全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (2) : 157～ 161
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
大血藤黄酮类化合物的提取与分析Ξ
李钧敏1　陈永辉1　金则新1　钟章成2
(1. 台州师范专科学校生化系, 浙江临海　317000; 2. 西南师范大学生命科学学院, 重庆北碚　400715)
关键词: 大血藤叶片; 黄酮类化合物; 提取; 测定
　　中图分类号: Q 946　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0220157205
Extraction and Ana lys is of Flavono ids from Sa rgen todoxa Cunea ta
L I Jun2M in1, CH EN Yong2H u i1, J IN Ze2X in1, ZHON G Zhang2Cheng2
(1. B iology and Chem istry D ep artm en t, T a iz hou T eachers Colleg e, L inhai, Zhejiang　317000, Ch ina;
2. F acu lty of L if e S ciences, S ou thw est Ch ina N orm a l U n iversity , Chongqing　400715, Ch ina)
Abstract: Severa l m ethods w ere u sed to ex tract the flavono ids from the leaves of S a rg en tod ox a
cunea ta w h ile concen tra t ion of flavono ids in the ex tract ion w as determ ined by differen t m ethods.
T he su itab le quan t ita t ive m ethods u sed in the eco logica l analysis of f lavon ids w as that u sing u lt ra2
vio let and 70% ethano l w as the best reagen t fo r ex tract ion. H eat ing w as no t necessary fo r ex trac2
t ion. T he con ten t of f lavono ids from differen t o rgan s w as leafb lade, annual tw ig, leafsta lk and
perenn ia l stem in tu rn.
Key words: S a rg en tod ox a cunea ta; F lavono id; Ex tract ion; D eterm inat ion
　　大血藤 (S a rg en tod ox a cunea ta ) 隶属大血藤科
大血藤属, 大血藤科为我国所特有[1 ]。大血藤为落叶
木质藤本, 长达 10 m , 生于林中、灌丛或山沟, 海拔
为 400～ 1 900 m , 根和藤可入药, 有强筋骨、活血散
瘀、止痛、通经之效, 并可治疗阑尾炎、风湿性关节炎
等, 又可用作杀虫剂[2 ]。有关大血藤次生代谢产物的
研究国内外较少: Rmoker 等分离了大血藤的三萜
类皂素如儿茶素等, 并发现在体内具有明显的抗病
毒效应[3 ]; H an 等证实了大血藤还含有较多的木质
素, 具有较强的抗氧化及防癌作用[4 ]。黄酮类化合物
是植物中非常重要的一类次生代谢产物, 是一类具
有广泛开发前景的天然药物。大血藤的茎含有较多
的单宁, 但大血藤茎及叶的黄酮类化合物的研究至
今未见报道。在植物体内, 黄酮类化合物常与糖结合
形成糖苷。黄酮类化合物在植物的分类及系统发育
研究中具有重要的地位, 研究植物黄酮类化合物的
生态学分布及与环境因子的关系具有重要的意义。
为了寻找简便可靠的分光光度法用于大血藤黄酮类
化合物的生态学分析, 我们以分布在天台山华顶森
林公园的大血藤为材料, 对其叶片黄酮类化合物的
提取方法和测定方法进行了比较与探讨, 并对不同
器官黄酮类化合物的含量进行了测定。
1　材料与方法
1. 1　材料与仪器
样地设在天台山华顶森林公园西茅蓬附近, 海
拔 820 m。在样地内选取 5 株大血藤植株, 每株之间
至少间隔 10 m , 随机剪取叶片、叶柄、嫩茎 (一年生)
与老茎 (多年生) , 用塑料袋封装, 立即带回实验室,
将材料洗净, 自然风干, 100℃水蒸气固定 215 m in,
70℃干燥 12 h, 研磨后经过 0125 mm 金属网筛, 将Ξ 收稿日期: 2001205216, 修回日期: 2001212216。基金项目: 国家自然科学基金项目资助 (批准号: 39870160)。
　　　作者简介: 李钧敏 (1973- ) , 女, 硕士, 从事生物化学与分子生物学的教学与科研工作。
烘干样品放入磨口广口瓶, 置于- 20℃冰箱保存, 备
用[5 ]。
紫外分光光度计为日本岛津UV 27401PC 型。
1. 2　方法
1. 2. 1　黄酮类化合物的抽提
乙醇加热搅拌抽提法[6, 7 ]: 取样品 012 g, 置
50 mL 小烧杯中, 加入不同体积比的乙醇 5 mL , 在
磁力搅拌器上加热至 60℃搅拌 30 m in, 转换至 10
mL 离心管中, 4 000 röm in 离心 5 m in, 取上清至 25
mL 容量瓶中, 再重复进行搅拌、离心, 上清混合, 直
至上清无色, 再用甲醇定容至 25 mL , 备用。
乙醇搅拌抽提法: 步骤同上, 但不进行加热, 室
温进行搅拌。
1. 2. 2　黄酮类化合物含量测定
氯化铝显色法[8 ]: 取 215 mL 抽提样品, 加入
10 mL A lC l32甲醇溶液, 充分振摇后, 测定A 420。以
一系列标准浓度的芦丁作标样, 制定标准曲线, 得回
归方程为: y = 01038 6x - 01003 7, r= 01999 8。
硝酸铝显色法[9 ]: 取 215 mL 样品, 用 30% 乙醇
补充至 1215 mL , 加入 0175 mL 5% N aNO 2, 加入
0175 mL 10% A l (NO 3) 3, 室温放置 6 m in 后, 再加
入 5 mL 1 mo löL N aOH , 混匀, 30% 乙醇稀释至刻
度, 10 m in 后测定A 510。以一系列标准浓度的芦丁作
标样, 制定标准曲线, 得回归方程为: y = 01016 7x +
01009 6, r= 01997 9。
直接测定法[6 ]: 直接测定样品的A 360。以一系列
标准浓度的芦丁作标样, 制定标准曲线, 得回归方程
为: y = 0. 028 4x - 0. 018 3, r= 0. 989 9。
紫外测定法[10 ]: 取 011 mL 样品, 加入 0. 1%
A lC l32甲醇溶液 112 mL , 再加入 117 mL 甲醇至
3 mL , 充分振摇后, 测定A 275。以一系列标准浓度的
芦丁作标样, 制定标准曲线, 得回归方程为:
y = 01045 5x + 01001 8, r= 01999 9。
HPLC 测定法[11 ]: 色谱仪为W aters2600, 色谱
柱为C18 柱 (416 mm ×250 mm ) , 检测器为W aters2
2487 D ual ΚA b so rbance D etecto r, 流动相为甲醇÷
014% 磷酸 (45 ÷ 55 vöv) , 流速为 1 mL öm in, 柱温
25℃, 波长 360 nm , 进样量为 20 ΛL , 灵敏度为
015 AU FS。取提取样品真空干燥, 用色谱甲醇定容
至25 mL , 取 5 mL 置 10 mL 容量瓶中, 加入 1 mL
25% HC l, 80℃水解 1 h, 水解液用甲醇定容至
10 mL , 取 20 ΛL 进 行 H PL C 测 定。 配 制
011 m gömL、012 m gömL、013 m gömL、014 m gömL
和015 m gömL 浓度的芦丁甲醇溶液, 同上水解, 用
H PL C 法测定, 制定标准曲线, 得回归方程为:
y = 3×108x - 312×105, r= 01999 7。
2　结果与讨论
2. 1　大血藤叶片黄酮类化合物的提取与测定
植物叶片黄酮类化合物的提取方法较多, 包括
热水浸泡法, 乙醇水溶液浸泡法, 甲醇回流抽提法
等。黄酮类化合物易溶于有机溶剂, 一般采取乙醇水
溶液浸泡法进行叶片黄酮粗制品的提取。
大血藤的茎含有较多的单宁, 但大血藤茎及叶
的黄酮类化合物的研究至今未见报道。在植物体内,
黄酮类化合物常与糖结合形成糖苷。芦丁为槲皮素232O 2芸香糖苷, 亦称芸香苷, 广泛存在于多种植物
体内, 研究较多, 因此常作为标准参照物, 用于植物
粗黄酮含量的测定。黄酮类化合物与三氯化铝、硝酸
铝等铝盐可形成络合物, 产生特征性的吸收光谱, 采
用分光光度法进行粗黄酮含量测定的方法, 一般有
氯化铝比色法, 硝酸铝比色法。在低浓度的三氯化铝
存在下, 黄酮类化合物的最大吸收峰可发生位移, 如
果与标准参照物的吸收峰刚好吻合的话, 则可用紫
外测定法进行检测。另外由于黄酮类化合物的特征
吸收峰, 因此也可直接在 360 nm 测定黄酮类化合
物的含量。由于植物叶中黄酮类化合物的种类多, 总
黄酮含量测定一直没有统一的标准, 九十年代
H PL C 测定方法取代了国内曾流行的比色法, 目前
此法已被许多国家采用。本研究将不同抽提方法得
到的大血藤叶片黄酮提取液及标准芦丁用 5 种方法
进行测定, 分析各方法的可行性, 结果见表 1。
芦丁在 360 nm 左右具有较高吸收峰如图 1 曲
线 1, 因此可在 360 nm 波长处直接测定芦丁的含
量; 大血藤叶片黄酮提取液经波长扫描, 发现在
360 nm 处并无吸收峰, 如图 1 曲线 2。
芦丁加入 011 mo löL A lC l32甲醇溶液混匀, 可
在 436 nm 处有一明显的吸收峰出现, 如图 1 曲线 3
所示; 但是大血藤叶片黄酮提取液加入 011 mo löL
A lC l32甲醇溶液混匀, 经波长扫描, 在 420 nm 处有
一小吸收峰出现, 如图 1 曲线 4 所示。
芦丁与N aNO 2 及 A l (NO 3 ) 3 反应后, 再加入
N aOH 可在 510 nm 处有一明显的吸收峰, 如图 1 曲
线 5 所示; 大血藤叶片黄酮提取液在与硝酸铝显色
后经波长扫描, 在 510 nm 处也有一明显的吸收峰
出现, 如图 1 曲线 6 所示, 两者的吻合性较好。
芦丁处于 0104% A lC l32甲醇溶液中, 可出现最
851 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　 　第 20 卷　　
表 1　大血藤叶片黄酮类化合物的提取方法比较
T able 1　T he determ inan t of flavono ids ex tracted from S arg en tod ox a cunea ta leafb lades w ith differen t m ethods
方法
M ethods
黄酮提取量 (m gög 干重)
Ex traction rate of flavono ids (m gõg- 1 dry w eigh t)
氯化铝显色法 硝酸铝显色法 直接测定法 紫外测定法 H PL C 测定法
甲醇回流抽提法
M ethano l circum fluence 27. 80 184. 38 30. 63 41. 25 57. 98
95% 乙醇加热搅拌法
95% ethano l heating m ix tu re 23. 28 113. 67 39. 12 55. 71 60. 14
85% 乙醇加热搅拌法
85% ethano l heating m ix tu re 25. 02 153. 25 44. 29 70. 82 65. 72
70% 乙醇加热搅拌法
70% ethano l heating m ix tu re 20. 42 147. 19 47. 41 71. 44 63. 14
70% 乙醇搅拌法
70% ethano l m ix tu re 17. 33 118. 14 47. 71 67. 12 61. 04
高吸收峰的改变, 如图 1 曲线 7 所示, 吸收峰从
260 nm 转移至 275 nm ; 大血藤叶片黄酮提取液同样
处于 0104% A lC l32甲醇溶液中, 经波长扫描, 发现
其大血藤叶片黄酮提取液的吸收峰从 280 nm 转移
至 27415 nm , 如图 1 曲线 8 所示。在低浓度的A lC l3 存在下, 紫外吸收光谱的改变是所有黄酮化合物的特征性波谱反应, 而移动后大血藤黄酮提取液与芦丁在紫外有吸收峰都出现在 275 nm 左右。大血藤黄酮类化合物水解产物的H PL C 测定图谱见图 2。
波长　W avelength (nm )
1. 芦丁标样 200～ 600 nm 扫描; 2. 大血藤叶片 95% 乙醇加热搅拌法提取液 200～ 600 nm 扫描; 3. 芦丁+ 011 mo löL A lC l32
甲醇溶液 200～ 600 nm 扫描; 4. 大血藤叶片 95% 乙醇加热搅拌法提取液+ 011 mo löL A lC l32甲醇溶液 200～ 600 nm 扫描 ;
5. 芦丁+ 10%A l (NO 3) 3 400～ 600 nm 扫描 ; 6. 大血藤叶片 95% 乙醇加热搅拌法提取液+ 10% A l(NO 3) 3 400～ 600 nm 扫
描; 7. 芦丁+ 0104%A lC l32甲醇溶液 200～ 600 nm 扫描; 8. 大血藤叶片 95% 乙醇加热搅拌法提取液+ 0104% A lC l32甲醇
溶液 200～ 600 nm 扫描
1. T he w ave scan of 01016 m gömL lu tine2m ethano l from 200 to 600 nm ; 2. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith ho t
95% ethano l dilu ted w ith m ethano l from 200 to 600 nm ; 3. T he w ave scan of lu tine2m ethano l reacted w ith 011 mo löL
A lC l32m ethano l from 200 to 600 nm ; 4. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith ho t 95% ethano l reacted w ith
011 mo löL A lC l32m ethano l from 200 to 600 nm ; 5. T he w ave scan of lu tine reacted w ith 10%A l (NO 3 ) 3 from 400 to
600 nm ; 6. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith ho t 95% ethano l reacted w ith 10% A l (NO 3) 3 from 400 to 600 nm ;
7. T he w ave scan of lu tine in 0104% A lC l32m ethano l from 200 to 600 nm ; 8. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith
ho t 95% ethano l in 0104% A lC l32m ethano l from 200 to 600 nm
图 1　大血藤叶片黄酮含量不同测定方法的波长扫描图谱
F ig11　T he w avelength scan p lo t of flavono ids ex tracted from S arg en tod ox a cunea ta leafb lades w ith differen t reagen ts
　
951　第 2 期　　　　　　　　　　　　　李钧敏等: 大血藤黄酮类化合物的提取与分析
图 2　大血藤黄酮水解产物的 HPLC 分析图谱
F ig12　T he H PL C analysis of hydro lyzed flavono ids of S arg en tod ox a cunea ta
　　　从表 1 来看, 氯化铝显色法测定的值最小, 并且
由图 1 可知此法不适合大血藤叶片粗黄酮含量的测
定。紫外测定法与H PL C 测定法测定的值较接近,
而硝酸铝测定法测定的值则偏高, 为前两种方法的
2 倍左右。
银杏的黄酮类化合物研究较多, 据文献报道, 用
硝酸铝测定法测定银杏叶片黄酮含量大于
2% [12, 13 ] , 如邢世岩等[12 ]报道银杏叶中总黄酮含量
2. 8 % ; 而采用H PL C 法进行测定, 银杏叶中总黄酮
含量为 1% 左右[14, 15 ] , 如郁青等[14 ]报道浙江 8 月份
的银杏叶总黄酮量为 1. 44%。从本文结果及银杏测
定的文献报道结果分析, H PL C 法与紫外测定法都
适合于大血藤黄酮类化合物含量的测定。
由于进行生态学研究时涉及的样本量较大, 因
此不适合采用H PL C 法进行测定, 而紫外测定法则
比较适合于大血藤粗黄酮含量的生态学分析。
从紫外测定法及H PL C 测定法测定结果来看,
不同抽提方法提取的大血藤总黄酮的得率依次为:
70% 乙醇加热搅拌法> 85% 乙醇加热搅拌法> 70%
乙醇搅拌法> 95% 乙醇加热搅拌法, 这与文献[6 ]报
导相符。由于加热操作较麻烦, 且在加热搅拌过程中
乙醇易挥发, 并且从表 1 可知加热与否对大血藤黄
酮得率影响不大, 因此我们主张在大血藤黄酮提取
过程中宜采用 70% 乙醇搅拌法。
2. 2　大血藤不同部位总黄酮的含量测定
利用 70% 乙醇搅拌法提取大血藤不同器官的
黄酮类化合物, 盐酸水解后利用H PL C 法, 以芦丁
水解产物为标样测定黄酮含量, 结果显示在大血藤
叶片中黄酮含量最高, 达 61104 m gög 干重, 其次是
一年生嫩茎 (21173 m gög 干重)、叶柄 (17197 m gög
干重)、多年生老茎 (14101 m gög 干重)。其中叶片黄
酮含量是一年生嫩茎的 2181 倍、叶柄的 3140 倍、多
年生老茎的 4135 倍。而用紫外吸收法直接测定在大
血藤提取液的黄酮含量, 可知叶片中黄酮含量最高,
达 61127 m gög 干重、其次是一年生嫩茎 ( 21142
m gög 干重)、叶柄 (19133 m gög 干重)、多年生老茎
(13143 m gög 干重)。其中叶片黄酮含量是一年生嫩
茎的 2186 倍、叶柄的 3117 倍、多年生老茎的 4156
倍。
2. 3　回收率试验
另取大血藤叶片样品 011 g 进行黄酮类化合物
抽提, 做 3 个平行。经 H PL C 测定其含量分别为
80155 m gög 干重、85142 m gög 干重和 84136 m gög
干重, 其变异数为 311% ; 经紫外测定其含量分别为
87125 m gög 干重、81132 m gög 干重和 85181 m gög
干重, 在大血藤样品中加入芦丁分别为 015 m g、
1 m g、2 m g, 经 H PL C 测定其含量, 回收率平均为
9718% ; 经紫外测定法测定其回收率平均为
9613% , 证明了 H PL C 测定法与紫外测定法测定大
血藤黄酮含量的可行性。
3　结语
综合文献及笔者的研究结果, 在生态学研究中
大血藤粗黄酮测定的适用方法是紫外测定法, 最佳
的提取方法是 70% 乙醇提取法, 加热与否对得率影
响不大, 但可以节约提取的时间。在大血藤植株的不
同器官中, 粗黄酮含量变化依次是叶片、一年生嫩
061 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　 　第 20 卷　　
茎、叶柄、多年生老茎。
参考文献:
[ 1 ]　应俊生, 张玉龙. 中国种子植物特有属. 北京: 科学出
版社, 1994. 536 539.
[ 2 ]　王景祥主编. 浙江植物志 (第 2 卷). 杭州: 浙江科学
技术出版社, 1992. 306.
[ 3 ] 　Rmoker G, M ayer R , Sh in2K im J S. T riterpene
sapon ins from the Ch inese drug “D axueteng ”
(Cau lis sarg en tod ox ae). P lan ta M ed , 1991, 57 (5) :
468 70.
[ 4 ]　H an G Q , Chang M N , Hw ang S B. T he investiga2
t ion of lignans from S arg en tod ox a cunea ta (O liv )
R ehd et W ils. A cta P harm aceu tica S in ica , 1986, 21
(1) : 68 70.
[ 5 ]　何维明, 钟章成. 绞股监种群次生代谢产物的动态及
其生态学意义. 云南植物研究, 1998, 20 (4) : 434
438.
[ 6 ]　梁红, 潘伟明, 张伟锋. 银杏叶黄酮提取方法比较. 植
物资源与环境, 1999, 8 (3) : 12 17.
[ 7 ]　毛燕, 黄必恒. 龙柏叶总黄酮提取条件的研究. 浙江
林学院学报, 2000, 17 (1) : 102 105.
[ 8 ]　唐宇, 赵钢, 任建川. 荞麦中总黄酮和芦丁含量的变
化. 植物生理学通讯, 1989, 25 (1) : 33 35.
[ 9 ]　吴文珊, 纪小苹, 王扬飞, 等. 薜荔叶及花序托中总
黄酮的提取工艺. 植物资源与环境学报, 2000, 9 (2) :
55 56.
[ 10 ]　王常青. 黄刺玫叶片中黄酮物质的提取和分析. 食品
工业科技, 1999, 20 (5) : 14 16.
[ 11 ]　刘素艳, 杨宇春, 赵宏, 等. 银杏总黄酮含量的
H PL C 测定. 中国医药工业杂志, 1999, 30 (11) :
513 514.
[ 12 ]　刑世岩, 有祥亮, 李可贵, 等. 银杏营养器官黄酮及
变化规律的研究. 林业科技通讯, 1998, (1) : 10
12.
[ 13 ]　王华田, 孙明高, 陈鹏飞. 影响银杏叶黄酮含量的相
关因素. 山东农业大学学报. 1997, 28 (3) : 342 346.
[ 14 ]　郁青, 沈兆邦, 陈祥, 等. 银杏叶中黄酮苷含量变化
规律研究. 林产化工通讯. 1998 (2) : 3 6.
[ 15 ]　胡敏, 张艳红, 胡艳, 等. 银杏黄酮苷的水浸提方法
研究, 食品与发酵工业. 1999, 24 (4) : 31 34.
161　第 2 期　　　　　　　　　　　　　李钧敏等: 大血藤黄酮类化合物的提取与分析