全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 591−599 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A100), 教育部博士点基金项目(20120182110024)和国家科技支撑计划项
目(2011BAD35B02-05)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: mj_struggle@163.com
Received(收稿日期): 2013-09-30; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-02-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140214.1016.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00591
水稻叶缘白化突变体 mal的遗传分析与基因定位
马 娇 任德勇 吴国超 朱小燕 马 玲 桑贤春 凌英华 何光华*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 植物叶色变化对叶绿体发育和叶绿素生物合成等光合系统结构和调控机制的研究有着重要的理论意义。水
稻叶缘白化突变体 mal (marginal albino leaf), 来源于恢复系缙恢 10号(Oryza sativa L. ssp. indica)的 EMS诱变群体,
经过多代自交, 其突变性状遗传稳定。与野生型相比, mal 突变体整个生育期叶片边缘白化且叶片变窄, 抽穗期倒三
叶叶片、倒二叶叶边缘以及倒三叶叶边缘的叶绿素含量极显著降低。透射电镜观察发现, mal突变体叶片绿色部位细
胞与叶绿体发育完全, 白化部分叶肉细胞大部分中空, 无明显完整的细胞器, 叶绿体内部完全降解。遗传分析表明该
突变体受隐性核基因控制, MAL被定位在第 8染色体上 SSR标记 M22和 InDel标记 ID27之间, 物理距离为 171 kb。
本研究将为 MAL基因的图位克隆及功能研究奠定基础。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.); 叶缘白化突变体; 遗传分析; 基因定位
Genetic Analysis and Gene Mapping of a Marginal Albino Leaf Mutant mal in
Rice
MA Jiao, REN De-Yong, WU Guo-Chao, ZHU Xiao-Yan, MA Ling, SANG Xian-Chun, LING Ying-Hua, and
HE Guang-Hua*
Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops /
Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China
Abstract: The research on the color change of plant leaf is very important to clarify the structure and mechanism of photosyn-
thetic system, such as chloroplast development and chlorophyll biosynthesis. A novel rice mutant mal (marginal albino leaf) with
marginal albino leaf, was derived from the EMS-treated restorer line Jinhui 10. The mutant trait inherited steadily after several
generations’ self-crossing. The mal leaf displayed albino margin and narrow blade in the whole life. Compared with the wild type,
mal decreased contents of photosynthetic pigments very significantly in the whole third leaf blade, margin parts of the second and
third leaves at heading stage. The observation by that transmission electronic microscopy showed cells and chloroplasts in the
green part of mal leaf developed normally, while in the albino part, the mesophyll cells were nearly hollow without obvious intact
organelles and the chloroplast were fully degraded. Genetic analysis showed that the mutant trait was controlled by single reces-
sive nuclear gene. MAL was finally mapped between SSR marker M22 and InDel marker ID27 with an interval of 171 kb on
chromosome 8. These results provide a foundation for cloning and function analysis of MAL.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); marginal albino leaf (mal); Genetic analysis; Gene mapping
叶片是植物最主要的光合器官, 光合作用主要
发生在叶绿体上, 叶绿体是植物细胞所特有的半自
主性细胞器, 也是叶绿素、脂类、淀粉和氨基酸的
合成场所 [1-2]。叶绿素是参与光合作用的重要色素,
其含量的显著变化会导致叶色的变化, 所以叶绿素
缺陷突变体也称为叶色突变体[3]。叶色突变的主要
特点是叶色表型变异, 其突变来源于控制叶绿素生
物合成和叶绿体发育的重要基因沉默或失活 , 直
接或间接影响叶绿素合成和降解 , 改变叶绿素含
量 [2,4-8]。近年来, 大量研究结果显示, 叶色突变体具
592 作 物 学 报 第 40卷


易于观察的突变性状, 是开展光合系统的结构和功
能、叶绿素生物合成及其调控机制研究的理想材料[9-10]。
同时, 叶色可作为标记性状应用于良种繁育和杂交
育种, 也可作为观赏稻应用于休闲观光农业[11]。
基于叶色的变化, 水稻叶色突变可分为白化、
黄化、浅绿、白翠、绿白、黄绿、绿黄、条纹等类
型。其中, 白化是植物叶色突变体的常见类型之一,
其最典型特征是叶绿体不能正常发育, 叶绿素合成
受阻。关于水稻叶色突变体的基因定位报道最早见
于 1975年[12]。随着分子标记技术的发展和广泛应用,
目前水稻中被定位的叶色基因至少有 80多个, 遍布
于除第 12 染色体外的所有染色体(http://www.gra-
mene.org/)。但迄今为止, 只有部分基因被成功克隆。
例如, 编码Mg2+螯合酶 3个亚基的 OsChlH、OsChlD
和OsChlI [8-13], 编码叶绿素酸脂 a加氧酶的OsCAO1
和OsCAO2 [14], 编码叶绿素合酶的 YGL1[15], 编码核
糖核苷酸还原酶大亚基蛋白 RNRL1 和小亚基蛋白
RNRS1的 Virescent3和 Stripe1 [16], 鸟苷酸激酶基因
Virescent2 [17], 叶绿素 b还原酶基因 NYC1 [18], 持绿
突变体基因 sgr [19], 联乙烯还原酶基因 OsDVR [20]。
最近也报道了 2 个水稻叶色相关基因 FGL [21]和
VYL [22], 分别编码原叶绿素酸脂氧化还原酶 B 和叶
绿体 Clp 亚基, 参与叶绿体的发育和叶绿素的生物
合成。
本研究利用EMS诱变恢复系缙恢10号, 从其后
代中获得一份稳定遗传的叶缘白化突变体mal (mar-
ginal albino leaf), 该突变体在整个生育期过程中 ,
叶片边缘均呈白化表型。遗传分析表明该突变体受
隐性核基因控制, 利用BSA法最终将其定位在第8染
色体 , SSR标记M22和InDel标记ID27之间 , 物理距
离为171 kb。
1 材料与方法
1.1 材料
mal 来自 EMS 诱变恢复系缙恢10号(Oryza sa-
tiva L. ssp. indica), 经过多代自交, 突变性状稳定遗
传。2011年, 用表型正常的不育系材料西农1A 与突
变体 mal 杂交, 同年在海南种植 F1, 并收获 F2种子,
于2012年在西南大学水稻研究所分别种植亲本和 F2
群体。
1.2 光合色素含量的测定
上午9:00, 在种植小区中间随机选择长势相对
一致的野生型和突变体各5个单株 , 分别测定苗期
和抽穗期的光合色素含量。称取0.01 g叶片剪碎装入
离心管, 加25 mL ﹕丙酮 无水乙醇(1 1, ∶ v/v)混合液
封口暗处理24~48 h, 其间经常摇动, 直到叶片完全变
白为止, 重复3次。参考Lichtenthaler的方法计算[23]。
1.3 农艺性状调查
在植株成熟后 , 分别选择缙恢10号和mal突变
体小区中间10株, 考查株高、有效穗、每穗粒数、
每穗实粒数、千粒重、结实率等主要农艺性状, 同
时测量各节间的长度。
1.4 光合特性和荧光动力学参数的测定
在抽穗期, 随机选取长势相对一致的单株各 5
株, 在天气晴朗的上午 8:30开始, 利用 LI-6400型便
携式光合作用测定仪测定突变体的光合特性、叶绿
素荧光动力学参数, 重复 3次, 取平均值, 以缙恢 10
号为对照。叶绿素荧光动力学参数包括初始荧光
(Fo)、PSII 光适应下的最大量子产额 Fv′/Fm′、非光
化学淬灭系数(qN)、表观光合电子传递速率(ETR)[24],
Fv′/Fm′=(Fm′−Fo′)/Fm′, qN=(Fm−Fm)/Fm, ETR=ΦPSII×
PAR×0.84×0.5。
1.5 细胞结构观察
参照何瑞峰等[25]的方法用电镜观察突变体和野
生型叶片的细胞结构。以戊二醛和锇酸双重固定后,
利用不同梯度的乙醇逐级脱水, 再置换和包埋, 制
超薄切片 , 以醋酸双氧铀和柠檬酸铅液双重染色 ,
H600型透射电镜观察并照相。
1.6 基因定位
采用 BSA[26]法定位目标基因, 即根据 F2植株表
型, 分别选取 10株正常单株和 10株突变单株, 剪取
等量叶片, 构建正常基因池和突变基因池。按 CTAB
法[27]提取亲本和基因池 DNA, 采用碱煮法提取 F2
群体 DNA[28]。参照 http://www.gramene.org/microsat/
SSR 引物序列, 根据西农 1A 和和缙恢 10 号的序列
差异比对设计 InDel 引物, 均由上海英骏技术公司
合成。PCR反应总体系为 25 μL, 包括 2.5 μL 10×PCR
buffer, 1.3 μL 25 mmol L–1 MgC12, 1.0 μL 2.5 mmol L–1
dNTPs, 16.0 μL ddH2O, 2.0 μL 10 μmol L–1 引物,
2.0 μL模板 DNA, 0.2 μL 5 U μL–1 Taq DNA聚合酶。
PCR程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 55℃
退火 30 s, 72℃复性 1 min, 35 个循环; 72℃延伸
10 min。PCR产物经 10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳, 快速银染后观察[29]。
1.7 图谱构建
F2定位群体中, 将具有西农 1A 带型的单株记为
第 4期 马 娇等: 水稻叶缘白化突变体 mal的遗传分析与基因定位 593


A, 具有 mal 突变亲本带型的单株记为 B, 具有杂合
带型的单株记为 H。根据公式[(H+2A)/2n]×100 计算
遗传距离并构建连锁图谱, 其中 H 表示定位群体中
出现杂合体带型单株的数量, A 表示出现西农 1A 正
常带型的单株数, n表示用于定位的隐性群体总株数。
2 结果与分析
2.1 叶缘白化突变体mal的表型特征和主要农艺
性状
突变体 mal 从苗期开始叶片边缘就呈现白化,
一直持续到成熟(图 1-A~E), 抽穗后, mal的 3片功能
叶的白化面积自上而下依次增大, 即剑叶白化部分
最少。与野生型相比, mal突变体植株显著变矮, 株
高仅为野生型的 76.26% (表 1), 各节间长度都显著
减小(图 1-F~G)。mal突变体叶片也明显变窄, 剑叶、
倒二叶、倒三叶的宽度分别仅为对照的 82.16%、
47.16%和 76.51% (表 2), 倒二叶和倒三叶的长度也
显著变短。此外, mal突变体的有效穗数、每穗粒数、
每穗实粒数、千粒重与对照相比均显著降低, 分别
降低了 31.58%、55.75%、26.82%和 4.10%, 而结实
率和主穗长则没有明显变化(表 1)。
2.2 光合色素
在苗期, 白化比较严重, mal突变体与野生型相
比, 叶绿素 a、叶绿素 b、总叶绿素、类胡萝卜素含

表 1 野生型(WT)与突变体(mal)的农艺性状
Table 1 Performance of agronomic traits in the wild type (WT) and mutant (mal)
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
穗长
Panicle length
(cm)
有效穗数
Effective
panicle
每穗粒数
Grain number
per panicle
每穗实粒数
Filled grain number
per panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
WT 115.32±4.24 23.76±0.75 7.60±1.58 176.30±8.14 156.60±7.14 88.83±0.69 26.54±0.11
mal 87.94±2.59** 24.47±0.99 5.20±1.03** 114.60±11.35** 102.20±11.18** 89.19±3.87 25.45±0.33**
**表示在 0.01水平上差异显著。** Significantly different at P<0.01 as determined by t-test.

图 1 野生型(WT)和突变体 mal的表型特征
Fig. 1 Plant morphology of the wild type (WT) and the mal mutant
A: 苗期野生型植株(WT); B: 苗期突变体 mal植株; C: 分蘖期野生型(WT)和突变体 mal植株; D: 分蘖期野生(WT)和突变体 mal植株
叶片; E: 成熟期野生型(WT)和突变体 mal植株; F~G: 野生型(WT)和突变体 mal植株节间。
A: plants of the wild type at the seedling stage; B: plants of the mal mutant at the seedling stage; C: plants of the wild type and the mal mutant
at the tillering stage; D: the leaves of the wild type and the mal mutant at the tillering stage; E: plants of the wild type and the mal mutant at
the maturity stage; F–G: internode length of wide type and the mal mutant.

594 作 物 学 报 第 40卷


量均极显著降低。抽穗期, 由于 mal 三片功能叶自
上而下白化部分面积逐渐增多, 剑叶和倒二叶白化
部分相对较少, 因此与野生型相比, mal突变体剑叶
和倒二叶各光合色素含量无明显差异, 倒三叶白化
部分相对较多, 从而导致各光合色素含量极显著降
低。与野生型相比, mal突变体倒二叶边缘、倒三叶
边缘各光合色素含量均极显著降低 , 而倒二叶中
部、倒三叶中部无显著差异(图 2)。

表 2 野生型(WT)与突变体(mal)的叶片形态分析
Table 2 Leaf phenotypic traits in the wild type (WT) and mutant (mal)
材料
Material
剑叶长
Length of
flag leaf
剑叶宽
Width of
flag leaf
倒二叶长
Length of the second
leaf form top
倒二叶宽
Width of the second
leaf form top
倒三叶长
Length of the third
leaf form top
倒三叶宽
Width of the third
leaf form top
WT 38.44±2.24 2.13±0.13 51.95±4.51 1.76±0.26 52.25±1.61 1.32±0.06
mal 36.06±3.68 1.75±0.05** 46.64±3.55** 0.83±0.08** 48.47±1.47** 1.01±0.14**
**表示在 0.01水平上差异显著。** Significantly different at P<0.01 as determined by t-test.

图 2 野生型(WT)和 mal突变体各时期光合色素含量
Fig. 2 Photosynthetic pigments contents of wild type (WT) and mal mutant at different stages
A: 苗期野生型(WT)和突变体 mal叶片光合色素含量; B~D: 抽穗期野生型(WT)和突变体 mal剑叶、倒二叶、倒三叶光合色素含量。
E~H: 抽穗期野生型(WT)和突变体 mal倒二叶边缘、倒三叶边缘、倒二叶中部、倒三叶中部叶片光合色素含量。Chl a: 叶绿素 a; Chl
b: 叶绿素 b; Total Chl: 叶绿素 a+b的总量; Car: 类胡萝卜素。**表示在 0.01水平上差异显著。
A: photosynthetic pigments contents of the mal mutant and the wild type (WT) at seedling stage; B–D: photosynthetic pigments of the flag,
second, and third leaf respectively in the mal mutant and the wild type at heading stage. E–H: photosynthetic pigments of margin of the sec-
ond and third leaf, middle green part of the second and third leaf respectively in the mal mutant and the wild type at heading stage. Chl a:
chlorophyll a; Chl b: chlorophyll b; Chl a+b: content of chlorophyll a and chlorophyll b; Car: carotenoids. ** Significantly different at
P<0.01 by t-test as determined by t-test.
第 4期 马 娇等: 水稻叶缘白化突变体 mal的遗传分析与基因定位 595


2.3 光合特性和荧光动力学参数
与野生型相比, 突变体 mal的初始荧光(Fo)、表
观光合电子传递速率(ETR)没有差异 , 光适应下的
最大量子产额 Fv′/Fm′、非光化学猝灭效率(qN)均极
显著高于野生型(表 3), 表明突变体 PSII反应中心光
能转换效率和原初光能捕获效率较高, 但是其天线
色素吸收的光能大部分以热形式散失导致其光能利
用率较低。
光合特性比较表明, 突变体 mal 的净光合速率
(Pn)、气孔导度(Gs)极显著低于野生型 , 而细胞间
CO2浓度(Ci)极显著高于野生型, 蒸腾速率与野生型
无差异(表 4)。mal光合色素均极显著降低可能导致
净光合速率降低, 引起光合作用原料 CO2和 H2O 积
累, 从而最终导致细胞间 CO2浓度升高。
2.4 mal叶肉细胞及叶绿体的超微结构观察
野生型和 mal 突变体叶片绿色部分叶肉细胞发
育完全, 细胞器均匀分布, 叶绿体规则地贴壁分布,
完整地被膜包裹, 基质浓厚, 基质片层有序排列(图
3-A1, B1, A1-1, B1-1)。而 mal突变体叶片白色部分
的叶肉细胞发育严重不良, 大部分中空, 无明显完
整的细胞器, 叶绿体内部基本完全降解(图3-B2)。说
明 MAL基因突变后, 叶片绿色部分的叶肉细胞发育
及其叶绿体的结构并未被影响, 而白色部分叶肉细
胞及叶绿体发育受到严重抑制。

表 3 野生型(WT)与突变体(mal)叶片的叶绿素荧光动力学参数
Table 3 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of the wild type (WT) and the mutant (mal)
材料
Material
初始荧光
Fo
光适应下的最大量子产额
Fv′/Fm′
非光化学猝灭系数
qN
表观光合电子传递速率
ETR
WT 84.3874±33.1597 0.4471±0.0203 1.8102±0.0668 106.4993±16.4112
mal 90.9413±23.2492 0.6293±0.0041** 2.6979±0.0303** 104.4789±3.3436
**表示在 0.01水平上差异显著。**Significantly different at P<0.01 as determined by t-test.

表 4 野生型(WT)与突变体(mal)叶片的光合特性
Table 4 Photosynthetic characteristics of the wild type (WT) and the mutant (mal)
材料
Material
净光合速率
Pn (μmol CO2 m–2 s–1)
气孔导度
Gs (mol H2O m–2 s–1)
胞间 CO2浓度
Ci (μmol CO2 mol–1)
蒸腾速率
Tr (mol H2O m–2 s–1)
WT 15.8490±1.3838 0.9201±0.0753 322.0117±7.8655 5.2743±0.3643
mal 6.7223±1.3547** 0.5133±0.1045** 343.3250±2.6335** 5.7242±0.6497
**表示在 0.01水平上差异显著。**Significantly different at P<0.01 as determined by t-test.

图 3 野生型(WT)和突变体 mal的叶肉细胞及叶绿体的超微结构观察
Fig. 3 Ultrastructures of chloroplasts in the mesophyll cells of the wild-type (WT) and mal mutant
A: 野生型叶片; B: mal突变体叶片; A1: 野生型叶肉细胞结构; B1: mal叶片绿色部分叶肉细胞结构; A1-1: 野生型叶绿体结构;
B1-1: mal叶片绿色部分的叶绿体结构; B2: mal叶片白色部分的叶肉细胞结构。
A: leaf of wild-type; B: Leaf of mal; A1: structure of wild-type mesophyll cell; B1: mesophyll cell structure in green sectors of mal leaves;
A1-1: chloroplast structure in wild-type; B1-1: chloroplast structure in green sectors of mal leaves;
B2: mesophyll cell structure in white sectors of mal leaves.
596 作 物 学 报 第 40卷


2.5 MAL基因的遗传学分析
用表型正常的不育系西农 1A与 mal杂交, F1表
型正常, 说明该突变体受隐性基因控制。F2 代群体
中出现明显的分离, 分别表现双亲性状, 其中正常
单株 4100株, mal突变单株 1325株。经卡方测验, 正
常株∶突变株符合 3 1∶ 分离比(χ2=0.69<χ20.05=3.84),
表明 mal突变体受隐性单基因控制。
2.6 MAL基因的分子定位
选用西农 1A×mal杂交的 F2群体作为定位群体,
共获得 1325个突变单株, 用于基因定位。在 F2代群
体中分别选取 10 株正常株和 10 株突变株构建正常
基因池和突变基因池。选用 400个均匀分布于 12条
染色体上的 SSR 标记对亲本西农 1A 和 mal 进行多
态性分析, 进一步利用在两亲本间表现出多态性的
引物, 扩增正常基因池和突变基因池, 并用在基因
池间检测到的多态性引物对 F2代定位群体中随机选
取出的 380株突变单株进行单株验证, 结果位于第 8
染色体的 SSR 标记 RM1376、RM310、RM6429 和
RM7027 与 mal 突变位点表现连锁, 分别有 33 个交
换株、17 个交换株、40个交换株及53个交换株 ,
RM1376交换株包含 RM310交换株, RM7027交换
株包含 RM6429交换株, 且 RM1376、RM310交换
株与 RM6429、RM7027 交换株互不重叠, 因此将
MAL 基因定位在标记 RM310 与 RM6429 之间。在
两标记间进一步设计了 4对 SSR引物和 30对 InDel
引物, 其中 M22和 ID27在两亲本间表现出多态性,
分别有 3 个和 10 个交换株, 且互不重叠, 最终将
MAL定位在 SSR标记M22和 InDel标记 ID27之间,
遗传距离分别为 0.22 cM 和 0.73 cM, 物理距离为
171 kb (图 4)。该区间共有预测基因 33个, 其中有
7个 F-box结构域蛋白, 6个假定蛋白, 3个表达蛋白,
3 个逆转录转座子蛋白, 1 个生长素输出载体, 1 个
三角状五肽, 1个水合酶蛋白, 1个淀粉合成酶 III, 1
个磷酸核糖甘氨酸连接酶, 1个自噬相关蛋白, 1个
乙二醛酶家族蛋白, 1个 tRNA合成酶, 1个聚异戊
二烯合成酶, 1个溴区包含蛋白, 1个赤霉素敏感基
因 gar 2, 1个 YL1类蛋白, 1个抗病蛋白, 1个突触
后蛋白 CRIPT。

图 4 MAL基因在第 8染色体上连锁图谱
Fig. 4 Linkage map of MAL on chromosome 8 of rice

表 5 第 8染色体上的 4个连锁标记
Table 5 Four polymorphic markers used in the fine mapping on chromosome 8 of rice
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
R1 TTTGTCAACCAAGCTCCACA GTTTGGTAATAAAGGTCGTAGTGTC
M22 GTAGAGATCCTTACACTTAGCGCA ACTCCTCACCGCCTCTCTCT
ID27 TTTAGTTCTGTTGACCGATCAA TCAAACATCACCTGAGTACGTTT
ID7 AGCGCGAAGCCGTTCT GGGAGGAGGAGAAGAACTCAC

3 讨论
国内外针对自然突变或诱变的水稻叶绿素合成
缺陷突变体, 从叶绿素含量与组成、光合能力、叶
绿素荧光特性、叶绿体前体物质、叶绿体超微结构、
类囊体膜蛋白、突变性状的遗传、突变基因的定位
第 4期 马 娇等: 水稻叶缘白化突变体 mal的遗传分析与基因定位 597


以及突变机理等方面进行了大量的研究, 但研究结
果往往不尽相同[15,30-33]。据不完全统计, 目前报道的
水稻叶色突变相关基因已经超过80个, 其中部分基
因已进行了染色体定位, 在被定位的基因中只有少
数基因被克隆。在各种叶色变异中, 白化突变体较
容易发生, 其叶绿体发育往往受阻, 不能进行有效
的光合作用, 直至死亡。近年来对白化突变体及其控
制基因的研究取得了很大进展。日本学者Iwata等[34]
早在1975年就报道了11份白化突变体, 分别命名为
al1-al11。通过三体法 , 将al1定位在第6染色体上 ,
al2、al3及al6在第5染色体上, al5和al7在第4染色体
上, al4和al8在第1染色体上, al10在第3染色体上。随
着分子标记技术的发展, 人们开展了一系列基因分
子图谱定位研究 , 程世超等 [35]将白化致死突变体
abl4定位在第4染色体上, 余庆波等[36]将白化突变体
alb21定位在第3染色体上。目前定位在第8染色体上
的叶色突变体有失绿突变体chl8和chl9[37], 表现为
整个生育期叶片均呈黄绿色; 白化转绿突变体v8[38],
苗期叶片几乎完全白化, 移栽后转白绿色, 中脉和
长出的穗子也出现白斑纹; 斑马叶突变体z4[38], 苗
期叶片出现白色或黄色斑马纹, 呈不规则黄带; 温
度钝感型淡绿叶突变体pgl2[39], 从移栽到抽穗期 ,
叶片呈苍白的绿色, 半矮化, 分蘖少, 生育期延迟;
返绿突变体al12[40], 在24℃以下三叶期之前呈白化,
三叶期后返绿。mal的定位区间为171 kb, 与这些定
位在第8染色体上的叶色突变基因不在同一区间。另
外 , 通常情况下 , 大部分白化苗缺乏叶绿素 , 不能
正常进行光合作用, 幼苗依靠种子中的胚乳营养而
生长, 当胚乳耗尽时植株就会死亡, 表现出苗期致
死效应[41]。而还有一些白化相关突变体的突变性状
只在苗期表达, 后期可以恢复正常, 光合色素含量
的变化和叶色变化相一致, 因而其突变对主要农艺
性状无显著影响[42]。本文报道的mal突变体整个生育
期都边缘白化, 绿色部分叶绿素含量与野生型一致,
白化部分叶绿素含量显著低于野生型, 叶片绿色部
分细胞结构完整, 叶绿体发育完全, 但其白化部分
细胞中空, 叶绿体内部几乎完全降解, 叶肉细胞及
其叶绿体发育严重受阻 , 最终导致植株生长缓慢 ,
植株变矮, 有效穗数、每穗粒数、每穗实粒数、千
粒重等农艺性状显著降低。因此, 不管是表型分析
结果还是基因定位结果均表明mal是一个新的叶色
突变体。
目前已分离的与叶片白化相关的基因较少。白
化转绿基因GRA(t)[43]定位在第2染色体上 , 通过精
细定位和基因测序, 发现该基因编码叶绿体蛋白合
成延伸因子Tu。低温失绿基因CISC(t)[44]定位在第9
染色体, 编码一个具有三角状五肽重复区(PPR)蛋白,
突变体在该基因的第60位碱基处缺失了8个碱基 ,
造成移码突变而失去正常功能。V2属于核基因, 编
码鸟苷酸激酶, 催化质体和线粒体内鸟苷酸代谢途
径中GMP转化为GDP, 基因突变后叶绿体早期发育
受阻。virescent 2是温敏型突变体, 在20℃条件下,
叶片呈现出病态白化; 在30℃条件下, 叶片几乎恢
复正常 [17]。V3编码核糖核苷酸还原酶的大亚基
RNRL1, 在virescent 3突变体中, 幼苗期的第1~3叶
呈正常绿色, 之后生长的叶片几乎完全白化, 抽穗
后叶片转为正常绿色, 同时, 该突变体白化表型受
温度影响明显 [16]。mal突变体被定位在第8染色体
M22和ID27标记之间, 物理距离为171 kb。在该定位
区间内, 共有33个候选基因, 并未发现已知的叶色
基因存在。我们也对其中可能参与植物生长和叶色
变化的三角状五肽基因和生长素基因测序, 发现这
两个基因的编码框和启动子在序列上并未发生改变,
推测mal白化表型可能是由其他基因突变所致。因此,
mal属于一个新的水稻叶色突变体 , 可能受一新基
因调控, 该基因的克隆将为水稻叶色机理研究奠定
基础 , 同时mal突变体也可作为作物遗传育种的优
良种质资源。
4 结论
mal 突变体在整个生育期叶片均呈边缘白化 ,
光合色素含量和净光合速率显著降低 , 叶片变窄 ,
株高、有效穗数、每穗粒数、每穗实粒数与千粒重
极显著降低。mal 突变体叶片绿色部分细胞及其叶
绿体发育完全, 而白化部分细胞结构严重缺陷, 叶
绿体结构降解。该突变性状受 1对隐性核基因控制,
该基因被定位在第 8染色体 SSR标记 M22和 InDel
标记 ID27之间, 遗传距离分别为 0.22 cM和 0.73 cM,
物理距离为 171 kb, 是一个新的叶色突变基因。
References
[1] Klimyuk V I, Persello-Cartieaux F, Havaux M, Contard-David P,
Schuenemann D, Meiherhoff K, Gouet P, Jones J D G, Hoff-
manc N E, Laurent Nussaume. A chromodomain protein en-
coded by the Arabidopsis CAO gene is a plant-specific compo-
nent of the chloroplast signal recognition particle pathway that
is involved in LHCP targeting. Plant Cell, 1999, 1: 87–99
[2] Chen G, Bi Y R, Li N. EGY1 encodes a membrane-associated
598 作 物 学 报 第 40卷


and ATP-independent metalloprotease that is required for
chloroplast development. Plant J, 2005, 41: 364–375
[3] Chen T, Zhang Y, Zhao L, Zhu Z, Lin J, Zhang S B, Wang C L.
Physiological character and gene mapping in a new green-
revertible albino mutant in rice. Genet Genomics, 2007, 34:
331–338
[4] Motohashi R, Ito T, Kobayashi M, Taji T, Nagata N, Asami T,
Yoshida S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Functional
analysis of the 37 kDa inner envelope membrane polypeptide in
chloroplast biogenesis using a Ds-tagged Arabidopsis pale
green mutant. Plant J, 2003, 34: 719–731
[5] Sugimoto H, Kusumi K, Tozawa Y, Yazaki J, Kishimoto N,
Kikuchi S, Iba K. The virescent-2 mutation inhibits translation
of plastid transcripts for the plastid genetic system at an early
stage of chloroplast differentiation. Plant Cell Physiol, 2004, 45:
958–996
[6] Ihnatowicz A, Pesaresi P, Varotto C, Richly E, Schneider A,
Jahns P, Salamini F, Leister D. Mutants for photosystem I sub-
unit D of Arabidopsis thaliana: effects on photosynthesis, pho-
tosystem I stability and expression of nuclear genes for chloro-
plast functions. Plant J, 2004, 37: 839–852
[7] Nagata N, Tanaka R, Satoh S, Tanaka A. Identification of a vi-
nyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis
thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus
species. Plant Cell, 2005, 17: 233–240
[8] Jung K H, Hur J, Ryu C H, Choi Y. Characterization of a rice
chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system.
Plant Cell Physiol, 2003, 44: 463–472
[9] Larkin R M, Alonso J M, Ecker J R, Chory J. GUN4, a regula-
tor of chlorophyll synthesis and intracellular signaling. Science,
2003, 299: 902–906
[10] 董凤高, 朱旭东, 熊振民, 程式华, 孙宗修, 闵绍楷. 以淡绿
叶为标记的籼型一温敏核不育系 M2S 的选育. 中国水稻科
学, 1995, 9: 65–70
Dong F G, Zhu X D, Xiong Z M, Cheng S H, Sun Z X, Min S K.
Breeding of a photo-thermoperiod sensitive genic male sterile
indica rice with a pale-green-leaf marker. Chin J Rice Sci, 1995,
9: 65–70 (in Chinese with English abstract)
[11] 吴自明, 张欣, 万建民. 水稻黄绿叶基因的克隆及应用. 生
命科学, 2007, 12: 614–615
Wu Z M, Zhang X, Wan J M. Cloning and application of yel-
low-green leaf genes in rice. Chin Bull Life Sci, 2007, 12:
614–615 (in Chinese)
[12] Iwata N, Omura T. Studies on the trisomics in rice plants
(Oryza sativa L.): III. Relation between trisomics and genetic
linkage groups. Jpn J Breed, 1975, 25: 363–368
[13] Zhang H, Li J J, Yoo J H, Yoo S C, Cho S H, Koh H J, Seo H S,
Paek N C. Rice Chlorina-1 and Chlorina-9 encode ChlD and
ChlI subunits of Mg-chelatase, a key enzyme for chlorophyll
synthesis and chloroplast development. Plant Mol Biol, 2006,
62: 325–337
[14] Lee S, Kim J H, Yoo E S, Lee C H, Hirochika H, An G.
Differential regulation of chlorophyll a oxygenase genes in rice.
Plant Mol Biol, 2005, 57: 805–818
[15] Wu Z M, Zhang X, He B, Diao L P, Sheng S L, Wang J L, Guo
X P, Su N, Wang L F, Jiang L, Wang C M, Zhai F Q, Wan J M.
A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyl-
lide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol,
2007, 145: 29–40
[16] Yoo S C, Cho S H, Sugimoto H, Li J, Kusumi K, Koh H J, Koh
I, Paek N C. Rice virescent3 and stripe1 encoding the large and
small subunits of ribonucleotide reductase are required for
chloroplast biogenesis during early leaf development. Plant
Physiol, 2009, 150: 388–401
[17] Sugimoto H, Kusumi K, Noguchi K, Yano M, Yoshimura A, Iba
K. The rice nuclear gene, VIRESCENT 2, is essential for
chloroplast development and encodes a novel type of guanylate
kinase targeted to plastids and mitochondria. Plant J, 2007, 52:
512–527
[18] Kusaba M, Ito H, Morita R, Iida S, Sato Y, Fujimoto M, Kawa-
saki S, Tanaka R, Hirochika H, Nishimura M, Tanaka A. Rice
NON-YELLOW COLORING1 is involved in light-harvesting
complex II and grana degradation during leaf senescence. Plant
Cell, 2007, 19: 1362–1375
[19] Park S Y, Yu J W, Park J S, Li J, Yoo S C, Lee N Y, Lee S K,
Jeong S W, Seo H S, Koh H J, Jeon J S, Park Y I, Paek N C.
The senescence-induced stay-green protein regulates chloro-
phyll degradation. Plant Cell, 2007, 19: 1649–1664
[20] Wang P R, Gao J X, Wan C M, Zhang F T, Xu Z J, Huang X Q,
Sun X Q, Deng X J. Divinyl chlorophyll(ide) α can be con-
verted to monovinyl chlorophyll(ide) α by a divinyl reductase
in rice. Plant Physiol, 2010, 153: 994–1003
[21] Sakuraba Y, Rahman M L, Cho S H, Kim Y S, Koh H J, Yoo S
C, Paek N C. The rice faded green leaf locus encodes pro-
tochlorophyllide oxidoreductase B and is essential for chloro-
phyll synthesis under high light conditions. Plant J, 2013, 74:
122–133
[22] Dong H, Fei G L, Wu C Y, Wu F Q, Sun Y Y, Chen M J, Ren Y
L, Zhou K N, Cheng Z J, Wang J L, Jiang L, Zhang X, Guo X P,
Lei C L, Su N, Wang H Y, Wan J M. A rice virescent-yellow leaf
mutant reveals new insights into the role and assembly of
plastid caseinolytic protease in higher plants. Plant Physiol,
2013, 162: 1867–1880
[23] Lichtenthaler H K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of
photosynthetic biomembranes. Method Enzymol, 1987, 48:
350−382
[24] 张守仁. 叶绿素荧光动力学参数的意义及讨论. 植物学通报,
1999, 16: 444–448
Zhang S R. A discussion on chlorophyll fluorescence kinetics
parameters and their significance. Chin Bull Bot, 1999, 16:
444–448 (in Chinese with English abstract)
[25] 何瑞峰, 丁毅, 余金洪, 祖明生. 水稻温敏叶绿素突变体叶
片超微结构的研究. 武汉植物学研究, 2001, 19: 1–5
He R F, Ding Y, Yu J H, Zu M S. Study on leaf ultrastructure of
the thermo-sensitive chlorophyll deficient mutant in rice. J
Wuhan Bot Res, 2001, 19: 1–5 (in Chinese with English ab-
stract)
[26] Michelmore R W, Paran I, Kesseli R V. Identification of mark-
ers linked to disease-resistance genes by bulked segregant
analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic
regions by using segregating populations. Proc Natl Acad Sci
USA, 1991, 88: 9828–9832
第 4期 马 娇等: 水稻叶缘白化突变体 mal的遗传分析与基因定位 599


[27] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA. Nucl Acids Res, 1980, 8: 4321–4325
[28] 桑贤春, 何光华, 张毅, 杨正林, 裴炎. 水稻 PCR 扩增模板
的快速制备. 遗传, 2003, 25: 705–707
Sang X C, He G H, Zhang Y, Yang Z L, Pei Y. The simple gain
of templates of rice genomes DNA for PCR. Hereditas (Bei-
jing), 2003, 25: 705–707 (in Chinese with English abstract)
[29] Panaud O, Chen X, McCouch S R. Development of microsatel-
lite markers and characterization of simple sequence length
polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.). Mol Gen Genet,
1996, 252: 597–607
[30] 徐培洲, 李云, 袁澍, 张红宇, 彭海, 林宏辉, 汪旭东, 吴先
军．叶绿素缺乏水稻突变体中光系统蛋白和叶绿素合成特性
的研究. 中国农业科学, 2006, 39: 299–305
Xu P Z, Li Y, Yuan S, Zhang H Y, Peng H, Lin H H, Wang X D,
Wu X J. Studies of photosystem complexes and chlorophyll
synthesis in chlorophyll-deficient rice mutant W1. Sci Agric Sin,
2006, 39: 299–305 (in Chinese with English abstract)
[31] Zhao Y, Di L F, Yang S H, Li S C, Zang Y Z. Chloroplast
composition and structural differences in a chlorophyll reduced
mutant of oilseed rape seedlings. Acta Bot Sin, 2001, 43:
877–880
[32] Huang X Q, Wang P R, Zhao H X, Deng X J. Genetic analysis
and molecular mapping of a novel chlorophyll deficit mutant
gene in rice. Rice Sci, 2008, 15: 7–12
[33] Liu W Z, Fu Y P, Hu G C, Si H M, Zhu L, Wu C, Sun Z X.
Identification and fine mapping of a thermo sensitive chloro-
phyll deficient mutant in rice (Oryza sativa L.). Planta, 2007,
226: 785–795
[34] Iwata N, Satoh H, Omura T. Linkage analysis by use of trisom-
ics in rice (Oryza sativa L.): IV. Linkage groups locating on
chromosomes 2 and 10. Jpn J Breed, 1981, 31: 66–67
[35] 程世超, 刘合芹, 翟国伟, 冯世座, 赵辉, 汪得凯, 陶跃之.
水稻白化致死突变体 abl4 的鉴定和基因定位. 中国水稻科
学, 2013, 27: 240–246
Cheng S C, Liu H Q, Zhai G W, Feng S Z, Zhao H, Wang D K,
Tao Y Z. Genetic analysis and gene mapping of an albino lethal
mutant in rice. Chin J Rice Sci, 2013, 27: 240–246 (in Chinese
with English abstract)
[36] 余庆波, 江华, 米华玲, 周根余, 杨仲南. 水稻白化突变体
alb21生理特性和基因定位. 上海师范大学学报, 2005, 34(1):
70–75
Yu Q B, Jiang H, Mi H L, Zhou G Y, Yang Z N. Physiological
property and gene mapping of an albino mutant alb21 in rice. J
Shanghai Norm Univ, 2005, 34(1): 70–75 (in Chinese)
[37] 李育红, 王宝和, 戴正元, 李爱宏, 赵步洪, 左示敏, 陈忠祥,
张洪熙, 潘学彪. 水稻叶色突变体及其基因定位、克隆的研
究进展. 江苏农业科学, 2011, 39(2): 34–39
Li Y H, Wang B H, Dai Z Y, Li A H, Zhao B H, Zuo S M, Chen
Z X, Zhang H X, Pan X B. The research advances of gene
mapping and cloning of leaf color mutants in rice. Jiangsu
Agric Sci, 2011, 39(2): 34–39 (in Chinese)
[38] Parks B M, Quail P H. Phytochrome-deficient hyl and hy2 long
hypocotyls mutants of Arabidopsis are defective in phyto-
chrome chromophore biosynthesis. Plant Cell, 1991:
1177–1186
[39] 朱丽, 刘文真, 吴超, 栾维江, 傅亚萍, 胡国成, 斯华敏, 孙
宗修. 水稻着丝粒附近一个淡绿叶突变相关基因的定位分析.
中国水稻科学, 2007, 21: 228–234
Zhu L, Liu W Z, Wu C, Luan W J, Fu Y P, Hu G C, Si H M,
Sun Z X. Identification and fine mapping of a gene related to
pale green leaf near centromere region in rice (Oryza sativa L.).
Chin J Rice Sci, 2007, 21: 228–234 (in Chinese with English
abstract)
[40] Xia J C, Wang Y P, Ma B T, Yin Z Q, Hao M, Kong D W, Li S G.
Ultrastructure and gene mapping of the albino mutant al12 in
rice (Oryza sativa L.). Acta Genet Sin, 2006, 33: 1112–1119
[41] Siddappa K, Vasudev K L, Ganiger B S, Rathod R, Devar K V.
Report of albino seedlings in Pongamia pinnata. Karnataka J
Agric Sci, 2004, 17: 884–885
[42] Chen T, Zhang Y D, Zhao L, Zhu Z, Lin J, Zhang S B, Wang C
L. Physiological character and gene mapping in a new
green-revertible albino mutant in rice. J Genet Genomics, 2007,
34: 331–338
[43] Chen T, Zhang Y D, Zhao L, Zhu Z, Lin J, Zhang S B, Wang C
L. Fine mapping and candidate gene analysis of a green-
revertible albino gene gra(t) in rice. J Genet Genomics, 2009,
36: 117–123
[44] Lan T, Wang B, Ling Q P, Xu C H, Tong Z J, Liang K J, Duan Y
L, Jin J, Wu W R. Fine mapping of cisc(t), a gene for
cold-induced seedling chlorosis, and identification of its candi-
date in rice. Chin Sci Bull, 2010, 55: 3149–3153