀果甘草的
悬浮培养体系中，继续培养，在细胞培养的稳定期
(第 2O天)，将其收获。以不添加前体为对照。结
果显示，它们对细胞生长和甘草黄酮合成的影响有
所不同，这4种前体的最佳添加浓度也不尽相同。
在培养基中添加苯丙氨 酸 (5—120 mg,／L)
(图1：A)、酪氨酸(2—80 mg,／L)(图 1：B)和乙酸钠
(5 80 mg／L)(图 1：D)时，与对照(即没有添加前
体)相比，细胞的生物量都没有明显变化，细胞的生
物量一直维持在(11．6±1．7)一(15．3±2．1)g／L
之间。这说明三种前体的添加对细胞的生长没有抑
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武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
Control 20 40 60 80 10o 1 20
Precursor concentration(mg·L )
Control 20 40 60 80 100
Precursor concentration(mg·L‘)
A．苯丙氨酸；B．酪氨酸；C．肉桂酸；D．乙酸钠
A．Phenylalanine；B．Tyrosine；C．Cinnarnic；D．NaOAc
图 1 不同浓度的前体对甘草细胞生长和甘草黄酮产量的影响
Fig．1 Efects of diferent concentrations of precursors feeding on cel biomass
and flavonoids production in cel suspension cultures of Gtycyrrhlza inflata Bat．
制作用。当肉桂酸浓度低于50 mg／L时(图1：C)，
与对照(11．6 g／L)相 比，甘草生物量没有显著性变
化，但当其浓度高于50 mg／L时，随着其浓度继续增
加，细胞的生物量明显降低，这说明肉桂酸浓度高于
50 mg／L时对细胞的生长存在抑制作用。
几种前体的添加对细胞合成甘草黄酮的产量的
影响也不同。在没有添加前体时(即对照)，细胞中
的甘草黄酮含量维持在(80．6±3．2)～(9O．4±
3．5)mg／L。当添加苯丙氨酸时，在一定的浓度范
围内，随着其浓度的增加，甘草黄酮的产量也在增
加，当其浓度为20 mg／L时，此时产量达到最高，为
101．8 mg／L，是对照的 1．25倍。当苯丙氨酸的浓度
继续增加，甘草黄酮的产量开始下降。当苯丙氨酸
的浓度为 50 mg／L，甘草黄酮的产量与对照相比，
差异不显著，如果进一步增加苯丙氨酸的浓度 ，发
现其产量下降不明显，仍能够保持在(7 8．8±
0．4)mg／L。所 以，苯丙 氨酸的最适添加浓 度为
20 mg／L。
当单独添加酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠时，在一定
的浓度范围内，随着其浓度的增加，甘草黄酮的产量
也在增加，当单独添加的浓度都为 5 mg／L时，产量
均达到最高，分别为对照的1．38、1．22和1．10倍。
当酪氨酸的浓度高于 20 mg／L时，甘草总黄酮的产
量开始下降，当酪氨酸的浓度为3O～8O mg／L时，总
黄酮的产量仍比对照略高。对于肉桂酸，当其添加
浓度高于50 mg／L时，甘草黄酮的产量明显下降，低
于对照值。当肉桂酸的浓度为 120 mg／L时，产量
为(32．3±2．9)mg／L，仅为对照的42．4％。当乙酸
钠的浓度高于 5 mg／L时，甘草黄酮的产量明显下
降，高于20 mg／L时，产量均低于对照，当乙酸钠的
浓度进一步增加到 5O～8O mg／L时，甘草黄酮的产
量没有显著性变化，维持在(77．1±2．6)mg／L。所
以，当单独添加酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠时，其最适
添加浓度均为 5 mg／L。
2．2 前体添加时间的影响
外源前体在细胞培养的不同时间添加，其对细
胞生长和对次生代谢产物合成的作用也有所不同。
在胀果甘草细胞培养的不同时期(第 5、lO、l5、2O
天)添加最适浓度 的上述 4种前体 (苯丙 氨酸
20 mg／L，酪氨酸 5 mg／L，肉桂酸 5 mg／L，乙酸钠
5 mg／L)，继续培养，在细胞培养 的稳定期(第 2O
天)，将其收获。以不添加前体为对照。不 同时间
添加不同前体对细胞生长和甘草黄酮合成的影响见
图 2。
在第 5天添加苯丙氨酸 (图 2：A)或 肉桂酸
(图2：C)时，或在第 lO天添加酪氨酸(图2：B)时，
甘草细胞的生长在一定程度上被抑制了，其收获的
生物量分别为对照的59．6％、48．1％和 77．9％，而
在不同的时间添加乙酸钠(图2：D)对细胞的生长
影响不大。但当苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠在第 lO
天加人时，甘草细胞的甘草黄酮含量最高，分别为对
照的 1．39、1．24和 1．23倍，而酪氨酸在第 5天添加
时，甘草细胞的甘草黄酮最高，为对照的1．43倍。
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第 5期 杨 英等：四种前体对胀果甘草细胞悬浮培养生产甘草黄酮的调控效果评价 487
20
l6
12
— 8
≥
4
0
20
g 16
菡
口 DW 目 F1
120 20
Conto1 5 1 0 I5 20
The addition time(d)
A．苯丙氨酸；B．酪氨酸；C．肉桂酸；D．乙酸钠
A．Phenylalanine；B．Tyrosine；C．Cinnamie；D．NaOAc
图 2 在不同时期添加前体对甘草细胞的生长和甘草黄酮合成的影响
Fig．2 Efects of precursors feeding on cel biomass and flavonoids production in cel suspension
cultures of Glycyrrhlza inflata Bat．at diferent phase
2．3 添加前体后不同的收获细胞的时间对甘草细
胞生长和甘草黄酮的影响
前体的添加有助于甘草黄酮产量的提高，为了
找到一个最佳的收获细胞的时间，本研究在第 lO天
添加前体苯丙氨酸、乙酸钠。并于添加后的第3、6、9
天分别收获细胞，以添加前体后，当天(即第0天)
收获细胞为对照，比较了细胞的生物量和甘草黄酮
产量 (图3)。添加苯丙氨 酸(图3：A)、乙酸钠
(图3：B)后，在第3天收获细胞时，合成的甘草黄酮
产量最大。分别为对照的 1．16和 1．53倍。随着收
获时间的延长。总产量逐渐降低，到第 9天收获细胞
时。其甘草黄酮产量均显著低于对照，但是细胞的生
物量却没有显著差异。因此可以选择在前体添加后
第3天收获细胞，这样可以大大降低生产成本，缩减
生长周期。
2．4 不同的前体对苯丙氨酸裂解酶活性的影响
苯丙氨酸裂解酶为黄酮合成途径中的一个非常
重要的诱导酶，催化苯丙氨酸生成肉桂酸，最终催化
合成次生代谢物黄酮类。尽管 PAL活性并不与甘
草黄酮的合成直接相关，但它是黄酮合成途径的第
一 个酶，其活性的提高可为其后的合成步骤提供更
多的前体。在细胞培养的第 l0天添加各种前体，继
续培养，在细胞培养的稳定期(第 20天)，将其收
获。各实验组细胞中的苯丙氨酸裂解酶的活性见
l5
12
9
6
一
言3
一
0
15
￡
o
12
9
6
3
0
A -
上
L ⋯
上 上羹 上糜：
0 3 6 9
The harvest time(d)
A．苯丙氨酸 ；B．乙酸钠
A．Phenylalanine；B．NaOAe
图3 添加前体后不同的收获细胞时间对
甘草细胞生长和甘草黄酮的影响
Fig．3 Efects ofthe cel harvested time on the cell biomass
and flavonoids production after the precursors was added
in cell suspension cultures of Glycyrrhiza inflata Bat．
图4。以不添加前体的细胞为对照。对照组的 PAL
酶活为 l3．8 U·g FW·min。。。与对照相比，苯丙氨
酸、乙酸钠的添加可以增加苯丙氨酸裂解酶的活性，
酪氨酸对苯丙氨酸裂解酶影响不大，与对照不存在
显著性的差异，而肉桂酸的添加却导致PAL的活性
显著降低，仅为对照的89．7％。
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如 ∞ 如 0 如 ∞ ∞ 加 0
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488 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
18
{
主12
6
室3
3 讨论
在本研究中，添加合适浓度的苯丙氨酸、酪氨
酸、肉桂酸和乙酸钠均能促进甘草黄酮的产量，这与
很 多 研 究 结 果 一 致。吕东 平 等 ¨发 现 添 加
0．05 mmol／L苯丙氨酸或 0．1 mmol／L乙酸钠均能促
进雪莲黄酮的合成；项雷文 】 发现低浓度的苯丙氨
酸对粉葛总黄酮积累有较大的促进作用；袁宗泉
等_】 发现0．15 g／L的苯丙氨酸能大大提高银杏细
胞中银杏黄酮的含量。曹孟德 纠¨发现苯丙氨酸能
促进香荚兰细胞的生长。在葡萄细胞培养中添加苯
丙氨酸，可促进花青素的积累 。许建峰 也发
现添加 0．1 mmol／L酪氨酸能够明显提高高山红景
天细胞悬浮培养中红景天甙的含量；刘佳佳 副¨报道
在银杏细胞培养的第 10天添加 0．05 mmol／L酪氨
酸能够使黄酮苷的积累比对照高24％。此外，有研
究表明 1 mmol／L乙酸钠能够促进红豆杉细胞中紫
杉烷的合成 ¨。
苯丙氨酸，作为一种氨基酸，在植物体内可以通
过参与蛋白质的合成和作为碳源和氮源来影响细胞
的生长。在植物细胞的次生代谢中，苯丙氨酸又是
一 个代谢中间体，它是合成黄酮类化合物、-生物碱、
木质素等次生代谢物质的前体 。¨酪氨酸，一方
面是细胞内某些蛋白质合成的原料，参与细胞的初
级代谢过程，另一方面也可以经过酪氨酸代谢途径
转化为对香豆酸，最终参与黄酮的合成。
前人研究认为所有黄酮类化合物是由莽草酸途
径和多酮化途径生物合成的产物，同位素标记实验
证明黄酮类化合物的碳架都来自乙酸、苯丙氨酸和
酪氨酸 ]。在甘草细胞黄酮的生物合成过程中，
苯丙氨酸经苯丙氨酸裂解酶催化生成肉桂酸，肉桂
酸又经多步催化，形成的产物香豆酰辅酶 A与乙酸
的衍生物丙二酰辅酶 A结合生成一个关键的中间
产物——查耳酮，然后在酶的催化下，查耳酮能进一
步形成各种类黄酮，它们再经过羟基化、甲基化或糖
基化、乙酰化，就形成了许多结构和性质互不相同的
类黄酮化合物 ]。同样，酪氨酸也可以通过莽草酸
途径形成香豆酰辅酶 A。因此，作为黄酮合成途径
中的4种前体，合适浓度的苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂
酸和乙酸钠的添加能够促进总黄酮的合成，均能显
著提高甘草黄酮的产量。
苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠 3种前体的添加时
间均以第 10天为宜，酪氨酸添加时间以第 5天为最
佳。这说明不同前体的最佳添加时间不同。当外源
前体在最佳添加时间加入时，培养体系的次生代谢
物的产量要高于在其它时间加入时的产量。如陈永
勤等 在云南红豆杉细胞培养第 l2天时向培养基
中添加苯丙氨酸、丙酮酸钠和牛儿醇，结果可显著提
高细胞中紫杉醇的含量，同对照相比，紫杉醇产量均
明显增加，但在培养的其他时间添加效果均不佳。
在黄酮生物合成途径中，苯丙氨酸裂解酶催化
苯丙氨酸生成肉桂酸。本研究发现苯丙氨酸的添加
可以增加苯丙氨酸裂解酶的活性 ，这可能是因为底
物的增加导致酶活性的增加。而肉桂酸的添加却导
致PAL的活性显著降低，这与项雷文 】 的结果一
致。其原因可能是在黄酮的生物合成过程中，PAL
是关键酶，催化苯丙氨酸生成肉桂酸，而直接添加了
肉桂酸，则反馈抑制了PAL的活性。当然 PAL只是
其中的一个关键酶，而且是一种诱导酶，可以受多种
因素的诱导，其活性受多种因素影响。因此不同前
体的添加，对 PAL的影响不同。
我们从前体的角度出发来探讨提高甘草细胞合
成甘草黄酮的有效办法，虽然前体物的添加在一定
程度上能够提高甘草黄酮的产量，但这远远不够，只
有从分子水平上弄清甘草黄酮生物合成的途径和机
理，并从基因水平上对其进行调控，增加次生代谢产
物合成过程中一系列关键酶基因的表达量，这才能
彻底解决药用植物细胞培养次生代谢产物低的难
题，真正实现植物细胞培养技术工业化生产次生代
谢产物的目的。
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