全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20( 2) : 83～88
Journal of Wuhan Botanical Research
柚子( Citrus grandis Osbeck ) S-like核酸酶基因
CgSL1的分离与特征分析
王 平1 薛勇彪2 吕柳新1
( 1.福建农林大学园艺学院, 福州 350002; 2.中国科学院发育生物学研究所, 北京 100080)
摘 要: 从柚子(Citrus grandis Osbeck) 2 个自交不亲和品种 溪蜜柚和度尾蜜柚的花柱中克隆出一个类似 S 核
酸酶基因 CgS L 1 (C . grandis S-like RNase) , 它的 cDNA 序列全长 1 074 bp,编码 297 个氨基酸。通过与其它植物
S-like核酸酶和 S 核酸酶氨基酸序列进行比较, 发现 CgS L 1 类似于 S-like核酸酶,与拟南芥中的 RNS2 一致性为
62. 5%。对 Cg SL 1 的表达分析表明该基因在花柱、花药、叶片不同器官以及花柱的不同发育阶段均有表达,且在花
柱中的表达随衰老增强, 由此推测它可能与衰老有关。
关键词: 柚; 花柱; RT-PCR; S-like核酸酶
中图分类号: S 666. 3; Q943. 2 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2002) 02-0083-06
Cloning and Analysis of a S-like RNase Gene CgSL1 from
Self-incompatible Cultivars in Citrus grandis Osbeck
WANG Ping
1, XUE Yong-Biao
2 , LU
··
Liu-Xin
1
( 1. Dep artment of H ort icul tur e, Fuj ian Ag ri culture and Forestry Univ er si ty, Fuzh ou 350002, Ch ina;
2. I nstitute of Dev elop mental B iology, T he Chinese A cademy of S ci ences, Beijing 100080, Ch ina)
Abstract: A gene encoding a S-like RNase ( CgS L 1) w as isolated f rom the sty les of tw o self-in-
compat ible pomelo cult ivars Citr us gr andis Osbeck vs. Guanxi and vs. Duw ei. T he cDN A of
CgS L 1 w as 1 074 bp in length w ith a capability of encoding a polypept ide consist ing of 297 amino
acids. Sequence comparison show ed that CgSL 1 w as mo re sim ilar to S-like RNases than to S
RNases and had a highest similarity w ith 62. 5% ident ity to RNS2 from A rabid op sis thaliana. T o
reveal the t issue specificity and the temporal expr ession patterns o f CgS L 1, RT -PCR was con-
ducted w ith RNAs from several tissues. Results show ed that CgS L 1 expressed in styles, anther s
and leaves, and its expression in styles increased in the pr oceeding o f style senescence, suggest ing
that CgS L 1 may be related to senescence.
Key words : Citrus grandis Osbeck; Sty le; RT-PCR; S-l ike RNases
在柚子( Cit rus gr andis Osbeck)中,存在大量自
交不亲和( SI)品种, 福建的 溪蜜柚和度尾蜜柚被
认为是自交不亲和的,并推测属配子体SI [ 1, 2]。目前
的研究表明大多数的配子体 SI 植物的 S 位点编码
一类核酸酶,称为 S核酸酶 [ 3]。为了探讨柚自交不亲
和性与 S核酸酶的关系, 我们开展了柚 S 核酸酶基
因的分离研究。研究发现,柚的自交不亲和品种中,
除存在控制自交不亲和性 S核酸酶外(王平等,待发
表数据) , 和其它配子体 SI植物如蔷薇科、茄科、玄
参科的种一样[ 3] ,也存在 S-like核酸酶。由于这类核
酸酶不是 S 位点的产物,因此它们与自交不亲和性
无关,仅参与其它植物生理过程。笔者报道了柚子的
收稿日期: 2001-06-04,修回日期: 2001-07-03。
作者简介:王平( 1968- ) ,男,讲师,果树学专业,从事园艺植物遗传与育种以及生物技术教学和科研。
本实验在中科院发育生物研究所植物遗传与发育实验室完成。
一个 S-like 核酸酶基因 CgS L 1,并对它的表达进行
了分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试品种为 溪蜜柚(福建省平和县)和度尾蜜
柚(福建省仙游县度尾镇) 2个自交不亲和品种。在
花蕾 0. 5 cm、1 cm、开花当天和谢花后 4 个不同时
期,采集花柱、柱头、花药和幼嫩叶片等不同器官,分
别取 5 g 作为提取 RNA 的材料。
1. 2 总 RNA的提取和 cDNA链的合成
总 RNA 抽提采用异硫氰酸胍方法[ 4]。采用
Smart L ibrary Construction Kit ( Clontech ) , 合成
cDNA (合成时引物: CDSⅢ引物: 5′-AT TCT A-
GAGGCCG AGGCGGCCGACATG-d( T ) 30N-1N -
3′, 其中 N = A, G, C 或 T , N-1 = A , G 或 C。
SMARTⅢ引物: 5′-AAGCAGT GGT ARCAACGC-
AGAGT GGCCATT AT GGCCGGG-3′)。
1. 3 RT-PCR扩增和 RACE方法
分 2次进行扩增:首先对 3′端扩增。一端引物是
根据已知的 S-like 核酸酶和 S 核酸酶氨基酸序列
C2 区高度保守的特征, 设计合成简并引物 G2243
( 5′-TT ( T / C ) ACYAT YCA ( T/ C ) GGYGTYT G-
GCC-3′) , 其中 Y 是 G、A、T 或 C。另一端引物为
CDSⅢ。然后根据测序的核苷酸序列结果设计 2个
特异引物和 SMARTⅢ引物组成 2对引物进行套式
PCR,对该核酸酶 5′端进行扩增。套式 PCR 引物:
SMART Ⅲ和 D102 ( 5′-GGAACCTGGCCT T CT T -
GCT G-3′)一组, SMART Ⅲ和 D101( 5′-CAGCAA-
GAAGGCCAGGTT CC-3′)一组。RT-PCR 的条件
参照Xue et al . [ 5]。
1. 4 PCR产物的纯化和 pBluescript 载体连接
PCR 产物采用 PCR Pr eps DNA Purif icat ion
System Kit ( Pr omega 公司)纯化。纯化后的片段和
pBluescript ( Promega 公司)载体连接。
1. 5 感受态细胞的制备和连接反应物的转化
用 CaCl2法制备 DH5感受态细胞[ 4]。进行热
激将质粒 DNA 导入感受态细胞中。转化: 取
30. 0 mL DH5感受态细胞, 3 mL 连接产物, 冰浴
30 m in, 42℃热激 55 s,冰浴 2 min, 加 SOC 培养基
300 mL, 37℃复苏 60 min,吸 150 mL 菌液涂 LB平
板( Amp+ X-gal+ IPTG) , 37℃培养 16 h,进行蓝白
斑筛选。
1. 6 阳性克隆的筛选、鉴定、酶切分类和 DNA 序
列测定
采用煮沸裂解法鉴定阳性克隆。挑选白斑,经扩
大培养, 提取质粒, PCR 检测以及酶切分类后,挑选
片段用 ABI377自动测序仪进行测序。DNA 序列分
析和比较分别利用 DNASTAR 软件包和 Blast 程
序完成。
1. 7 表达分析
根据 CgSL 1的核苷酸序列测定结果,在其内部
设计 2 个特异引物 D103 ( 5′-T ATA ATGATG-
GACCTGGCC-3′) 和 D102 ( 5′-GGAACCT GGC-
CT TCT TGCTG-3′)以及 cDNA 合成引物 CDSⅢ,
从各时期和不同器官的组织中抽提总 RNA 进行
RT -PCR, 来检测该核酸酶在这些时期和器官的表
达情况。RT -PCR产物的 DNA 杂交分析按标准方
法进行[ 4]。探针为 CgS L 1的 cDNA,其32P的标记按
说明完成 ( Pr imer -a-gene-labeling kit , Promega 公
司)。
2 结果与分析
2. 1 柚 S-like核酸酶基因 CgSL1的分离
从 溪蜜柚和度尾蜜柚 2个品种开花当天的花
柱中抽提总 RNA 逆转录合成 cDNA, 进行 RACE
和 RT -PCR 扩增。用 S 核酸酶 C2 区的简并引物
G2243 和逆转录引物 CDSⅢ对 cDNA 3′扩增出
800 bp的片段。然后根据测序的核苷酸序列结果设
计特异引物 D102和 SMARTⅢ进行 5′端扩增。由
于出现非特异性扩增,于是在第一次扩增的基础上
用另一对引物 SMARTⅢ和 D101 进行套式 PCR,
得到 1个 280 bp的片段。实验从 溪蜜柚和度尾蜜
柚花柱中成功地分离到 1个与核酸酶相同的完整基
因,该基因的 cDNA 全长序列 1 074 bp(图 1)。它所
编码的氨基酸序列含 279个氨基酸。通过同源性比
较发现该基因是一个 S-like 核酸酶基因(图 2) , 把
它定名CgSL 1( Citrus grandis S-like RNase 1)。
2. 2 CgSL1与其它核酸酶的氨基酸序列比较
图 2为 CgS L 1与其他植物 S-l ike 核酸酶、S 核
酸酶的氨基酸排列序列比较。CgSL 1与其它几个植
物核酸酶氨基酸序列, 都具备 C2 和 C3 2 个保守区
16个保守残基特征,这些残基是 S-like 核酸酶和 S
核酸酶的活性部位。其中, C2 和 C3 2个保守区中 2
个保守的组氨酸, 被认为在 S 核酸酶和 S-like 核酸
酶中都是必要的[ 3, 5]。另外在 59、102、154、219 和
243位置上共享有 5个保守的半胱氨酸。笔者认为
84 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷
终止密码子用小黑点 (·)表示。
The tr anslation stop codon is show n by a black dot .
图 1 CgSL1的核苷酸和氨基酸序列
F ig . 1 Nucleotide and amino acid sequences o f Cg SL 1
这 5个保守的半胱氨酸与核酸酶的构象有关,形成
核酸酶的骨架折叠 [ 3, 5]。除 C2和 C3 2个保守区和 5
个保守的半胱氨酸以外, 它们在 125、126、143、144、
165、166、184、205和 206位置上也有保守的氨基酸
残基。这些保守区和氨基酸残基说明 CgSL 1具备S
类核酸酶的共同特征。当进一步比较时, 发现CgSL 1
更相似于 S-like 核酸酶。它和 S-like核酸酶氨基酸
序列, 有 32个氨基酸残基为这类核酸酶所严格保
守, 这比S核酸酶特有严格保守的氨基酸残基( 8个)
要多 24个(图 2)。这些氨基酸残基在S 核酸酶中是
不严格保守的。如 14位置的亮氨酸有一些为苯丙氨
酸或亮氨酸或丝氨酸所代替。
表 1 CgSL1与其它植物 S-like核酸酶和 S核酸酶的氨基酸一致性的比较
T able 1 Pairw ise amino acid sequence ident ities o f S-like RNases and S RNases of CgS L 1 and o ther plants
柚
(C . gran-
dis)
Cg SL 1
S 核酸酶 S RNases
金鱼草
A ntir rhinum
AHS2 AHS4 AHS5
烟草
N . alata
LA1 LA2
番茄
L . p eru-
v ianum
LPS3
S-like核酸酶 S-like RNases
拟南芥
A rabid op sis
RNS1 RNS2 RNS3
蓠打碗花
C . se-
p ium
CSS-L
番茄
L . es cu-
lentum
RNLE
*** 18. 5 22. 2 19. 4 22. 4 21. 3 22. 2 32. 0 62. 5 25. 4 48. 4 28. 2 CgS L 1
*** 34. 5 44. 7 24. 7 34. 3 29. 3 23. 7 18. 5 24. 9 18. 5 23. 5 AHS2
*** 26. 5 23. 5 29. 0 24. 6 24. 3 22. 8 21. 9 19. 9 25. 3 AHS4
*** 30. 0 32. 5 26. 3 20. 7 22. 9 22. 5 17. 6 20. 0 AHS5
*** 48. 5 47. 3 26. 0 20. 0 26. 6 20. 6 22. 9 LA1
*** 44. 9 24. 9 18. 9 27. 2 20. 7 23. 7 LA2
*** 27. 5 21. 0 25. 7 21. 6 24. 6 LPS3
*** 30. 2 58. 6 27. 8 66. 3 RNS1
*** 26. 0 44. 1 26. 5 RNS2
*** 20. 7 52. 1 RNS3
*** 27. 1 CSS-L
*** RN LE
注: 表中的数字为氨基酸一致性百分比。除蓠打碗花外, 其余序列的来源与图 2 一样。
Notes: Va lues show t he per centa ge o f amino acid identity . T he sources of the sequences a re the same as in F igur e 2 except CSS-L fr om Caly steg ia sep ium ( Van Damme et al., 2000) [ 12] .
85 第 2 期 王 平等: 柚子(Citrus grandis Osbeck) S-like 核酸酶基因 Cg SL 1 的分离与特征分析
C2 至 C3 相对应的区域是已经证实在茄科 S-核酸酶中保守的结构域。加粗表示保守的残基, * 号为所有的序列都保守。
短线为空的残基。各个序列的来源如下: 沙梨( Nor ika et al ., 1999)、秘鲁番茄( Royo et al., 1994; Jo st et al., 1991)、拟南芥
( T ay lo r et al., 1993)、金鱼草( Xue et al ., 1996)、苹果( Sassa et al., 1996)和巴旦杏( U shijima et al., 1998)。
C2 and C3 co rr espond t o prev iously identified conserv ativ e domains among S RNases o f So lanaceae specices. Conserv ed
r esidues ar e indicat ed by bo lding ;“* ”indicates conser ved r esidues among all sequences. Shor t lines are gaps introduced
t o max imize t he a lignment. Sequences are from Janpanese pear ( No rika et al., 1999) [ 6] , w ild tomato ( Royo et al., 1994;
Jo st et al., 1991) [ 7, 8] , A rabidop sis ( T ay lo r et al., 1993) [9] , Antir r hinum ( Xue et al., 1996) [5] , apple ( Bro othaer ts et al.,
1995) [10] and almond ( Ushijima et al., 1998) [ 11] .
图 2 CgSL1与其它植物 S-like核酸酶和 S核酸酶的氨基酸序列排列
F ig . 2 Amino acid sequence alignm ent of S-like RNases and S Rnases of CgS L 1 and other plants
86 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷
2. 3 CgSL1与其它核酸酶的序列相似性分析
为了进一步研究 CgS L 1和其他植物 S 核酸酶
和 S-like 核酸酶的关系,对它们之间的序列一致性
作了比较(表 1)。CgS L 1与 S 核酸酶的相似性在
18. 5%～22. 4%之间, 而它与 S-l ike 核酸酶的一致
性在 25. 4%以上, 其中它与拟南芥中 RNS2的一致
性达到 62. 5%。而 RNS2与 S核酸酶的相似性仅在
25%之下。因此, CgS L 1的结构非常类似于 RNS2。
2. 4 CgSL1的表达分析
为了确定 CgSL 1的时空表达情况,从 2个柚品
种、4个不同时期的花柱以及柱头、花药和叶片不同
器官组织中提取RNA 作基因表达分析(图 3)。根据
CgSL 1的核苷酸序列设计特异引物 D103和 D102
进行表达检测, 其中 3, 4, 5 泳道的产物是用 D103
和D102以及D103和 CDSⅢ两对引物进行检测的。
杂交结果表明, 从花柱中得到的 CgS L 1在 溪蜜柚
和度尾蜜柚的花柱以及柱头、叶片和花药不同器官
都有不同程度的表达,花柱和柱头中有较强的表达,
而叶片和花药中表达要弱一些。由此说明 CgS L 1是
不具备花柱器官表达的特异性。结果还发现,在 3个
不同时期的花柱组织中 CgS L 1表达也不完全一致,
在 800 bp 大小的片段上,表现出衰老的花柱器官杂
交信号增强(见图 3: A、B中 3, 4, 5泳道) ,谢花后的
花柱比开花前有更强的趋势。从表达结果推测,
CgSL 1与自交不亲和性的表达无关,而可能是与衰
老有关的 S-like 核酸酶基因。
A 和 B 分别为 CgS L 1 的表达产物的电泳和杂交结果。1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 和 M 分别代表叶片,花药, 谢花后花柱,花蕾
1 cm时的花柱, 花蕾 0. 5 cm 时的花柱, 度尾蜜柚开花时花柱, 溪蜜柚开花时花柱,柱头和 1 kb DNA Ladder Marker。
A and B represent the RACE product s o f CgSL 1 ana ly zed by agaro se gel electr ophor esis and hybridization, r espective-
ly . L ane1, leaves; 2, ant her s, 3～7 sty les fr om flow er buds of po st-anthesis, 1 cm, 0. 5 cm, ant hesis ( Duw ei) and anthesis
o f Guanx i, respect ively , and 8, stigma; M , 1 kb DNA Ladder Marker.
图 3 CgSL1 的组织特异性和时空表达
Fig. 3 T issue specificity and tempo ral expr ession of CgS L 1
3 讨论
S-核酸酶和 S-like 核酸酶在初级结构上具有一
些共同的特征,具有广泛的相似性。表现在这两类植
物核酸酶都保守的这些残基在 RNase T 2和 RNase
Rh 两个真菌核酸酶中也保守。显示出它们属核酸
酶 T2型。虽然两者共有一些结构特征,但是它们还
拥有各自不同的一些高度保守的残基[ 9]。更重要的
是,它们执行的是 2个完全不同的生理功能。因此,
有必要弄清楚这两者有一个什么样的进化关系和它
们调控的机理有哪些不同。
柚子 CgSL 1 氨基酸序列与大多数 S-like 核酸
酶相似, 除了 C2和 C3两个保守区外,有 32个严格
保守的氨基酸残基, 它与 S 核酸酶的相似性仅在
18. 5%～22. 4%之间, 而与 S-like 核酸酶的相似性
在 25. 4%以上, 最高的与拟南芥的 S-like 核酸酶
RNS2的相似性达 62. 5%。RNS2在所有的器官组
织中都有表达, 但在花柱中表达量最高。CgS L 1与
RNS2一样,表现出相同的结果,从而证明它不是花
柱器官的特异性表达。在 3个不同时期的花柱组织
作基因表达分析时, CgS L 1 表达也不完全一致,
800 bp大小的片段上表现出衰老的花柱器官表达量
有更强的趋势, 但仍还需要进一步做基因功能实验
来证实。RNS2已证明是与衰老相关的 S-like 核酸
酶。衰老对植物核酸酶活性的效果前人已经进行了
较深入的研究。一般来讲,在植物衰老过程中,核酸
酶活性逐渐增强,但在不同的系统中,增强的时期和
程度并不相同。现在已弄清楚衰老很明显地调控单
个核酸酶活性和基因的表达。如拟南芥的 3个核酸
酶 RNS1、RNS2、RN S3在叶片中伴随衰老过程受
87 第 2 期 王 平等: 柚子(Citrus grandis Osbeck) S-like 核酸酶基因 Cg SL 1 的分离与特征分析
到不同程度的诱导: RNS1 mRNA 水平仅仅轻微地
增强, 而 RNS2 和 RNS3 的 mRNA 增 强很显
著[ 9, 13]。在衰老过程中,细胞结构被分解,一些植物
组织中大分子也相继降解,游离出来的营养转到其
它组织中。这个过程被认为是为了保留矿物质和物
质的再利用而出现的。这种降解和重新分布既可出
现在营养生长过程中(如从衰老的子叶中营救矿物
质) , 又可出现在生殖过程中(如受精后花柱迅速凋
萎)。核酸酶可能还包括衰老过程中各种不同的水解
酶,它们加速细胞成分的降解。在磷饥饿的状态下,
也可诱导它们的产生, 被认为可能参与磷的转移和
再利用过程[ 9, 13]。当衰老、机械损伤或凋亡的细胞出
现溶菌现象时, 胞外核酸酶就从这些细胞的 RNA
中把磷营救出来, 使它参与植物代谢的其它过
程[ 14 , 15]。根据本研究所得结果看, CgSL 1是一个与
RNS2 极为相似的 S-like 核酸酶。它与柚的自交不
亲和性没有关系, 而可能是与衰老相关的 S-like 核
酸酶。植物受精后花柱会迅速凋萎,可能与这类核酸
酶的大量表达有关。
自交不亲和性在柚类果树中普遍存在, 是柚类
无核或少核的重要原因之一。芸香科中的官溪蜜柚
和度尾蜜柚是具有很高经济价值的果树, 但在果实
成熟和储藏过程中, 存在一些品质问题, 如汁胞粒
化、裂果、裂瓣严重,影响其商品价值。这类衰老相关
基因是否参与了果实的衰老过程, 是一个值得进一
步研究的课题。
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